Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Объекты исследования 8
1.1. Положение семейства Boraginaceae в системе цветковых растений 8
1.2. Морфологическая характеристика семейства Boraginaceae и некоторых бореальных видов 10
1.3. Морфологические особенности и систематика рода Myosotis L 19
Глава 2. Материалы и методы 27
2.1. Исследованный материал 27
2.2. Методы исследования фенольных соединений .40
2.2.1 .Определение содержания флавоноидов 40
2.2.2. Определение качественного состава флавоноидов .42
2.2.3. Качественные реакции на наличие фенольных соединений в растительном материале .44
2.3. Качественные реакции на наличие сапонинов, алкалоидов и карденолидов в растительном материале 45
2.4. Определение элементного состава 46
2.5. Определение антибактериальной активности масляных экстрактов .46
2.6. Методы математической обработки результатов .47
Глава 3. Вторичные метаболиты представителей семейства boraginaceae 49
3.1. О возможности использования низкомолекулярных соединений в систематике растений .49
3.2. Низкомолекулярные соединения в представителях семейства Boraginaceae флоры Сибири (обзор литературы) 54
3.2.1. Терпеноиды 54
3.2.2. Алкалоиды 54
3.2.3. Фенольные соединения 61
Глава 4. Фенольные соединения как биохимические маркеры бореальных видов рода myosotisl 69
4.1. Содержание флавоноидов в представителях рода Myosotis L... 69
4.1.1. Индивидуальная изменчивость содержания флавоноидов Myosotis arvensis и М. caespitosa 70
4.1.2. Сезонная динамика накопления флавоноидов на примере Myosotis krylovii 72
4.1.3. Географическая (межпопуляционная) изменчивость содержания флавоноидов Myosotis imitata и М. krylovii 74
4.1.4. Содержание суммы флавоноидов для других видов рода Myosotis L 76
4.1.5. Изменчивость содержания флавоноидов представителей некоторых родов семейства Boraginaceae 79
4.2. Возможности применения данных о составе фенольных соединений в таксономии рода Myosotis L 81
4.3. Фенольные соединения представителей различных родов семейства Boraginaceae 101
Глава 5. Вторичные метаболиты и химические элементы представителей семейства boraginaceae juss 108
5.1. Вторичные метаболиты некоторых видов семейства Boraginaceae 108
5.2. Флавоноиды видов семейства Boraginaceae 112
5.3. Состав макро- и микроэлементов видов семейства Boraginaceae 115
5.4. Связь окраски цветков Myosotis krylovii с фенольными соединениями и элементным составом 122
Глава 6. Практическое значение представителей семейства boraginaceae kiss 126
6.1. Возможности применения представителей семейства в хозяйственной деятельности 126
6.2. Изучение антибактериальных свойств некоторых видов семейства Boraginaceae 131
Выводы 141
Список литературы 143
- Положение семейства Boraginaceae в системе цветковых растений
- Качественные реакции на наличие фенольных соединений в растительном материале
- О возможности использования низкомолекулярных соединений в систематике растений
- Индивидуальная изменчивость содержания флавоноидов Myosotis arvensis и М. caespitosa
Введение к работе
Актуальность темы. На территории Сибири произрастает 92 вида из 28 родов семейства Boraginaceae Juss. Большая часть видового состава принадлежит родам Myosotis L., Lappula Moench и Eritrichium Schrad. ex Gaudin (Овчинникова, Рыбинская, Никифорова, 1997).
Многие представители семейства Boraginaceae, особенно виды рода Myosotis, характеризуются полиморфизмом и широтой ареала, что обусловливает сложность систематики и делает это семейство перспективным объектом для хемотаксономических исследований.
Сведения о химическом составе вносят в систематику растений дополнительные материалы о сходстве и различии таксонов, способствуя формированию естественной системы. Наиболее часто для этих целей используют данные о составе флавоноидов (Harborne, 1977; Пименов, Борисова, 1987; Высочина, 2004). Кроме того, исследование химического состава выявляет растения, перспективные для дальнейшего детального химического и фармакологического изучения.
Интерес к фитотерапии, значительно возросший в последние годы, а также необходимость выявления новых источников биологически активных веществ, способствуют исследованию ранее не востребованных объектов. Начальным этапом фитохимических исследований являются скрининговые работы. Они не предполагают детального изучения соединений, выявляя общие закономерности накопления различных групп веществ.
Наиболее подробно изучены алкалоиды и нафтохиноны представителей семейства Boraginaceae (Юнусов, 1974; Старченко, 1985). Данные о соединениях других классов малочисленны.
Некоторые виды семейства Boraginaceae применяются в народной медицине. Из сибирских представителей это - Lithospermum officinale L., Cynoglossum officinale L., Echium vulgare L., Pulmonaria mollis Wulfen ex Homem. и Symphytum officinale L. (Минаева, 1991).
5 Многие вещества вторичного синтеза обладают антимикробной
активностью. Существуют данные о подавлении роста и развития
микроорганизмов нафтохинонами, танинами, катехинами,
фенолкарбоновыми кислотами, алкалоидами (Щербановский и др., 1972;
Макаров, 2002).
Цель работы: изучить возможности применения данных о составе и содержании вторичных метаболитов в таксономии семейства Boraginaceae; выявить среди видов семейства, произрастающих на территории Сибири, потенциальные источники биологически активных веществ.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
на основании морфологических и эколого-географических характеристик представителей семейства Boraginaceae, произрастающих на территории Сибири, определить основные объекты биохимических исследований;
изучить фенольные соединения видов рода Myosotis, произрастающих на территории Сибири;
3) на примере видов рода Myosotis изучить индивидуальную,
межпопуляционную, видовую и сезонную изменчивость содержания
флавоноидов;
проанализировать возможности использования полученных данных для уточнения системы рода и выявления родственных отношений изученных видов;
провести скрининг на наличие фенольных соединений, сапонинов, алкалоидов и химических элементов в надземной части представителей семейства Boraginaceae, произрастающих на территории Сибири;
изучить антимикробное действие на различные виды патогенных и условно-патогенных микроорганизмов in vitro.
Защищаемые положения:
Виды семейства Boraginaceae Juss., произрастающие на территории Сибири, содержат комплекс биологически активных веществ, в состав которого входят флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, сапонины, алкалоиды, танины, кумарины. Echium vulgare L., Eritrichium pectinatum (Pall.) DC. и виды секции Alpestres (T.N. Pop.) О. Nikiforova рода Myosotis L. представляют интерес как источники флавоноидов вследствие их высокого содержания.
В роде Myosotis состав флавоноидов проявляет слабую видовую специфичность и изменчивость. Более информативны в таксономическом аспекте фенолкарбоновые кислоты, которые являются биохимическими маркерами секционного и подсекционного ранга.
Из 17 видов семейства Boraginaceae, обладающих антимикробной активностью в отношении патогенной микрофлоры, Eritrichium subrupestre М. Pop. угнетает наибольшее число видов микроорганизмов.
Научная новизна работы. Впервые исследован состав и содержание флавоноидов и состав фенолкарбоновых кислот 14 видов рода Myosotis и 1 вида рода Strophiostoma Turcz. - S. sparsiflorum (Mikhan ex Pohl) Turcz.; доказано, что состав фенолкарбоновых кислот является таксономическим признаком для рода Myosotis на уровне секций и подсекций.
Впервые проведен скрининг 17 сибирских видов Boraginaceae из родов Lithospermum L., Onosma L., Buglossoides Moench, Echium L., Nonea Medik., Brunnera Stev., Eritrichium Schrad. ex Gaudin, Lappula Moench, Amblynotus (A. DC.) Johnst., Cynoglossum L. и Myosotis L. на наличие основных групп вторичных метаболитов; исследовано содержание 19 макро- и микроэлементов: К, Са, Ті, V, Cr, Mn, Fe, Со, Ni, Си, Zn, As, Br, Rb, Sr, Y, Zr, Mo, Pb. Впервые изучены антимикробные свойства масляных экстрактов листьев представителей семейства.
7 Практическая значимость. Выявлены перспективные для
дальнейшего исследования объекты. Высокое содержание флавоноидов
отмечено для Echium vulgare, Eritrichium pectinatum и видов секции Alpestres
рода Myosotis. Обнаружено значительное количество алкалоидов в
Amhlynotus rupestris (Pall, ex Georgi) M. Pop. и Lappula consanguinea (Fisch. &
C.A. Mey.) Guerke. Показана возможность практического применения
масляных экстрактов растений семейства Boraginaceae в связи с их
антимикробным действием.
Апробация работы. Основные результаты исследований представлены на I и II молодёжной конференции «Исследования молодых ботаников Сибири» (Новосибирск, 2001; 2004); Международной научной конференции по систематике высших растений, посвященной 70-летию со дня рождения проф. В.Н. Тихомирова (Москва, 2002); I и V международной научно-практической конференции «Проблемы ботаники Южной Сибири и Монголии» (Барнаул, 2002; 2006); XI съезде Русского ботанического общества «Ботанические исследования в азиатской России» (Новосибирск-Барнаул, 2003).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 6 глав, выводов и списка литературы. Содержание диссертации изложено на 159 страницах и проиллюстрировано 32 рисунками и 16 таблицами. Список цитируемой литературы содержит 189 источников, в том числе 41 на иностранных языках.
Выражаю благодарность сотрудникам лаборатории систематики О.Д. Никифоровой и СВ. Овчинниковой за консультативную помощь и предоставленные материалы.
Положение семейства Boraginaceae в системе цветковых растений
Некоторые авторы, вслед за А. P. De Candolle, понимают Boraginaceae Juss. (бурачниковые) в широком смысле, включая в него пять подсемейств: Hydrophyllaceae Lindl., Heliotropoideae Gurke, Ehretioideae Gurke, Cordioideae Gurke и Boraginoidea G. Don (Тахтаджян, 1965). В таком объеме Boraginaceae насчитывает около 154 родов и 2500 видов (Maberley, 1987). Наиболее широко они распространены в тропических и субтропических областях, где наряду с травянистыми растениями встречаются древесные и кустарниковые формы (Тахтаджян, 1987; Maberley, 1987; Cronquist, 1988).
А. Л. Тахтаджян, включил семейство Boraginaceae в порядок Boraginales Hutch, надпорядка Solananae R. Dahlgren ex Reveal, подчеркнув их родство с семействами Lamiaceae Lindl. и Solanaceae Juss., а также с порядком Polemoniales Bromhead, к которому Boraginaceae относили ранее (Доброчаева, 1981). Наиболее близкие к Boraginaceae семейства - Hydrophyllaceae R. Br., Lennoaceae Solms-Laubach., Hoplestigmataceae Gilg., Ehretiaceae Lindl., Cordiaceae R. Br., Wellstediaceae (Pilger) Novak. (Тахтаджян, 1987).
A. Cronquist (1988) включил Boraginaceae в порядок Lamiales наряду с семействами Lamiaceae, Verbenaceae J. St.-Hill. и Lennoaceae. Некоторые тропические древесные Boraginaceae (подсем. Cordioideae) близки к тропическим Verbenaceae, а гинецей большинства видов имеет гинобазический столбик, как у Lamiaceae. Наряду с морфолого-анатомическими данными в своей системе автор учитывает и некоторые химические особенности таксонов. Для Boraginaceae такими особенностями являются продуцирование алканина (нафтохинон) и пирролизидиновых алкалоидов и неспособность накапливать иридоиды в отличие от других семейств порядка (Cronquist, 1988).
В субтропической и бореальной зонах преимущественно распространены одно- и многолетние травянистые представители семейства Boraginaceae: роды с гинобазическим (базальным) столбиком и сухими плодами - эремами, то есть те, которые De Candolle относил к подсемейству Boraginoidea. В таком объеме семейство Boraginaceae насчитывает около 90 родов и около 1000 видов внетропических травянистых растений (Попов, 1983). Целесообразность отделения Boraginoideae от других подсемейств обосновал французский анатом растений Van Tieghem Ph. (Базилевская и др., 1968). Cordiaceae и Heliotropiaceae Schrad. представлены древесными тропическими растениями и имеют апикальный столбик и костянковидные плоды (за исключением некоторых видов рода Heliotropium L.) и, по мнению М.Г. Попова, являются предковыми семействами по отношению к Boraginaceae s. str.
Для разделения Boraginaceae на трибы впервые применил карпологические признаки De Candolle. По форме эремов и типу их прикрепления к гинобазису он выделял 4 трибы: Lithospermeae DC, Anchuseae DC, Eritrichieae Benth. et Hook., Cynoglosseae DC.
Существенный вклад в изучение видов и систематику семейства Boraginaceae внес М.Г. Попов. Пересмотрев систему семейства, на основании карпологических и королярных признаков он выделил четырнадцать триб: Lithospermeae, Cerinteae DC, Trigonotideae Riedl H., Myosotideae Reichenb., Echieae DC, Anchuseae, Eritrichieae, Heterocaryeae Zak., Rochelieae DC, Harpaganelleae Gurke, Amsinckieae M.Pop., Asperugeae Zak., Cynoglosseae, Trichodesmeae Zak. (Попов, 1983).
Сибирь входит в состав Бореального флористического подцарства Циркумбореальной подобласти. Семейство Boraginaceae занимает одно из ведущих мест в составе флор Западно-Средиземноморской, Переднеазиатской и Туранской подобластей Средиземноморской области (Толмачев, 1986), но достаточно широко распространено во всей умеренной зоне Голарктического царства (Гумбольдт, 1936; Тахтаджян, 1978).
Общий план строения цветка Boraginaceae можно выразить формулой: K(5)C(5)A(5)G2(+2)- Соцветие чаще всего в виде завитка - борагоида или метельчато-цимозное, образовавшее борагоид в результате редукции (Попов, 1983). Цветки пятичленные, правильные или неясно зигоморфные, редко -явно зигоморфные. Чашечка спайнолепестная, более или менее глубоко-пятирассеченная или пятизубчатая, остающаяся при плодах и иногда разрастающаяся. Венчик брахиморфный, мезоморфный или долихоморфный, спайнолепестный, по большей части правильный, трубчатый, воронковидный, колокольчатый или колесовидный, с 5-раздельным отгибом, при основании которого, в зеве, находится 5 сводиков разной формы и степени выраженности. Тычинок 5, прикрепленных спинкой к трубке венчика и чередующихся с его лопастями, обычно свободных, реже -сливающихся и образующих трубку. Пестик 1, завязь верхняя, обычно 4-лопастная и 4-гнездная (редко 2-лопастная, ещё реже цельная), с 1 семяпочкой в каждом гнезде; рыльце цельное, точечное, головчатое или 2-раздельное. Плод сухой, распадающийся на 4 (реже на 2) эрема. Из каждой доли или лопасти обычно развивается 1 эрем. Форма и структура эремов разнообразна. Они могут иметь тонкий или толстый, иногда каменистый перикарп, а иногда ещё и пробковый эпикарп. В поперечном сечении эремы обычно трехгранные, обращенная наружу грань называется спинным диском, если она отделена от боков острыми гранями, или просто спинкой, если она плавно переходит в боковые грани. Стебель цилиндрический, листья цельные без прилистников, располагаются очередно.
Растения большей частью жестко-волосистые (Попов, 1953; Крылов, 1937). Волоски одноклеточные, имеющие базальный цистолит и часто кальцинированные или кремнезированные стенки, а также с накапливающейся свободной кремниевой кислотой.
Растения могут продуцировать алкалоиды пирролизидиновой группы, часто содержат алканнин в корнях, редко цианогенные или сапониноносные, в основном без эллаговой кислоты и проантоцианидинов, часто накапливают фруктозаны как запасные углеводы и аллантоин как азотный питательный запас. В некоторых клетках паренхимнои ткани присутствуют одиночные или сгруппированные кристаллы оксалата кальция (Cronquist, 1988).
Качественные реакции на наличие фенольных соединений в растительном материале
Определение наличия катехинов Наличие в растительном материале катехинов определяли добавлением к 1 мл исходного экстракта 1 мл 1 % раствора ванилина в концентрированной соляной кислоте. При наличии катехинов образуется розовое, малиновое или оранжево-красное окрашивание. Реакции с FeCb или железоаммонийными квасцами в случае наличия в соединениях орто-гидроксильной (пирокатехиновой) группировки дают черно-зеленое окрашивание, катехины с рядовым расположением оксигрупп (аналоги пирогаллола) образуют черно-синее окрашивание (Запрометов, 1964).
Определение наличия дубильных веществ К 2 мл исходного экстракта прибавляли несколько капель раствора железоаммонийных квасцов. Черно-зеленое окрашивание или осадок свидетельствует о наличии конденсированных дубильных веществ, черно-синее окрашивание или осадок - о наличии свободных дубильных соединений (Методы биохимического исследования растений, 1987).
Качественная реакция на наличие кумаринов Воздушно-сухое сырье 0,1 г кипятили 2 часа с 2,5 мл 1 Н NaOH. При этом кумарины переходят в орто-кумариновую кислоту. В пробирках доводили водой до 15 мл, встряхивали, давали отстояться. Немного жидкости отбирали в фарфоровую чашку и просматривали в УФ свете.
Безкумариновые экстракты имеют слабый буро-красный цвет. Экстракты с низким содержанием кумаринов - красно-зеленую флуоресценцию. Высококумариновые - блестящую зеленую флуоресценцию (Slatenek, Wsahburn, 1944).
Определение наличия алкалоидов Экстракция: 1 г сырья помещали в колбу на 100 мл, добавляли 12 мл 1% раствора НС1, держали на кипящей водяной бане 5 минут. После охлаждения экстракт отфильтровывали, отстаивали 1 сутки, декантировали (5-7 мл), разливали в 4 пробирки по 0,5 мл, прибавляя по каплям соответствующие реактивы. 1. 1 % раствор кремневольфрамовой кислоты; 2. 1% раствор фосфорномолибденовой кислоты; 3. реактив Драгендорфа: ВіІз КІ; 4. реактив Вагнера: І2 2КІ.
В присутствии алкалоидов образуется осадок (Чадин и др., 2004).
Определение наличия сапонинов Готовили водный экстракт 1:10, нагревая измельченное сырье на водяной бане в течение 10 мин. Настой после охлаждения фильтровали и проводили качественную реакцию на наличие тритерпеновых сапонинов: при прибавлении к 2 мл экстракта нескольких капель среднего ацетата свинца образуется осадок (Деканосидзе и др., 1982).
Определение наличия карденолидов Реакция Балье: к 2 мл исходного экстракта прибавляли щелочной раствор пикриновой кислоты. При наличии карденолидов должно образовываться оранжево-красное окрашивание (Химический анализ лекарственных растений, 1983).
Навеску воздушно-сухого растительного сырья (0,1 г) измельчали в агатовой ступке. Затем образцы прессовали в форме таблетки диаметром 1 см, весом - 30 мг (с поверхностной плотностью 0.03 г/см ). Определение элементов проводили методом рентгенофлуоресцентного анализа с использованием синхротронного излучения (РФА СИ) на станции элементного анализа в Институте ядерной физики СО РАН (накопитель ВЭГТП-3).
Режим работы накопителя во время измерений: для элементов с атомным номером Z= 16-39 энергия возбуждающего монохроматизированного излучения Емон = 21 кэВ; для элементов с Z = 40-56 энергия мон= 38 кэВ.
Обработку эмиссионных спектров проводили по программе AXIL. Концентрацию элементов определяли с использованием метода "внешнего стандарта". В качестве стандартных образцов использовали российский стандарт травосмеси СБМТ-02 (Арнаутов, 1990).
Воспроизводимость результатов анализа, полученная путем 15-ти параллельных измерений 3-х одинаковых образцов, для большинства элементов колеблется, в основном, в пределах 3-11% (коэффициент вариации), для ванадия, кобальта, никеля и циркония - 17, 18, 40 и 60% соответственно. Возможности метода РФА СИ, конструкция станции и измерительного комплекса даны в работе В.Б. Барышева и др. (1986).
О возможности использования низкомолекулярных соединений в систематике растений
Низкомолекулярные соединения включают все так называемые "вещества вторичного биосинтеза" - алкалоиды, терпеноиды, кумарины, флавоноиды и некоторые другие фенольные соединения. Так как четкую грань между первичным и вторичным обменом провести невозможно, вторичные метаболиты - довольно условная группа, включающая соединения различного строения и характера (Hasslam, 1986; Запрометов, 1993). Общим для этих соединений является то, что, не играя роли в жизнедеятельности синтезирующей их клетки, они важны для организма (Luckner, 1984). Достаточно часто они применяются для решения конкретных вопросов систематики таксонов родового и видового ранга (Alston, 1965).
Низкомолекулярные соединения подразделяются на три основных класса в зависимости от их биогенетического происхождения: 1) небелковые аминокислоты, цианогенные соединения, алкалоиды -дериваты аминокислот; 2) терпеноиды, смоляные кислоты, сапонины, фитостерины, каротиноиды; 3) фенольные соединения (Пименов, Борисова, 1987).
Из соединений первой группы нас интересовали алкалоиды -азотсодержащие органические основания. Алкалоиды - искусственный конгломерат, включающий несколько групп соединений, имеющих собственный биогенез. Алкалоиды играют достаточно большую роль в хемотаксономии, так как отличаются своеобразным молекулярным строением и встречаются в растениях спорадически. Наличие или отсутствие в растениях алкалоидов, а также данные о их качественном составе помогают в уточнении филогенетической системы (Соколова и др., 1991). Распределение алкалоидов неравномерно: они сосредоточены как в древних и примитивных таксонах {Magnoliales, Ranales), так и в молодых {Rubiales, Asterales) (Пименов, Борисова, 1987).
Алкалоиды используются в хемосистематике преимущественно на уровне семейств, родов, секций, реже для изучения сложных видовых комплексов и гибридизации. При использовании алкалоидов для систематических целей значение имеют лишь соединения одной биогенетической группы (Ловкова, 1981; Челомбитько, Михеев, 1987).
Терпеноиды представляют вторую группу. Это обширный класс соединений, включающий моно-, сескви- и дитерпены, иридоиды, стероиды, карденолиды, сапонины, каротиноиды. В основе биосинтеза терпеноидов лежит конденсация изопреновых элементов. Сравнительное изучение иридоидов и других терпеноидов может быть значимо в плане систематики на уровне семейств, триб, родов, видовых групп. Признаки летучих терпенов часто используются в систематике семейства Lamiaceae (Bate-Smith et al., 1975; Werker et al., 1985; Фурса и др., 1985; Пименов, Борисова, 1987).
Фенольными соединениями принято называть вещества, содержащие в своей молекуле бензольное ядро с одной или более гидроксильными группами. В качестве эквивалента часто используется термин "полифенолы". Цитоплазма растительных клеток не содержит большого количества фенольных соединений. В клеточном соке они встречаются в виде гликозидов. Некоторые группы фенольных соединений - флавоноиды, производные коричной кислоты - встречаются во всем растительном царстве, другие - специфичны для отдельных таксонов (Блажей, Шутый, 1977).
Перспективность фенольных соединений, особенно флавоноидов как хемотаксономических признаков обосновал J.B. Harborne (1977). Этому классу веществ свойственны: универсальность распространения в сосудистых растениях, структурное разнообразие, относительная легкость выделения из малых количеств материала, химическая стабильность, что позволяет анализировать образцы различных сроков сбора.
Наибольшее значение для хемосистематики имеют флавоноиды -соединения Сб-Сз-Сб ряда, образующиеся из хромана или флавана. Различают 12 основных классов флавоноидов (Запрометов, 1993): 1. незамещенные в пирановом ядре флаваны - фитоалексины; 2. катехины (флаван-3-олы); 3. флаван-4-олы (например, лютеоферол); 4. лейкоантоцианины (флаван-3,4-диолы); 5. дигидрохалконы (например, флоридзин); 6. халконы; 7. антоцианидины и антоцианины; существует 6 основных антоцианидинов: пеларгонидин, цианидин, пеонидин, дельфинидин, петунидин, мальвидин; 8. флаваноны; 9. флаванонолы (дигидрофлаванолы);
Ю.флавоны; наиболее известные представители: апигенин (5,7,4 триоксифлаван) и лютеолин (5,7,3 ,4 - тетраоксифлаван); П.флавонолы; известно свыше 200 агликонов флавонолов, в том числе кверцетин, кемпферол, изорамнетин и мирицетин и более 500 их гликозидов. Образуют разнообразные метилированные и ацилированные производные; 12.ауроны.
Индивидуальная изменчивость содержания флавоноидов Myosotis arvensis и М. caespitosa
Начальным этапом изучения признака является выяснение его вариабельности. В случае высокой изменчивости признака его таксономическая значимость снижается (Пименов, Борисова, 1986).
Индивидуальную изменчивость содержания флавоноидов мы изучали на примере М. arvensis (секция Sylvaticae) из Новосибирской области (табл. 1, № 6.1.1; рис. 3) и М. caespitosa из Кемеровской области (секция Myosotis) (табл. 1, № 2.4.1; рис. 4). На основании полученных данных вычисляли коэффициент вариации - V по С.А. Мамаеву (1973).
Оценку коэффициентов вариации проводили по шкале уровней изменчивости, предложенной Мамаевым (1973). Уровень изменчивости считается очень низким при V 7%, низким при V=8-12%, средним при V=13-20%, высоким при V=21-40% и очень высоким при V 40% . Вариабельность содержания флавоноидов в индивидуальных растениях Myosotis caespitosa в пределах одной ценопопуляции является низкой, а М. arvensis - средней.
Изменчивость содержания флавоноидов в индивидуальных растениях М. arvensis (20 растений) составила V= 16,05 %, с диапазоном варьирования 1,46 - 3,36 % и т= 2,36 %, а для М. caespitosa (20 растений) V=7,2 %, с диапазоном варьирования 1,22 - 2,50 % и m =1,96 %.
Сравнение изменчивости содержания флавоноидов Myosotis arvensis и М. caespitosa по критерию Фишера показало, что по данному признаку виды различаются достоверно: F = 3,17 при F Tafa = 2,12.
Исследование хронографической изменчивости - необходимый элемент хемотаксономических исследований. Наиболее существенные ошибки обычно допускаются в связи с факторами сезонного и возрастного варьирования, которые влияют на состав и содержание химических соединений (Adams, 1972; Пименов, Борисова, 1987). Большинство сведений о накоплении флавоноидов у травянистых растений свидетельствует о возрастании содержания в течение вегетации до максимального в фазах бутонизации или цветения (Сыртанова, 1972; Боброва, 1972; Минаева, 1978).
Мы изучали сезонную динамику накопления суммы флавоноидов в вегетативных органах Myosotis krylovii (рис. 5).
Исследовали растения в фазах вегетации (1 - 17.05.06), бутонизации (2 - 22.05.06), бутонизации - начала цветения (3 - 26.05.06), массового цветения (4 - 1.06.06), цветения - начала плодоношения (5 - 6.06.06), конца цветения - плодоношения (6 - 16.06.06), плодоношения (7 - 23.06.06). Для уменьшения влияния на содержание флавоноидов погодных условий материал собирали в сухие солнечные дни при температуре 25 - 28 С, установившейся не менее чем за сутки до сбора.
Минимальное содержание флавоноидов - 1,45 % - обнаружено в растениях в фазе вегетации. Первый максимум приходится на фазу массового цветения - 2,73 %. В начале плодоношения содержание флавоноидов уменьшается до 1,91 %, а затем до 1,64 %. Второй максимум содержания обнаружен в фазе плодоношения - 2,55 %.
Коэффициент вариации для полученных данных составил 11,4 %. Таким образом, сезонная изменчивость содержания флавоноидов низкая (Мамаев, 1973). Это свидетельствует о стабильности данного признака и возможности сравнения образцов растений, собранных в разные фазы развития.
Масса растений видов рода Myosotis максимальна в фазу цветения и к фазе плодоношения обычно снижается за счет отмирания прикорневых листьев и увеличения процента поврежденных тканей. Таким образом, для выяснения ценности флавоноидоносного сырья видов Myosotis целесообразно определять содержание флавоноидов в образцах, собранных в период массового цветения.
Достаточно часто различия в химическом составе и обнаружение хемотипов связывают с географическим фактором, то есть всей суммой экологических и фитоценотических факторов, определяющих зональность и поясность растительного покрова (Крылова, 1988). Наличие химической неоднородности в пределах ареала может иметь большое практическое значение, поскольку содержание и качественный состав биологически активных веществ определяют достоинства сырья (Пименов и др., 1978; Мелибаев и др., 1980; Фурса, 1988; Шохина и др., 1999).
Нами проанализированы результаты определения количества флавоноидов на примере 14 образцов М. krylovii и 6 образцов близкородственного ему вида М. austrobaicalensis (рис. 6) и 21 образца М. imitata (рис. 7).
