Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Этиопатогенетические паттерны рассеянного склероза 12
1.2. Эксайтотоксичность в патогенезе РС 14
1.2.1. Глутаматэргическая система 14
1.2.2. Биосинтез глутамата в нервной системе 15
1.2.3. Глутаматные рецепторы в нервной системе 16
1.2.4. Переносчики глутамата 21
1.2.5. Глутаматные рецепторы иммуннокомпетентных клеток 22
1.2.6. Глутаматопосредованная эксайтотоксическая гибель нейронов при РС 24
1.3. Генетические аспекты развития РС 26
1.3.1. Полиморфизм генов GRIN2A и SLC1A2 29
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 33
2.1. Характеристика обследованных лиц 33
2.2. Определение уровня глутамата в сыворотке крови 37
2.3. Выделение ДНК из лейкоцитов венозной крови 38
2.4. Определение аллельных вариантов генов GRIN2A и SLC1A2 методом ПЦР в режиме реального времени 38
2.5. Статистический анализ результатов исследования 40
ГЛАВА 3. Результаты собственного исследования 41
3.1. Характеристика клинического материала в зависимости от типа течения заболевания 42
3.2. Анализ концентрации глутаминовой кислоты у больных РС 56
3.3. Полиморфизм генов GRIN2A (rs2650427), GRIN2A (rs1969060) и SLC1A2 (rs4354668) глутаматэргической системы у больных РС 71
Заключение 87
- Глутаматэргическая система
- Переносчики глутамата
- Определение уровня глутамата в сыворотке крови
- Анализ концентрации глутаминовой кислоты у больных РС
Глутаматэргическая система
Рассеянный склероз (РС) – широко распространенное дизиммунно-нейродегенеративное заболевание ЦНС, характеризующееся образованием множественных очагов демиелинизации и неуклонно прогрессирующим течением [37]. Эта проблема остается одной из самых актуальных в неврологии и в настоящее время, что объясняется высокой распространенностью заболевания среди лиц молодого возраста и неизбежным развитием на определенной стадии стойкой ин-валидизации.
В настоящее время в мире насчитывается около 3 миллионов больных рассеянным склерозом, в том числе в России около 150 тысяч. Проведенные в последнее время на разных территориях страны эпидемиологические исследования по единой методологии показали, что большинство регионов России относятся к зоне со средней частотой РС (от 10 до 59 случаев на 100 000 населения) [37,12]. Томская область относится к зоне среднего риска по РС. С течением времени установлено увеличение распространенности болезни: в 1999 году она составляла 25, в 2003 г. – 26, в 2010 г. – 27,11 на 100 000 населения [1,3,4]. Заболеваемость РС из года в год увеличивается на большей части территорий. Это связывают как с истинным увеличением числа больных, так и с увеличением продолжительности жизни пациентов, а также с совершенствованием методов ранней диагностики заболевания [5].
Этиология РС до сих пор остается неясной для исследователей всего мира. В течение последних лет все больше сторонников находит мультифакториальная теория РС, согласно которой в развитии заболевания играют важную роль как эндогенные (генетическая предрасположенность, гормональный фон и др.), так и экзогенные факторы – персистирующая вирусная инфекция, экология, диета и географические особенности [6,14,7,12]. Иммунопатологические механизмы развития РС достаточно хорошо изучены. Они включают в себя активацию анергичных, неактивных Т-клеток типа CD4+ вне ЦНС; проникновение их через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ); образование тримолекулярного комплекса, включающего соответствующий рецептор активированной Т-клетки и аутоантигена, связанный с молекулами II класса главного комплекса гистосовместимости на антигенпрезентирующих клетках (в качестве последних выступают макрофаги и клетки глии). Проникшие в нервную систему аутореактивные Т-клетки и вторично активированные макрофаги и мик-роглия секретируют провоспалительные цитокины (интерферон , фактор некроза опухоли , лимфотоксин и др.), которые, в свою очередь, ещ больше индуцируют и поддерживают воспалительные реакции и увеличивают проницаемость ГЭБ [10,11,13,33].
Помимо активации клеточного звена в патогенез РС вовлекается и гуморальное звено иммунитета, активируется система комплимента. Несмотря на то, что клиническое течение РС на начальных этапах характеризуется чередованием обострений и ремиссии, иммуно-воспалительный процесс в целом характеризуется постоянным течением. В результате каскада иммунологических и биохимических нарушений развивается повреждение миелина и олигодендроцитов. Однако, помимо развития воспалительных реакций, демиелинизирующего процесса и глиальных нарушений, в последнее время при РС большое внимание уделяют нейродегенерации с вовлечением в патологический процесс аксонов. Именно ак-сональное повреждение при РС считают ответственным за развитие необратимого неврологического дефицита и трансформацию ремиттирующего течения с лабильностью симптомов во вторично-прогрессирующий [1,28].
Рассматривается несколько наиболее вероятных причин деструкции аксонов при РС. Механизмом прямой иммунологической атаки аксонов при РС считают экспрессию на них молекулы I класса главного комплекса гистосовместимости, что делает их уязвимыми к цитотоксическому влиянию Т-лимфоцитов типа CD8+. Развитие аксональной дегенерации, обусловленной воспалительными реакциями, может быть связано с различными факторами: увеличение внеклеточного давления при воспалительном отеке, эксайтотоксическое повреждение в результате воздействия возбуждающей аминокислоты глутамата (продуцируемой активированными макрофагами и микроглией), выделение провоспалительных цитокинов [15,18]. Кроме того, аксоны особенно подвержены дегенеративным изменениям при воздействии оксида азота, продуцируемого в больших концентрациях в месте развития воспалительных реакций. Это особенно проявляется в момент электрической активности, сопровождающейся наиболее высокими метаболическими потребностями [17,16,15,18,19].
Таким образом, на сегодняшний день по данным современной литературы доказано, что в патогенезе РС эксайтотоксичность, окислительный стресс, воспаление и нейродегенерация являются центральными компонентами.
Глутаматная система – самая мощная трансмиттерная система мозга. По оценке разных источников до 40-50% синапсов в ЦНС являются глутаматэргиче-скими [20,8,21]. Глутаминовая кислота была открыта Риттхаузеном (Ritthausen) в 1866 г. и уже к началу 1900-х гг. было установлено, что глутамат – важный компонент нервной ткани. Глутаматергические нейроциты были обнаружены в коре больших полушарий, обонятельной луковице, гиппокампе, черной субстанции, мозжечке, сетчатке [20,2,22].
Общепризнанным является тот факт, что глутамат – основной нейромедиа-тор задних рогов спинного мозга. Он выделяется всеми классами первичных афферентных волокон (в том числе ноцицептивными), а также аксонами многих спинальных нейронов [2,23].
Переносчики глутамата
Рассеянный склероз (РС) – широко распространенное дизиммунно-нейродегенеративное заболевание ЦНС, характеризующееся образованием множественных очагов демиелинизации и неуклонно прогрессирующим течением [37]. Эта проблема остается одной из самых актуальных в неврологии и в настоящее время, что объясняется высокой распространенностью заболевания среди лиц молодого возраста и неизбежным развитием на определенной стадии стойкой ин-валидизации.
В настоящее время в мире насчитывается около 3 миллионов больных рассеянным склерозом, в том числе в России около 150 тысяч. Проведенные в последнее время на разных территориях страны эпидемиологические исследования по единой методологии показали, что большинство регионов России относятся к зоне со средней частотой РС (от 10 до 59 случаев на 100 000 населения) [37,12]. Томская область относится к зоне среднего риска по РС. С течением времени установлено увеличение распространенности болезни: в 1999 году она составляла 25, в 2003 г. – 26, в 2010 г. – 27,11 на 100 000 населения [1,3,4]. Заболеваемость РС из года в год увеличивается на большей части территорий. Это связывают как с истинным увеличением числа больных, так и с увеличением продолжительности жизни пациентов, а также с совершенствованием методов ранней диагностики заболевания [5].
Этиология РС до сих пор остается неясной для исследователей всего мира. В течение последних лет все больше сторонников находит мультифакториальная теория РС, согласно которой в развитии заболевания играют важную роль как эндогенные (генетическая предрасположенность, гормональный фон и др.), так и экзогенные факторы – персистирующая вирусная инфекция, экология, диета и географические особенности [6,14,7,12]. Иммунопатологические механизмы развития РС достаточно хорошо изучены. Они включают в себя активацию анергичных, неактивных Т-клеток типа CD4+ вне ЦНС; проникновение их через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ); образование тримолекулярного комплекса, включающего соответствующий рецептор активированной Т-клетки и аутоантигена, связанный с молекулами II класса главного комплекса гистосовместимости на антигенпрезентирующих клетках (в качестве последних выступают макрофаги и клетки глии). Проникшие в нервную систему аутореактивные Т-клетки и вторично активированные макрофаги и мик-роглия секретируют провоспалительные цитокины (интерферон , фактор некроза опухоли , лимфотоксин и др.), которые, в свою очередь, ещ больше индуцируют и поддерживают воспалительные реакции и увеличивают проницаемость ГЭБ [10,11,13,33].
Помимо активации клеточного звена в патогенез РС вовлекается и гуморальное звено иммунитета, активируется система комплимента. Несмотря на то, что клиническое течение РС на начальных этапах характеризуется чередованием обострений и ремиссии, иммуно-воспалительный процесс в целом характеризуется постоянным течением. В результате каскада иммунологических и биохимических нарушений развивается повреждение миелина и олигодендроцитов. Однако, помимо развития воспалительных реакций, демиелинизирующего процесса и глиальных нарушений, в последнее время при РС большое внимание уделяют нейродегенерации с вовлечением в патологический процесс аксонов. Именно ак-сональное повреждение при РС считают ответственным за развитие необратимого неврологического дефицита и трансформацию ремиттирующего течения с лабильностью симптомов во вторично-прогрессирующий [1,28].
Рассматривается несколько наиболее вероятных причин деструкции аксонов при РС. Механизмом прямой иммунологической атаки аксонов при РС считают экспрессию на них молекулы I класса главного комплекса гистосовместимости, что делает их уязвимыми к цитотоксическому влиянию Т-лимфоцитов типа CD8+. Развитие аксональной дегенерации, обусловленной воспалительными реакциями, может быть связано с различными факторами: увеличение внеклеточного давления при воспалительном отеке, эксайтотоксическое повреждение в результате воздействия возбуждающей аминокислоты глутамата (продуцируемой активированными макрофагами и микроглией), выделение провоспалительных цитокинов [15,18]. Кроме того, аксоны особенно подвержены дегенеративным изменениям при воздействии оксида азота, продуцируемого в больших концентрациях в месте развития воспалительных реакций. Это особенно проявляется в момент электрической активности, сопровождающейся наиболее высокими метаболическими потребностями [17,16,15,18,19].
Таким образом, на сегодняшний день по данным современной литературы доказано, что в патогенезе РС эксайтотоксичность, окислительный стресс, воспаление и нейродегенерация являются центральными компонентами.
Глутаматная система – самая мощная трансмиттерная система мозга. По оценке разных источников до 40-50% синапсов в ЦНС являются глутаматэргиче-скими [20,8,21]. Глутаминовая кислота была открыта Риттхаузеном (Ritthausen) в 1866 г. и уже к началу 1900-х гг. было установлено, что глутамат – важный компонент нервной ткани. Глутаматергические нейроциты были обнаружены в коре больших полушарий, обонятельной луковице, гиппокампе, черной субстанции, мозжечке, сетчатке [20,2,22].
Общепризнанным является тот факт, что глутамат – основной нейромедиа-тор задних рогов спинного мозга. Он выделяется всеми классами первичных афферентных волокон (в том числе ноцицептивными), а также аксонами многих спинальных нейронов [2,23].
Определение уровня глутамата в сыворотке крови
В июне 2008 г. возникает головокружение и шаткость при ходьбе, сопровождающиеся тошнотой, рвотой, было падение. С диагнозом ОНМК был госпитализирован в РСЦ ОКБ, где пациенту проведено КТ головного мозга, не выявившее очаговой патологии. В течение 2 недель проводилась сосудисто-метаболическая терапия (цераксон, бетасерк, кардиомагнил). За период лечения перестало беспокоить головокружение, неустойчивость при ходьбе сохранялась. Проведено МРТ головного мозга с контрастом, по результатам которой выявлены очаги демиели-низации в мозжечке, копящие контраст. Обратился в центр рассеянного склероза СибГМУ, где установлен диагноз рассеянный склероз. Проведена терапия метил-преднизолоном в общей дозе 5000 мг. Координаторные расстройства уменьшилась. С августа 2008 г. начал терапию ПИТРС (ИФН). В первые 6 месяцев лечения отмечен гриппоподобный синдром. С апреля 2009 г. усиление шаткости при ходьбе и впервые возникли тазовые нарушения в виде задержки мочеиспускания. К неврологу не обращался, МРТ не проводилось. В 2010 г. впервые появилось чувство онемения и неловкости в левой руке. Обратился к неврологу в центр рассеянного склероза СибГМУ. Прошел стационарное лечение в СибГМУ метил преднизолоном 3000 мг, на фоне которого отмечал улучшение, полное восстановление. Проведено МРТ головного мозга без контраста, выявлено появление новых очагов. Продолжает терапию ИФН. В июне 2011 года возникла слабость в ногах и чувство скованности при ходьбе, более выраженное справа. Обратился в центр Рассеянного склероза и прошел стационарное лечение в СибГМУ (солу-медрол 1000 мг № 5), на фоне которого отмечал уменьшение слабости и скованности в ногах. В августе 2011 проведено МРТ головного мозга с контрастом: появление новых очагов. С конца сентября 2011 года отметил ухудшение состояния: усилилась общая слабость, слабость и скованность в ногах, усилилась слабость в руках, заметно ухудшилась память, стало труднее концентрироваться, из-за чего не может выполнять привычную работу, впервые возникло недержание мочи. Проведено стационарное лечение в СибГМУ Солу-медрол 1000 мг № 7. После терапии восстановления не отмечалось. В декабре 2011 года после перенесенной ОРВИ, усилилась слабость и скованность в ногах, возникло поперхивание жидкой пищей, тазовые нарушения (задержка мочи). Госпитализация в НК СибГМУ с целью проведения терапии митоксантроном, учитывая прогрессирование заболевания.
Соматический статус: при физикальном исследовании по органам и системам клинически значимых отклонений не выявлено. Стандартное лабораторное исследование крови и мочи, а также биохимическое исследование крови, коагуло-грамма не выявили отклонений от нормы. ЭКГ без патологии.
Неврологический статус: Общее состояние удовлетворительное. В сознании, в пространстве и времени ориентирован. Контакт с пациентом полный. Походка парапаретическая. Может пройти 300 метров без отдыха. Обоняние сохранено. Глазные щели DS, объем движений глазных яблок полный, нистагма и диплопии нет. Конвергенция сохранена. Реакция зрачков на свет прямая и перекрестная сохранены. Надбровный рефлекс сохранен, D=S. Складки на лбу D=S. Носогубные складки D=S, язык по средней линии, мягкое небо фонирует. Попер-хивание при питье. Дизартрия. Рефлексы орального автоматизма: Хоботковый ±. Верхние конечности: объем движений D - полный, S - полный, сила D – 5 баллов S – 4 балла, тонус сохранен. Рефлексы: периостальные DS высокие, с m.biceps DS высокие, с m.triceps DS высокие. Патологические кистевые знаки: симптом Бехтерева S, симптом Жуковского S, симптом Гоффмана S, Россолимо S и D. Нижние конечности: движения ограничены, правую ногу поднимает на 400, левую на 500. сила D – 3 баллов S – 3 балла, тонус в ногах повышен по спастическому типу. Рефлексы: коленные DS высокие, ахилловы DS высокие. Патологические стопные знаки: все D и S. Симптом Барре «+» с двух сторон. Клонус стоп и коленных чашек. Брюшные рефлексы D и S abs. Чувствительность – поверхностная интактна, мышечно-суставное чувство сохранено, вибрационная чувствительность: руки D и S - норма, ноги D и S по 5 сек. Трофических нарушений нет. В позе Ромберга неустойчив. Координаторные пробы: ПНП – интенционный тремор слева, ПКП – выполняет правильно. Дисметрии нет, адиадохокинеза нет. Функция мочевого пузыря – недержание.
В рассмотренных клинических случаях заслуживают внимания следующие особенности. В 1-ом случае легкая степень инвалидизации, стадия стойкой ремиссии и медленная скорость прогрессирования заболевания сопряжены с более низкой концентрацией глутамата сыворотки 15,24 нмоль/мкл. Во 2-ом случае у пациента отмечена высокая скорость прогрессирования болезни, умеренная степень инвалидизации по шкале EDSS и стадия обострения, которые сопряжены с более высоким уровнем глутамата сыворотки 17,72 нмоль/мкл. Таким образом, можно заключить, что концентрация глутамата не является постоянной константой. Можно предположить, что уровень изучаемого показателя зависит от степени выраженности воспалительного и нейродегенеративного процессов, а также от различных их соотношений при развитии патологического процесса в центральной нервной системе при рассеянном склерозе.
Анализ концентрации глутаминовой кислоты у больных РС
Цель проведенного исследования включала в себя анализ клинических особенностей заболевания, учение уровня глутаминовой кислоты у больных рассеянным склерозом в зависимости от клинических характеристик болезни, а так же оценку ассоциаций полиморфных вариантов генов глутаматэргической системы с клиническими и биохимическими проявлениями заболевания.
В ходе проведенной работы показано достоверно повышение содержания в сыворотке больных возбуждающей аминокислоты глутамата. Установлена связь изменений повышения уровня данной аминокислоты с ремиттирующим типом течения, обострением патологического процесса, легкой степенью инвалидиза-ции, клиническим дебютом в виде пирамидных и чувствительных нарушений, а так же высокой скоростью прогрессирования и длительностью заболевания. Полученные данные отражают высокую значимость глутаматопосредованной эксай-тотоксичности при рассеянном склерозе, что согласуется с ранее представленными сведениями в литературе [136,142,149].
Зарубежные и отечественные авторы указывают на высокий уровень глута-мата при ремиттирующим типе течения в сравнении с прогрессирующими вариантами, в особенности при экзацербации болезни [136,142,149]. В нашем исследовании так же показано увеличение уровня глутамата у больных с РРС, в стадии обострения, вместе с тем, выявлены ассоциации с длительностью патологического процесса.
В целом роль такого важного нейротрансмиттера, как глутамат, способного в физиологических условиях выполнять нейропластическую функцию, а при патологии приводить к эксайтотоксической гибели клеток, была дополнена новыми отношениями с клиническими проявлениями РС.
Исследование генетических маркеров глутаматэргической системы (GRIN2A rs1969060, GRIN2A rs2650427, SLC1A2 rs4354668) у больных РС проводилось впервые. Доказаны ассоциации носительства генотипа GG гена GRIN2A (rs1969060) у больных РС с первично-прогрессирующим типом течения и более поздним (старше 40 лет) возрастным началом заболевания, а носительство генотипа GG гена SLC1A2 (rs4354668) с медленным темпом прогрессирования болезни. Выявлено, что концентрация глутамата сыворотки у больных РС не связана с носительством генотипов ТТ, GT, GG гена SLC1A2. Однако, данные зарубежных авторов, указывают на ассоциацию гена глутаматного транспортера с высоким содержанием глутамата сыворотки у больных РС [136]. Это может быть связано, с генетической гетерогенностью заболевания в разных популяциях. Доказано, что ни один из генотипов генов глутаматэргической системы не ассоциирован с тяжестью инвалидизации и клиническим дебютом болезни.
Таким образом, в работе установлены возможные влияния полиморфизмов исследуемых генов на различные клинические звенья заболевания. Генотипы генов глутаматэргической системы показали свою ассоциацию с типом течения заболевания, а так же со скоростью прогрессирования, как показателя нарастания нейродегенеративного процесса.
Проведенная работа расширяет взгляд на новые аспекты патогенеза РС с точки зрения феномена глутаматопосредованной эксайтотоксичности и его связи с клиническими характеристиками заболевания. Установленные данные расширяют возможности применения полученных знаний в качестве новых диагностических мишеней при РС. Доказана взаимосвязь клинических признаков, биохимических маркеров и генетических параметров в развитии РС. Установленные генетические ассоциации могут быть использованы в качестве предикторов характера течения заболевания и иметь диагностическое значение.
1. Клиническая характеристика рассеянного склероза определяется типом течения, скоростью прогрессирования и степенью выраженности неврологического дефицита. Ремиттирующий тип течения заболевания встречается чаще у молодых лиц, преимущественно женского пола, характеризуется меньшей скоростью прогрессирования и минимальной степенью инвалидизации. Пациенты с вторично-прогрессирующим рассеянным склерозом имеют большую продолжительность болезни и более выраженный неврологический дефицит. У больных первично-прогрессирующим рассеянным склерозом имеются высокая скорость прогресси-рования, более поздний возраст дебюта заболевания и максимально выраженные неврологические нарушения.
2. Уровень глутаминовой кислоты в сыворотке больных рассеянным склерозом достоверно выше, чем у здоровых добровольцев. Уровень глутамата в сыворотке крови больных рассеянным склерозом был достоверно выше по сравнению с группой здоровых лиц у пациентов с ремиттирующим типом течения, в стадии обострения патологического процесса, легкой степенью инвалидизации, быстрой скоростью прогрессирования болезни, длительностью заболевания более 5 лет и клиническим дебютом в виде пирамидных и чувствительных нарушений. Концентрация глутаминовой кислоты у больных рассеянным склерозом в зависимости от гендерной принадлежности значимо не отличалась от соответствующего показателя у здоровых лиц.
3. Частота встречаемости полиморфных вариантов генов глутаматэргиче-ской системы GRIN2A (rs1969060,rs2650427), SLC1A2 (rs4354668) одинакова для общей выборки больных рассеянным склерозом и для группы здоровых лиц.
4. Носительство генотипа GG гена GRIN2A (rs1969060) ассоциировано с первично-прогрессирующим типом течения и более поздним (старше 40 лет) возрастом дебюта заболевания у больных рассеянным склерозом. Медленный темп прогрессирования болезни у больных рассеянным склерозом ассоциирован с но-сительством генотипа GG гена SLC1A2 (rs4354668).
![Эмоциональные нарушения в клинике и течении рассеянного склероза [Электронный ресурс]](/i/i/4364/204596.png "Эмоциональные нарушения в клинике и течении рассеянного склероза [Электронный ресурс] Якимова Вероника Иннокентьевна")
