Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Положение конъюгиругощих водорослей в системе растительных организмов и их филогенетические связи . 12
1.1. Принципы классификации и возможные пути эволюции Zygnemato-phyceae 23
1.2. Таксономический состав класса 37
Глава 2. Объекты и методы исследования 42
2.1. Источники культур водорослей . 42
2.2. Выделение, амплифицирование и секвенирование ДНК 42
2.3. Выравнивание последовательностей и построение филогенетических деревьев 44
2.4. Совместный анализ генов 46
2.5. Создание и проверка альтернативных топологий 46
2.6. Поиск молекулярных синапоморфий 47
Глава 3. Результаты филогенетических анализов нуклеотидных последовательностей 48
3.1. Наличие 1506 интрона I группы в кодирующем регионе 18S рДНК конъюгат 49
3.2. Анализ 18S рДНК 103 таксонов Streptophyta и Chlorophyta 49
3.3. Анализ 18S рДНК 41 вида Streptophyta 54
3.4. Анализ филогенетических взаимоотношений в сем. Desmidiaceae..59
3.5. Положение рода Spirotaenia среди стрептофитных водорослей 63
3.5.1. Сравнение кодирующих регионов 18S рДНК Streptophyta...63
3.5.2. Анализ последовательностей rbcL 66
Глава 4. Сравнение результатов индивидуальных и комбинированных анализов последовательностей 18S рДНК и rbcL в классе Zygnematophyceae ...72
4.1. Выбор анализированных видов 75
4.2. 188рДНК филогения 75
4.3. RbcL филогения 78
4.4. Особенности индивидуальных наборов данных и их анализов 81
4.4. Комбинированный анализ генов (18S рДНК+ricL) 84
4.5. Комбинированный анализ и проблема длинных ветвей 88
4.6. Тестирование альтернативных топологий; 91
4.7. Бейесова филогения 93
4^8. Анализ молекулярных синапоморфий. 94
4.8.1. Синапоморфные признаки в 18S рРНК представителей г Zygnematophyceae. 95
4.8.2. Синапоморфий в renerbcL 98
Глава 5. Филогенетическая структура класса Zygnematophyceae ; 10СИ
5.1. Монофилии класса в связи с положением рода Spirotaenia 100
5.2.Порядок Zygnematales. 106
5.2Л. Роды Netrium uRoya. 115
5:3. Порядок Desmidiales 118
5.3Л. Семейство Gonatozygaceae. 120
5.3.2. Семейство Closteriaceae. ...123
5.3.3. Семейство Peniaceae. 127
5.3.4. Семейство Desmidiaceae. 132
5.3.5. Филогенетический статус некоторых родов десмидиевых...137
Глава 6. Концепции родов Staurastrum, StaurodesmuswCosmarium 146
6.1. Выбор анализированных видов 146
6.2. Первичная и вторичная структуры 1506 интрона I группы. 147
6.3. Первичная и вторичная структуры ITS 1 149
6.4. Первичная и вторичная структуры ITS2. 154
6.5. Филогенетический анализ последовательностей 18S рДНК. 158
6.6. Анализ некодирующих участков рибосомального оперона. 162
6.7. Комбинированный анализ кодирующих и некодирующих последовательностей рДНК. 164
6.8. Филогенетическая структура рода Staurastrum 167
6.9. Полифилия родов Staurodesmus и Cosmarium 171
6.10. Утилитарность некодирующих участков оперона рДНК для целей филогении в сем, Desmidiaceae 175
Заключение 179
Выводы 181
Список литературы. 183
Приложение 209
- Принципы классификации и возможные пути эволюции Zygnemato-phyceae
- Выделение, амплифицирование и секвенирование ДНК
- Наличие 1506 интрона I группы в кодирующем регионе 18S рДНК конъюгат
- Особенности индивидуальных наборов данных и их анализов
Введение к работе
Зеленые конъюгирующие водоросли являются неотъемлемым компонентом всех пресноводных экосистем и играют существенную роль в трофических цепях водоемов. Эта группа растительных организмов, объединяющая кокко-идные, нитчатые и колониальные водоросли, характеризуется особым типом полового размножения - конъюгацией, при котором происходит слияние не имеющих жгутиков гамет. Отсутствие не только жгутиковых стадий, но и любых следов жгутикового аппарата на протяжении всего жизненного цикла - еще одна отличительная черта представителей группы. Эти признаки не имеют аналогов среди других автотрофных организмов, что обусловливает обособленное положение конъюгат среди растений.
До сих пор не существует удовлетворительного объяснения того, почему и каким образом произошла утрата жгутикового аппарата и возникла конъюгация как способ полового размножения. При этом обсуждаются две гипотезы - происхождение конъюгат в результате редукции подвижных стадий (Голлербах, Полянский, 1951; Скабичевский, 1960; Fott, 1959; Fritsch, 1944; Nakahara, ichi-mura, 1992; Pascher, 1914) или от организмов, никогда их не имевших (Топа-чевський, 1952; 1954).
Несмотря на уникальность фенотипических признаков, принадлежность конъюгат к зеленым водорослям никогда серьезно не оспаривалась, и большинство исследователей рассматривали эту группу в ранге порядка или класса в составе Chlorophyta (Brook, 2002; Krieger, 1933-1939; Prescott et al., 1972; Ruzicka, 1977; West, 1916). По мере развития биохимических и ультраструктурных исследований стали появляться новые данные, еще более отличающие конъюгат от остальных зеленых водорослей и указывающие на их близость с морфологически сложно устроенными харовыми водорослями и наземными растениями (deJesus et al. 1989; Frederick et al. 1973; Graham et al. 1991; Mishler, Churchill 1985). На определенном этапе харовые, конъюгаты, а также некоторые другие
б группы зеленых водорослей были выделены из состава Chlorophyta и объединены в класс Charophyceae (Mattox, Stewart, 1984), включенного в отдел Strep-tophyta, куда были отнесены и наземные растения (Kendrik, Crane, 1997). В настоящее время конъюгаты рассматриваются в ранге самостоятельного класса Zygnematophyceae в составе отдела Streptophyta (Bremer, 1985; Bremer et al., 1987; van Hoeketal., 1995).
Класс Zygnematophyceae характеризуется исключительным видовым разнообразием, и это позволяет предположить, что утрата жгутикового аппарата способствовала процессу видообразования в нем. Следует отметить, что сведения о числе видов конъюгат различаются на порядок. Одни авторы (Hoshaw et al, 1990) сообщают о 10000-15000 видах, в то время как другие (Cranwell et al., 1990) приводят 1500 видов. Такой разброс данных относится только к одному из двух порядков класса-Desmidiales, в то время как объем Zygnematales споров не вызывает. Наиболее реалистичной на наш взгляд выглядит оценка Gerrath (1993) и Hoshaw, McCourt (1988), указывавших около 4000 валидно описанных видов зигнематофициевых водорослей.
Существует несколько классификационных схем Zygnematophyceae, которые выделяют в составе класса от двух до четырех порядков. В настоящее время общепринятой считается классификация Mix (1972), основанная на признаках ультраструктуры клеточной стенки и признающая в составе конъюгат два порядка: Zygnematales с двумя семействами, и Desmidiales - с четырьмя. Данная система носит явно выраженный эволюционный характер как на уровне порядков, так и на уровне семейств, однако не все ее положения можно считать бесспорными.
Все семейства, а также большая часть более чем 50 родов конъюгат были описаны более 100 лет назад, и с тех пор их концепция практически не претерпела изменений. В то же время, едва ли не с момента описания многие роды считались искусственными, и предпринимались многочисленные попытки преодолеть эту искусственность путем разделения их на более мелкие, морфологически однородные группы таксонов. Наиболее проблемными в этом отношении
считаются роды Cosmarium и Stanrmtrum, на долю которых приходится около 50% видового разнообразия класса. Исключительная вариабельность небольшого числа морфологических признаков в пределах каждого рода зачастую не позволяет провести четкую границу между ними и препятствует созданию более или менее естественной таксономической системы конъюгат. Эти же причины затрудняют эволюционный анализ признаков в группе.
Появление новых методов филогенетических исследований, существенно расширяющих число признаков, доступных для сравнительного анализа, позволяет с новых позиций подойти к решению давних эволюционных проблем и зачастую успешно с ними справляться. Одним из таких подходов, интенсивно развивающихся в последнее десятилетие, является метод молекулярно-филогенети-ческих исследований, основанный на сравнении нуклеотидных и аминокислотных последовательностей различных участков генома организмов. Новые массивы данных позволяют, с одной стороны, провести тестирование существующих эволюционных гипотез, а с другой, соотнести темпы и направления эволюции различных признаков в отдельно взятой группе организмов. Учитывая, что более чем 150-летняя история изучения зеленых конъюгирую-щих водорослей оставила много неразрешенных таксономических и эволюционных проблем, нами была предпринята попытка использовать для их решения комплекс имеющихся данных о морфологии, биологии, биохимии и генетике конъюгат.
Целью настоящей работы было определение филогенетической структуры класса Zygnematophyceae с помощью молекулярно-филогенетических методов и анализ его морфологической (эволюционной) дифференциации, а также выделение монофилетических комплексов, составляющих крупнейшие роды с тем, чтобы в дальнейшем разработать естественную концепцию последних и создать таксономическую систему класса, основанную на филогенетическом родстве организмов.
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
1) получить последовательности кодирующих (18S рДНК) и некодирующих
(1506 интрон I группы, внутренний транскрибируемый спейсер 1 и 2 [Internal
Transcribed Spacer, далее ITS]) участков ядерной рибосомальной ДНК и про
теин -кодирующей ДНК хлоропластов (rbcL) представительных видов класса
Zygnematophyceae,
на основе молекулярно-филогенетических анализов нуклеотидных последовательностей построить филогенетическое древо конъюгат,
сравнить полученные результаты с существующими филогенетическими и таксономическими схемами, основанными на фенотип и чески х признаках,
провести сравнительный анализ филогении, полученных с использованием различных молекулярных маркеров.
Основные положения, выносимые на зашиту:
1. Класс Zygnematophyceae является монофилетической группой в составе
стрептофитных зеленых водорослей и хорошо отграничен от них как фено-
типическими (отсутствие жгутиков, половой процесс в виде конъюгации),
так и генетическими синапоморфиями (уникальные замены в транскрипте
1SS рРНК).
Род Spirotaenia является первой (базовой) дивергенцией в классе, и его представители предположительно сохраняют плезиоморфное состояние нескольких признаков (особенности процесса конъюгации, отсутствие 1506 интрона I группы в 188рДНК).
Порядок Zygnematales, выделяемый на основе плезиоморфоного состояния признака (простая не сегментированная клеточная стенка без пор), является парафилетическим и его таксономическая структура требует пересмотра с учетом генетических и фенотипических признаков.
Своеобразное сочетание признаков ультраструктуры клеточной стенки и особенности положения на филогенетическом древе рода Phymatodocis указывают на необходимость выделения его в новое семейство в составе порядка Desmidiales.
5. Большинство исследованных родов конъюгат является немонофилетически-ми и их концепции нуждаются в ревизии.
Научная новизна, теоретическое и практическое значение работы. На
основе молекулярно-филогенетических анализов установлены эволюционные связи между представителями класса Zygnematophyceae. Показано, что морфологические признаки, используемые для целей классификации в классе (особенности ультраструктуры клеточной стенки, тип организации таллома, особенности морфологии клетки и др.), не всегда адекватно отражают родство таксонов, а общепринятая система конъюгат требует пересмотра.
Обнаружена ранняя дивергенция рода Spirotaenia от основного ствола класса. Высказано предположение, что этот род должен быть выделен в новый подкласс в составе Zygnematophyceae.
Разработана оригинальная методика поиска молекулярных синапоморфий, с ее помощью обнаружены новые признаки, характеризующие как весь класс Zygnematophyceae, так и его отдельные клады.
Впервые проведено сравнительное изучение эволюционной динамики двух генов (ядерного 18S рДНК и хлоропластного rbcL) из разных геномов клетки на примере конкретной группы организмов.
Разработаны модели вторичной структуры транскриптов ITS1 и ITS2 рДНК конъюгат, и на основе этих структурных данных проведен анализ филогенетических взаимоотношений между предположительно близкородственными родами десмидиевых водорослей.
Работа послужит фундаментальной основой для дальнейших исследований в области систематики и филогении отдела Streptophyta, в особенности класса Zygnematophyceae, на разных таксономических уровнях.
За время исследования была создана обширная коллекция штаммов зеленых конъюгирующих водорослей, многие из которых не представлены в мировых коллекциях.
Определены и депонированы в международные базы данных более 200 новых нуклеотидных последовательностей генов, интронов и спейсерных участков ДНК.
Апробация работы. Результаты исследований, были представлены на 2 Всероссийском совещании альгологов (С-Пб., 2002), 5-7 International Phycologi-cal Congresses, Qingdao, China (1994), Leiden, The Netherlands (1997),. Thessalo-niki, Greece (2000); IV International Symposium "Biology and taxonomy of green algae" Smolenice, Slovakia (2002), 12th Intemationar Association of Phytoplankton Taxonomy and Ecology Workshop, Winnipeg, Canada (1999), Annual Meetings of Japanese Phycological Society, Shimoda (1998), Yamagata,( 1999),. научных семинарах Botanisches Institut der Universitat zuKoln (2000-2003), Institut fur Allge-meine Botanik der Universitat Hamburg (2001), Института.биологии.внутренних вод (п. Борок, 2000; 2003) и Биолого-почвенного института ДВО РАН (2000-2005), Владивостокского Общества развития генетики (2005).
Публикации. По теме диссертации опубликовано: глава коллективной монографии, 19 статей и 7 тезисов докладов международных конференций. Основные результаты исследований опубликованы в ведущих отечественных и международных научных журналах: Ботанический журнал, Альгология; Algo-logical Studies, Hydrobioiogia, Journal of Molecular Evolution, Molecular Biology and Evolution; Phycologia.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (Глава 1), объектов и методов (Глава 2), результатов и обсуждения (Главы 3-6), заключения и выводов. Материалы диссертации изложены на 216 стр. машинописного текста и проиллюстрированы 32 рисунками и 9 таблицами. Список литературы включает 304 источника.
Место проведения работы. Работа выполнена в лаборатории низших растений БПИ ДВО РАН в рамках тем: «Изучение биоразнообразия грибов, водо-
и: рослей и мохообразных Российского Дальнего Востока» (1996-2000) и «Мико-биота и криптогамная флора Дальнего Востока России» (2001-2005).
Частично молекулярно-филогенетические исследования проводились в Национальном институте экологических исследований (г. Цукуба, Япония) и Кёльнском Университете (г. Кёльн, Германия).
Научные достижения диссертации и выводы основываются на собственных исследованиях автора, принимавшего непосредственное участие в выделении штаммов водорослей, их изучении и идентификации, планировании и постановке экспериментов и анализе данных.
Благодарности. Исследования были поддержаны грантами Научно-технического Агентства (Япония) и Фонда Гумбольта (Германия) IV-1068058 и V-RKS-1068058. Автор выражает искреннюю признательность Prof М. Melk-onian (г. Кёльн, Германия) за неоценимую помощь при выполнении исследования и обсуждение результатов.
Принципы классификации и возможные пути эволюции Zygnemato-phyceae
Традиционно конъюгирующие водоросли рассматривались,в;составе двух групп - зигнемовых и десмидиевых. Международный кодекс ботанической номенклатуры (LC.B.N., 2000) устанавливает 1838 (Meneghini) и 1848 (Ralfs) годы как официальное начало истории этих таксонов. Хотя Ralfs и отмечал сходство, полового размножения в обеих группах, тем не менее, он рассматривал их как независимые. Первым; кто объединил их в составе одного семейства, был de Вагу (1858). В большинстве последующих классификационных схем понимание этого таксона менялось мало, однако ему придавали различный ранг, до отдела включительно (Воденичаров; 1972; Hoshaw et al., 1990). Большинство ранних классификаций конъюгат были основаны, преимущественно, на морфологических признаках, хотя еще de Вагу (1858), придавая большое значение способам конъюгации и прорастания зигоспор, разделил ихна три подсемейства: Meso-carpae, Zygnemeae и Desmidieae.
Большой вклад в развитие системы Zygneraatophyceae внесли исследования строения клеточной стенки и особенностей деления десмидиевых D. Lut-kemiiller (1902). Этот автор разделил десмидиевые, принимаемые как семейство зеленых водорослей, на два подсемейства - Saccodermae (саккодермные или мешковидно-оболочковые) и Placodermae (плакодермные или слоисто-оболочковые). К саккодермным десмидиевым были отнесены виды с простой несегментированной оболочкой - трибы Spirotaenieae и Gonatozygae (гонатози-говые), а в состав плакодермных вошли виды, имеющие сегментированную многослойную оболочку и поры. В свого очередь, Placodermae подразделялись на три трибы - Penieae, Closterieae и Cosmarieae. Большинство положений этой системы были в дальнейшем подтверждены электронно-микроскопическими исследованиями, а выделенные им группы в значительной мере соответствуют признаваемым в настоящее время семействам. Весьма важным выводом, следующим из исследования Lutkemiiller, следует считать впервые отмеченное сходство тонкого строения клеточной стенки одноклеточных саккодермных десмидиевых и нитчатых зигнемовых водорослей.
Данная система стала основой для построения большинства последующих классификационных схем конъюгат. Некоторые авторы, принимая основные ее положения, дополняли их, используя особенности деления вегетативных клеток и полового процесса (Oltmanns, 1904), морфологии хлоропластов и клеток (Fritsch 1935, 1952; Teiling 1950, 1954, 1957) и формирования зигоспор (Okada, 1953).
Как правило, все перечисленные выше системы выделяли одни и те же группы организмов, но придавали им различный таксономический ранг и по-разному оценивали родство этих групп. Наибольшее количество споров вызвало систематическое положение мезотениевых и гонатозиговых водорослей. Хотя сходство строения клеточной стенки зигнемовых и мезотениевых уже было известно, большинство авторов считали последних ближе к плакодермным десмидиевым в силу общей для них одноклеточное (Krieger, 1933-1939; West, West, 1904). На иных позициях стоял Fritsch (1935, 1952), объединявший зигнемовых и мезотениевых в составе Zygnemoideae. Сюда же он отнес и гонатози-говые, рассматривая их как одно из трех семейств нитчатых зигнемовых. В системах West, West (1904) и Krieger (1933-1939) гонатозиговые водоросли классифицировались в составе семейства или порядка десмидиевых. Спорное положенив гонатозиговых объясняется слабой выраженностью признаков строения клеточной стенки, характеризующих их как истинно плакодермных десмидие-вых.
West, West (1904) разработали одну из первых филогенетических систем группы (рис. 4), в которой частично были учтены данные исследований Lutkmuller (1902). Согласно точке зрения этих авторов, нитчатые зигнемовые являются предков ой группой для плакодермных и саккодермных десмидиевых, развивавшихся по двум направлениям. Непосредственно от зигнемовых за счет усложнения строения клеточной стенки происходят гонатозиговые водоросли, а параллельно им, путем распадения нитчатых форм на отдельные клетки (сакко-дермная Ancylonema), развивается линия, приведшая к появлению трибы Cos-marieae (сем. Desmidiaceae в современном понимании).
В отечественной литературе получила широкое распространение система М. М. Голлербаха и В. И. Полянского (1951), выделявших в составе конъюгат (принимаемых как подотдел зеленых водорослей) четыре порядка — Zygne-matales, Mesotaeniales, Gonatozygales и Desmidiales. Эта система была использована при подготовке Флоры споровых растений СССР (Косинская, 1952, 1960), а также Определителя пресноводных водорослей СССР (Голлербах, Полянский, 1951; Паламар ь-Мордвинцева, 19826), Украины (Паламар-Мордвинцева, 1984, 1986) и в некоторых монографических обработках (Рундина, 1998; Топачев-ский, Масюк, 1984).
Электронно-микроскопические исследования 60-80 гг. прошлого столетия внесли существенный вклад в разработку таксономии конъюгат. Этот период ознаменовался серией работ М. Mix и ее учеников, детально изучивших тонкое строение клеточной стенки Zygnematophyceae и обосновавших их классификацию. Как мы уже отмечали выше, эти исследования в значительной мере подтвердили ранние наблюдения Lutkemuller (1902) и показали принципиальные различия в строении клеточной стенки между саккодермными и плакодермны-ми видами. Mix (1972) принимала конъюгат в качестве класса зеленых водорослей и разделила его на два порядка - Zygnematales и Desmidiales. К Zygne-matales она отнесла семейства Zygnemataceae с нитчатыми формами и Mesotae-niaceae (=саккодермные десмидиевые) - с одноклеточными
Выделение, амплифицирование и секвенирование ДНК
Вновь полученные" нуклеотидные последовательности и взятые; из базы: данных GenBank (см. приложение) выравнивали вручную1 в программах Olson Multiple Sequence Alignment Editing (Olsen, 1990) или: Sea View (Gal tier et al.y 1996). При выравнивании кодирующих и декодирующих участков рибосомаль-ного оперона следовали консервативным, элементам первичной и вторичной структуры ДНК (Wuyts et al., 2000, 2001). Из-за низкой консервативности первичной структуры ITS последовательностей поиск гомологичных позиций для і сравнения был невозможен без привлеченияданных о вторичной І структуре их транскрипта. Для создания его моделей был использован интерактивный сервер MFOLD 3.1 (http://w\v\v.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/old/rna/forml-2.3.cgi; Zuker, 2003), конструирующий различные варианты вторичной структуры РНК, и оптимизированный на поиск их минимальной термодинамической энергии.
Филогенетические деревья строили методами максимального правдоподобия (Maximum Likelihood, далее ML), объединения соседей (Neighborhood-Joining, далее NJ) и максимальной парсимонии (Maximum Parsimony, далее MP) в филогенетической программе PAUP 4.0ЬЇ0 (Swofford, 1998), а также методом Бейеса (Bayesian Inference, далее ВГ), используя программу MrBayes v3.0b3 (Huelsenbeck, Ronquist, 2001). Эволюционные модели для ML и NJ анализов выбирались с помощью программы Modeltest 3.04 (Posada, Crandall, 1998), которая использует иерархическое тестирование вероятностей (likelihood ratio test, LRT), оценивающее соответствие моделей наблюдаемым данным. Дистанции для NJ анализа рассчитывали через ML оптимизацию. Для ML и MP анализов использовали эвристический поиск оптимальной топологии с алгоритмом обмена ветвей и реассоциацией деревьев (branch-swapping, tree bisection-reconnection; TBR). При BI анализе создавали 1 или 2 миллиона генераций цепей Маркова, отбирая пробы каждые 100 генераций, т.е. 10000 или 20000 проб. Первые 500-3000 проб (до выхода значений -InL на плато) исключались из анализа как «burn-in». Устойчивость полученных филогенетических деревьев оценивали методом бутстрепа (Bootstrap Percentage, далее ВР; Felsenstein, 1985), используя 1000 (NJ и MP) или 100 (ML) бутстреп-реплик, а также методом апостериорных вероятностей (Posterior Probabilities, далее РР) в BI. Значения ВР 50% и РР 0.90 не рассматривались и не были отражены на рисунках. В MP анализе опция пошагового добавления (stepwise addition; 10 эвристических поисков оптимальной топологии со случайным порядком добавления таксонов) использовалась для каждой реплики бутстреп-анализа. При ML бутстреп-анализе использовали один эвристический поиск оптимальной топологии на реплику. При этом начальное дерево получали при последовательном добавлении таксонов.
Для совместного анализа I8S рРНК и rbcL генов их последовательности были объединены как «суперген» в одну матрицу и проанализированы с использованием единой эволюционной модели с усредненными параметрами эволюции нуклеотидных последовательностей. Кроме этого, мы проводили совместный анализ генов методом суммирования -InL (Yang, 1996), следуя методике, описанной Bapteste et al. (2002). 1000 «лучших» ML топологий 18S рДНК-, rbcL- и их комбинированного наборов данных ( 3000 топологий) были объединены в один treefile, и значения -InL рассчитывались отдельно для наборов последовательностей I8S рДНК (с 18S рДНК моделью) и rbcL (с rbch моделью) генов. Для каждой топологии была рассчитана сумма обоих значений, и она служила критерием оптимальности топологии (меньшее значении подразумевает более оптимальную топологию).
С целью проверки некоторых филогенетических гипотез требуемые топологии создавались в программе Tree View 1.6.2 (Page, 1996) модификацией файла, содержащего информацию об «оптимальном дереве». Для их сравнениях «оптимальной» топологией в программе PAUP рассчитывали -InL каждой позиции для сравниваемых филогенетических деревьев и использовали полученные значения в качестве вводных данных для программы CONSEL (Shimodaira, Hasegawa, 2001). CONSEL рассчитывал вероятностные значения для этих топологий согласно методам Кишино-Хасегава (далее КН; Kishino, Hasegawa, 1989), Шимодайра-Хасегава (далее SH; Shimodaira, Hasegawa, 1999; оба взвешенные [w] и не взвешенные) и approximately unbiased test (AU) по многошкальной технике бутстрепа (Shimodaira, 2002).
Наличие 1506 интрона I группы в кодирующем регионе 18S рДНК конъюгат
Филогенетическое древо, показанное на рис. 14, было получено методом ML с использованием TrN+I+Г модели эволюции нуклеотидных последовательностей, наиболее полно описывающей нашу матрицу данных. Распределение видов между кладами в целом согласуется с их таксономической принадлежностью. Представители классов Coleochaetophyceae, Klebsormidiophyceae, Chlorokybophyceae и Mesostigmatophyceae образуют устойчивые базовые клады древа. Большая часть представителей класса Zygnematophyceae (81 из 84) объедерева. Большая часть представителей класса Zygnematophyceae (81 из 84) объединена в умеренно поддержанную (71% ВР в-NJ анализе, 1.00 РР) кладу. Род Spirotaenia (100 % ВР и 1.00 РР) располагается за пределами этой клады среди стрептофитных зеленых водорослей и имеет род Chlorokybus Geitler (Chloroky-bophyceae) в качестве сестринского таксона ( 74% ВР поддержки, 1.00 РР). Эта группировка, в свою очередь, является сестринской для клады Zygnematophyceae. Следует отметить, что клада Spirogyra/Sirogonium имеет очень длинную ветвь, свидетельствующую о повышенной скорости накопления мутаций в 18S рДНК слагающих ее видов. Наличие таких дивергентных последовательностей в матрице данных иногда снижает общую достоверность анализа за счет эффекта притяжения длинных ветвей (Long Branch Attraction, далее LBA; Hendy, Penny, 1989). Возможно, именно ато и обусловило столь неожиданное положение рода Spirotaenia. Однако, когда виділ Spirogyra были исключены из анализа, монофилия класса не была восстановлена. Напротив, статистическая значимость ветви, отделяющей большинство Zygnematophyceae от Spirotaenia возросла (83% в NJ анализе).
Водоросли, традиционно- относимые к нор. Zygnematales (сем. Mesotae-niaceae и Zygnemataceae), образуют несколько парафилетических групп в основании клады класса. Это - не имеющий статистической поддержки кластер "Zygnemataceae s. str."5 Spirogyra, две ветви Netrium и клада Roya. Мезотение-вые Netrium interruption и Roya являются сестринскими таксонами для Des-midiales (только близость Roya ел аби поддержана бутстрепом). В составе Zygnematales родовые клады: Mougeotiu, Zygnema, Roya (две идентичные последовательности) и Spirogyra - получили высокую статистическую значимость (99-100% ВР; 1.00 РР), а три рода: Neiriwn. Mesotaenium wCylindrocystis - напротив, выявлены как немомофилетнчные.
Филогенетическое древо, основанное на сравнении 1726 нуклеоти-дов 18S рДНК 84 представителей класса Zygnematophyceae и 13 видов других зеленых стрептофитных водорослей, а также 6 празинофитовых (Mamiellales и Pyramimonadales, Chlorophyta), взятых в качестве внешней группы. Величины бутстреп-поддержки (NJ(ML)/MP) 50% и апостериорных вероятностей (BI) 0.90 указаны для всех ветвей, за исключением внутренних в кладах Closteri-асеае и Desmidiaceae (100=100/100/1.00). В квадратных скобках приведены статистические поддержки основных ветвей древа, рассчитанные в анализах без представителей рода Spirogyra [NJ(ML)/MP только]. 18S рДНК последовательности, полученные автором, выделены жирным шрифтом. Родовые эпитеты, указываемые в скобках, соответствуют используемым в каталогах коллекций, но не признаваемых нами. Вид, обозначаемый как [Mesotaenium endlicherianum], скорее всего не является таковым. Длинные ветви Closteriaceae и Spirogyra графически уменьшены до 70 и 35% от исходной длины;
Помимо родовых клад, наблюдается устойчивая межродовая ассоциация Zygnema-Zygogonium-Zygnemopsis circumcarinata. Также установлена устойчивая (NJ: 96% и MP: 79% ВР) группа из 4 таксонов/штаммов, относящихся к 3 родам: Mesotaenium kramstai, Zygnemopsis sp., Zygnemopsis minutum и Cylindro-cystis sp. (штамм UTEX 1926), но, тем не менее, имеющих почти идентичные (различия только в 1-4 нуклеотида) последовательности. Достоверно установить характер взаимоотношений этих клад зигнемовых нам не удалось, т.к. порядок их ветвления не имел статистической поддержки.
В кладе Spirogyra/Sirogonium единственный представитель рода Sirogonium был расположен среди видов Spirogyra, нарушая монофилетичность последнего рода. Штаммы Spirogyra, не имеющие 1506 интрона I группы в 18S рДНК, являются терминальной группой клады и имеют очень длинную общую ветвь (рис. 14). В целом, в роде наблюдается высокая дивергенция видов, обеспечившая статистическую значимость многих его внутренних ветвей.
Особенности индивидуальных наборов данных и их анализов
Для того, чтобы ; исключить анализ неконгруентны х наборов данных и возможные артефакты, связанные с этим, нуклеотидные последовательности двух геяоъ (rbcL и I8S рДНК) были получены исключительно из одних и тех же клональных штаммов зеленых конъюгиругощих водорослей. Важность такого достаточно строгого подхода подтверждается двумя примерами: 1) два штамма, определенные как Netrium oblongum (ASW 07201 и SVCK 255; морфологически оба соответствуют описанию вида), на самом деле не являются филогенетически близкими друг к другу, и 2) в настоящем исследовании было показано, что последовательность (U38694) из базы данных, приписываемая штамму UTEX 934 {Roya anglica), скорее всего, принадлежит представителю другого рода. Состаниe 18S рДНК и rhcL последовательностей, полученных из разных источников, для единого анализа может привести к созданию химерных последовательностей, а кроме того к конфликту между результатами анализов двух генов. Наш подход гарантирует, что конфликт между индивидуальными филоге-ниями определяется исключительно различиями в темпах и закономерностях эволюции нуклеотидных последовательностей анализируемых генов.
Эволюционная динамика рибосомального (18S рРНК) и хлоропластного (rbcV) генов, исследованных на примере представителей класса Zygnematophy-сеае, существенно различаются, что отражается в различных параметрах.моделей эволюции их нуклеотидных последовательностей (пропорции типов замещений нуклеотидов, Г-параметр, процентный состав нуклеотидов). В обоих генах частота замещений С -»Т была значительно выше, чем замещений других типов (табл. 6). В 18S рДНК это может быть связано с необходимостью поддержания комплиментарных водородных связей (G-C G-U) на уровне транскрипта (рРНК), в то время как в rbcL гене (с еще более высокой частотой С«-»Т замещений), вероятно, обусловлено асимметричным использованием кодонов (Morton, 1994). Величина гамма-параметра в 18S рДНК наборе данных была примерно в три раза ниже, чем в rbcL, что отражает более равномерное распределение замещений по длине rbcL и согласуется с регулярной структурой колона протеин-кодирующего гена. Как следует из обзора,Kellogg, Juliano (1997), большая субъединица RUB1SCO практически,инвариантна по длине (476 аминокислот) в очень большой группе Viridiplantae, и ее вариабельность на аминокислотном уровне весьма умеренна. В классе Zygnematophyceae. 80% замещений нуклеотидов в rbcL приходится именно на третью позицию кодона. Хотя некоторые исследователи предлагают при анализе протеин-кодирующих генов на нуклеотидном уровне снижать вес третьей позиции или даже.совсем исключать ее из-за вырожденности (дегенерированности) генетического кода и томо-плазии (Nickrent et al., 2000; Nozaki et al., 2000), ограничение нашего анализа двумя первыми позициями кодона выразилось в значительном снижении его информативности (см. так же McCourt et al., 2000). В то же время, используя только третью позицию, мы получили древо, топология и статистическая поддержка которого были сравнимы с таковыми, полученными при анализе полного набора данных. Отсюда можно сделать вывод, что третья позиция кодона в rbcL наиболее информативна филогенетически и удаление ее из анализа нельзя считать обоснованным.
Вполне очевидно, что показанные выше различия между 18S рДНК и rbcL наборами данных привели к выбору различных моделей эволюции нуклеотидных последовательностей и их параметров (табл. 6). Однако эти модели не противоречат друг другу, поскольку TrN, наиболее адекватно описывающая I8S рДНК, является упрощенным вариантом GTR модели, принятой для rbcL, что не отрицает совместный анализ генов с использованием одной (усредненной) модели (в данном случае: GTR).
Сравнение индивидуальных филогенетических деревьев показывает, что они меют высокое сходство, выделяют одни и те же клады или индивидуальные ветви и характеризуют их сравнимыми величинами ВР и РР поддержки. Однако это сравнение обнаруживает также и несколько конфликтов между топологиями, которые обусловлены реальными различиями между генами и их историями. Наиболее очевидным противоречием между анализами является разграничение порядков Zygnematales и Desmidiales, поддерживаемое 18S рДНК, но не rbcL (данное исследование, а так же результат McCourt et al., 2000). В нашем гйсЬ-анализе два таксона из состава зигнемовых (Roya и Netrhtm oblongum SVCK 255) были помещены среди представителей Desmidiales. Однако даже это несоответствие относится к внутренним ветвям, не имеющим значимой бутстреп-поддержки в rbcL анализе (ветви поддержаны РР, см ниже), и поэтому оно не указывает на наличие серьезных противоречий между филогениями. В качестве примера конгруэнтности можно указать полифилию родов Mesotaenium, Cylindrocystis и Netrium, убедительно продемонстрированную индивидуальными наборами данных.
Анализ единой матрицы данных, объединяющей 18S рДНК и rbcL последовательности (3075 нт; табл. 6) с усредненной эволюционной моделью, позволил получить статистическую поддержку практически для всех внутренних ветвей, разделяющих группировки зигнемофициевых водорослей разного ранга (рис. 21). Топологически это древо сходно с таковым из 18S рДНК анализа (рис. 19), но его внутренние ветви существенно длиннее и имеют более высокую статистическую значимость. Ветвь, разделяющая порядки Zygnematales и Desmidiales, вновь установлена и, в отличие от rbcL анализа, получила значимую поддержку в ML и BI методах (рис. 21, ветвь между Roy а и GON). Примечательно, что комбинированный анализ вновь достоверно определил положение Netrium oblongum SVCK 255 и Mesotaenium endlicheriamim среди зигнемовых водорослей, в то время как на rbcL древе эти два таксона были заметно сдвинуты в сторону пор. Desmidiales (последнее, вероятно, было обусловлено влиянием длинных ветвей этих видов). Roya и две из трех (парафилетичных) ветвей рода Netrium с высокой достоверностью в ML и В Г позиционированы как сестринские для Desmidiales таксоны (рис. 21; ветвь между N и Netrium oblongum SVCK 255).
В комбинированном анализе SPI-клада вновь имеет самую длинную индивидуальную ветвь ( 180 апоморфных признаков из 3075), хотя и существенно сокращенную по сравнению с 18S рДНК топологией ( 159 апоморфий из 1722; рис. 19). Статистическая значимость практически всех внутренних ветвей древа возросла после удаления SPI из анализа.
