Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы Этиология, виды церебральных повреждений и нейрохимические аспекты патогенеза гипоксических поражений головного мозга у новорожденных детей . 13-64
1.1. Актуальность проблемы перинатального поражения мозга у недоношенных детей. Этиология и факторы риска церебральных повреждений .
1.2. Патоморфологические изменения в ЦНС при гипоксии.
1.3. Исходы гипоксически-ишемических поражений ЦНС у новорожденных
1.4.Методы диагностики гипоксического перинатального поражения головного мозга (ГППГМ).
1.5. Нейроспецифические белки (НСБ) в биологических жидкостях при ГППГМ.
Глава 2. Материалы и методы. Общая характеристика обследованных новорожденных и методов исследования. 65-81
Глава 3 .Результаты исследований. 82-126
3.1. Характеристика анамнестических данных женщин.
3.2.Клинико-лабораторная характеристика обследованных детей.
Глава 4. Исследование сывороточного уровня нейроспецифических белков S 100, нейротрофического фактора головного мозга (BDNF), цилиарного нейротрофического фактора (CNTF) у новорожденных с перинатальным гипоксическим поражением ЦНС. 127-183
4.1. Результаты иммуноферментного анализа уровня белка астроцитарной глии S-100 в сыворотке крови у новорожденных с перинатальным гипоксическим поражением ЦНС .
4.2. Результаты иммуноферментного анализа сывороточного уровня BNDF у новорожденных с перинатальным гипоксическим поражением ЦНС.
4.3. Результаты иммуноферментного анализа сывороточного уровня цилиарного нейротрофического фактора (CNTF) у новорожденных с перинатальным гипоксическим поражением ЦНС.
Глава 5. Результаты иммуноферментного анализа васкулоэндотелиального фактора (VEGF) и молекулы клеточной адгезии ALCAM в сыворотке крови у новорожденных с перинатальным гипоксическим поражением ЦНС 184-221
5.1. Результаты иммуноферментного анализа васкулоэндотелиального фактора (VEGF).
5.2. Результаты иммуноферментного анализа уровня молекулы клеточной адгезии ALCAM в сыворотке крови у новорожденных с ГППГМ.
Глава 6. Результаты иммуноферментного анализа уровня проапоптотического фактора, маркера апоптоза (DR5), у новорожденных с гипоксическим поражением ЦНС. 222-236
Глава 7. Корреляционные связи изучаемых факторов при различных структурных изменениях головного мозга, их прогностическая значимость . 237-248
Заключение. 249-257
Выводы. 258-259
Практические рекомендации. 260
Список литературы. 261-302
- Актуальность проблемы перинатального поражения мозга у недоношенных детей. Этиология и факторы риска церебральных повреждений
- Результаты иммуноферментного анализа уровня белка астроцитарной глии S-100 в сыворотке крови у новорожденных с перинатальным гипоксическим поражением ЦНС
- Результаты иммуноферментного анализа васкулоэндотелиального фактора (VEGF).
- Корреляционные связи изучаемых факторов при различных структурных изменениях головного мозга, их прогностическая значимость
Введение к работе
lo(d(M(y
Актуальность. Гипоксические повреждения головного мозга занимают
первое место в структуре перинатальных повреждений нервной системы (Volpe
JJ.,1995;CaMCbinffla Г.А.,1996; Яцык Г.В., 1998; Baud О. et al.,2000; Барашнев
Ю.И.,2001), и являются основными причинами перинатальной смертности,
составляя от 20 до 50% в ее структуре, а также факторами возникновения
необратимых структурных дефектов ткани головного мозга (Дементьева Г.М.,
1999 Bernstein I.M., et al., 2000; Петрухин А.С,2004). У 5-15% недоношенных
детей, перенесших гипоксическое поражение ЦНС, впоследствии формируются
выраженные спастические параличи, эпилепсия, поражение органов слуха и
зрения, а у 25-50% детей диагностируется расстройство когнитивных функций
и нарушение поведения. У доношенных детей 50% случаев церебрального
паралича имеет пренатальную этиологию, 36%- пери/неонатального
происхождения и 14% случаев - неизвестного происхождения (Савельева Г.М.и
др.,1993; De Vries L.S.et al.,1998;Campos-Castello J.et al, 1999; Antoniuk S.et
al.,2000; Carteaux P. et al.,2003).
Развивающийся мозг новорожденного чрезвычайно чувствителен к
воздействию гипоксии, которая не только вызывает очаговые повреждения
мозговой ткани, но и задерживает развитие сосудистой системы и нарушает
клеточную дифференциацию. Толерантность у каждого ребенка к воздействию
повреждающих факторов различна. Поэтому при сравнительно равных
условиях у всех детей развиваются неоднозначные последствия (Вельтищев
Ю.Е., Зелинская Д.И.,2000; Agustines L.A. et al.,2000; Володин Н.Н. и
др.2001;Барашнев Ю.И.,2002; McGrath М.,2002; Ment L.R.et а1.,2003).Как
таковой инсульт у новорожденных отличается от инсульта у взрослых не
только локализацией, но и обширностью дистрофических изменений и
задержкой миелинизации нервной системы. Уже доказано, что смерть клеток
при гипоксии происходит не только по типу некротического поражения, но и с
развитием апоптоза клеток, который, в свою очередь, угнетается и
индуцируется факторами специфической и неспецифической защиты (Гусев
Е.И., Скворцова В.И.2001; Гомазков О-іСІЙс^ЩІрмніїША, и др.,2003;
I СЯпсИЬрг/ _* 3
"і" »і і ні ІМИТ Ф
{ 09
McQuillen P.S.etv al.,2003; Ontiniente B.,et al.,2003; Чехонин В.П. и др.,2004; Thomgren-Jemeck К. Et al.,2004).
В настоящее время получено значительное количество новой информации о патогенезе гипоксического перинатального поражения ЦНС, его молекулярных и биологических основах. На биологических моделях установлена многоуровневая система химической регуляции, обеспечивающая жизнеспособность и защиту нейронов от неблагоприятных влияний, и программируемую гибель клеток в случае повреждения мозга с участием многочисленных нейротрофических и ростовых факторов (Schulze-Osthoff K.et al.,1998; Paulson O.B.et al.,2002; Rosenstein J.M.,et al.,2003; Quartu M.et al.,2003; Perrott S. et al.,2003; Schmitz L.et al.,2004).
В связи с этим большой интерес представляет изучение этих факторов и репаративных механизмов, определяющих течение и исходы гипоксии мозга у новорожденных детей, а также установление в сыворотке крови с помощью иммуноферментного метода маркеров деструктивного процесса и состояния ГЭБ при гипоксических поражениях головного мозга в неонатальном периоде.
Все вышеперечисленное определяет актуальность настоящей работы, ее цели и задачи.
Цель работы. Изучить нейрохимические аспекты патогенеза тяжелых гипоксических поражений головного мозга у новорожденных детей, выявить маркеры степени тяжести и оценить их диагностическую значимость.
Задачи исследования.
1. Исследовать факторы, отражающие состояние сосудистой системы головного
мозга (VEGF и ALCAM) и определить их диагностическую значимость при
гипоксическом поражении мозга у новорожденных.
2. Изучить проницаемость гематоэнцефалического барьера при различной
степени тяжести гипоксии мозга на основании определения нейротрофических
белков (BDNF.CNTF) и структурного белка астроцитарной глии (белок S-100)
иммуноферментным методом.
-
Определить уровень маркера апоптоза DR5 и молекулы клеточной адгезии ALCAM в зависимости от гестационного возраста ребенка и степени тяжести асфиксии при рождении в сопоставлении с характером структурных изменений, выявленных методом нейросонографии.
-
Исследовать изменение концентрации нейротрофинов, белка астроцитарной глии S-100, васкулоэндотелиального фактора роста, маркера апоптоза, молекулы клеточной адгезии ALCAM в зависимости от вида изменений на нейросонографии: геморрагический инсульт, ишемический инсульт, смешанный.
-
Выявить корреляционные связи между нейротрофинами, факторами роста, и проапоптотическими факторами при различных видах инсульта у новорожденных, оценить роль каждого фактора в патогенезе постгипоксических структурных изменений мозга: кровоизлияние, лейкомаляция.
-
Установить, какие из исследуемых нейроспецифических белков являются участниками пластического процесса в нервной системе. Выявить факторы пластичности, обеспечивающие способность нервной ткани к репарации.
7. Оценить иммунохимические факторы прогноза жизнедеятельности
организма ребенка в состоянии тяжелой гипоксии и определить
корреляционные показатели выживаемости после перенесенной гипоксии
тяжелой степени.
8. Провести клинико-биохимический анализ значимости исследуемых связей
между антигенами и прогнозированием исхода поражения головного мозга и
степенью восстановления нарушенных функций.
Научная новизна.
Впервые был проведен мониторинг содержания нейротрофических факторов BDNF, CNTF, нейроспецифического белка астроцитарной глии S-100, васкулоэндотелиального фактора роста VEGF, а также исследована концентрация маркера апоптоза DR5 и активность молекулы клеточной адгезии ALCAM у новорожденных детей в норме и при тяжелом гипоксическом поражении ЦНС.
Показано, что в норме в сыворотке крови у новорожденных присутствуют почти все из исследованных факторов: нейротрофины, белок астроцитарной глии, васкулоэндотелиальный фактор роста; в очень низкой концентрации маркер апоптоза DR5 и молекулы клеточной адгезии, ALCAM. Не обнаруживается в норме в сыворотке крови только цилиарный нейротрофический фактор.
Прогноз течения постнатального периода во многом связан с сосудистыми изменениями и ростом сосудистой системы. Для выявления ответа сосудистой системы на гипоксию впервые у новорожденных детей исследованы васкулоэндотелиальный фактор роста и молекула клеточной адгезии ALCAM, динамика концентрации которых в сыворотке крови уже на первой неделе жизни ребенка позволяет с большой вероятностью прогнозировать формирование структурных изменений головного мозга. Выявлена связь сывороточного уровня VEGF с наличием гестоза у матери во время беременности, что свидетельствует об угнетении васкулогенеза у новорожденных, перенесших хроническую внутриутробную гипоксию.
Впервые рассмотрена роль маркера апоптоза, проапоптотического фактора DR5, в патогенезе постгипоксических нарушений у новорожденных. Уровень этого фактора коррелирует с развитием деструктивных процессов и имеет большое значение для ингибирования факторов защиты нервных клеток -нейротрофических и ростовых факторов.
Определены биохимические маркеры повреждения нервной ткани при перинатальном гипоксическом поражении головного мозга. В теоретическом и в практическом плане проведенные исследования позволили раскрыть механизмы нарушений на клеточном и сосудистом уровне. Выяснена роль процесса апоптоза в формировании постгипоксических структурных изменений головного мозга.
Доказано, что у детей с хорошими компенсаторными возможностями даже при тяжелой гипоксии не формируются структурные изменения головного мозга. Это связано с балансом в системе трофических, ростовых факторов и проапоптотических антигенов.
Практическое значение работы.
При формировании тяжелых постгипоксических повреждений головного мозга в виде геморрагического, ишемического или сочетанного инсульта преобладают факторы, сопутствующие деструктивным процессам в ткани мозга (S-100, DR5, ALCAM).
Диагностическую значимость для прогнозирования формирования тяжелых постгипоксических структурных изменений головного мозга имеют все нейроспецифические белки, а для раннего выявления внутрижелудочкового кровоизлияния - цилиарный нейротрофический фактор, CNTF.
Нейротрофический фактор, BDNF, обнаруживается в сыворотке крови в очень малых количествах при гипоксически-ишемических поражениях -перивентрикулярной лейкомаляции и сочетании ПВЛ и ВЖК, что свидетельствует об истощении компенсаторных механизмов и имеет прогностическое значение.
Впервые рассмотрена роль цилиарного нейротрофического фактора. Выявлено, что CNTF проникает через гематоэнцефалический барьер только при развитии кровоизлияний, что позволяет расценивать его как ранний маркер нарушения целостности сосудистой системы мозга. Подтверждено его участие в процессе восстановления пораженной ткани мозга и влияние на выживаемость детей с тяжелыми перинатальными гипоксически-геморрагическими поражениями ЦНС.
Таким образом, в исследовании предложены иммунобиохимические критерии объективизации тяжести и прогноза состояния новорожденных, перенесших тяжелое гипоксическое поражение ЦНС в первые дни заболевания и в течение периода новорожденное. Выделены особенности концентрации исследуемых антигенов в зависимости от гестационного возраста, состояния при рождении, вида структурных изменений, а также в зависимости от исхода заболевания при сравнении по критерию «выжил-умер». Внедрение в практику. Результаты работы внедрены в практическую работу детского корпуса городской клинической больницы № 7; НПЦ медицинской помощи детям с
пороками развития черепно-лицевой области и врожденными заболеваниями нервной системы; входят в программу постдипломного обучения на кафедре нервных болезней педиатрического факультета РГМУ.
Апробация работы. Официальная апробация работы состоялась на совместном заседании кафедры нервных болезней педиатрического факультета и кафедры биохимии РГМУ 02.02.2005г. Номер государственной регистрации темы 01950005768.
Основные положения и результаты исследования представлены в
материалах X конгресса «Человек и лекарство», (Москва,2004); Всероссийской
научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине»
(Казань,2004;2005), Международной конференции «Информационные
технологии в образовании, технике и медицине» (Волгоград,2004);
Всероссийской научной конференции "Фармакотерапия гипоксии и её
последствий при критических состояниях», (Санкт-Петербург,2004);
Всероссийской научной конференции «Микроциркуляция в клинической
практике», (Москва, 2004); III Российского конгресса «Современные
технологии в педиатрии и детской хирургии», (Москва,2004); Пятой
международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в
XXI веке», (Москва,2004); Научно-практического симпозиума «Прогрессивные
аналитические технологии и доказательная лабораторная медицина», (Москва,
2004); VI научно-практической конференции с международным участием
"Санкт-Петербургские научные чтения" (Санкт-Петербург,2004);
Международной научно-технической конференции «Наука и образование-2005», (Мурманск,2005); Всероссийской научной конференции «Медицинские иммунобиологические препараты в 21 веке: разработка, производство и применение», (Уфа, 2005);ГХ Всероссийском форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге»,(2005); X конфесса педиатров (Москва,2005), где работа была нафаждена специальным призом на конкурсе молодых ученых.
Публикации: по теме диссертации опубликовано 35 печатных работ, из них 12 в центральных периодических изданиях.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания общей характеристики больных и методов исследования, 4-х глав собственных наблюдений и их обсуждения, выводов и практических рекомендаций, списка цитируемой литературы из 385 работ, включающего 93 отечественных и 292 зарубежных источника. Работа изложена на 302 страницах, иллюстрирована 59 таблицами, 58 рисунками, 5 схемами, 4 клиническими наблюдениями.
Актуальность проблемы перинатального поражения мозга у недоношенных детей. Этиология и факторы риска церебральных повреждений
Изучение перинатальной патологии нервной системы у новорожденных детей в последнее десятилетие является одной из важнейших проблем не только в неврологии. Перинатальная патология занимает ведущее место в структуре перинатальной заболеваемости и смертности, оказывая влияние на всю дальнейшую жизнь человека[7 8 10)73УрЗл 17Шменно поэтому этот вид патологии можно обозначить как общемедицинскую проблему.
Наиболее актуальным вопросом перинатальной неврологии являются гипоксические повреждения плода и новорожденного, обусловленное хронической внутриутробной гипоксией плода и острой асфиксией в родах. Хроническая внутриутробная гипоксия ведет к разнообразным последствиям поражения головного мозга у детей: от незначительных дизгенезий, не проявляющихся клинически, до грубых аномалий развития ЦНС, приводящим к тяжелым неврологическим исходам, а также к функциональным нарушениям, мешающим ребенку правильно развиваться [9,17)2 Ш4}28,84,?5 6,27 84]и1оследствия перинатальной патологии обуславливают основные неврологические нарушения у детей раннего возраста, занимая первое место среди всей церебральной патологии (60-80%)J3 структуре детской инвалидности заболевания нервной системы занимают первое место, их удельный вес составляет 32, б % [42)84,121,452].
Сочетание различной материнской соматической и акушерской патологии, соотношения своевременных, преждевременных и запоздалых родов, квалификации медицинского персонала влияют на данные о частоте перинатальной гипоксии.
Согласно данным Israel Hospital- клиники Гарвардского Университета [2521частота гипоксии новорожденных составляет 6:100, но в нашей стране эта цифра практические в 3 раза выше. У детей, родившихся с гестационным возрастом менее 36 недель, частота перинатальной асфиксии составляет около 9%, в то время как у родившихся при гестационном возрасте более 36 недель - 0,5 %. В большинстве высококвалифицированных центров средняя частота перинатальной асфиксии составляет около 1-1,17%, при этом она обратно пропорциональна гестационному возрасту. Летальность доношенных детей, родившихся в асфиксии, колеблется в пределах от 10 до 20%. Перинатальная асфиксия является одной из основных причин / перинатальной смертности, составляя от 20 до 50% в ее структуре [4І7,22 37Д 17,252].Частота асфиксии у доношенных детей при токсикозах беременности в 4- раз выше, чем у детей, родившихся у здоровых матерей. При задержке внутриутробного развития плода и родах в ягодичном предлежании частота перинатальной асфиксии увеличивается как у \ / доношенных, так и недоношенных детей435й6 52 8,60 9біі31І225І254].
Гипоксические перинатальные поражения ЦНС разделяют на церебральную ишемию, внутричерепные кровоизлияния (ВЖК) и сочетанные формы поражения. Самые частые формы поражения ЦНС у недоношенных детей представлены двумя видами: геморрагическим и ишемическим инфарктом, последний именуется еще и перивентрикулярной лейкомаляцией (ПВЛ)-многоочаговый распад белого вещества головного мозга
Последствия у выживших детей, перенесших ВЖК и ПВЛ различные так называемых малых: косоглазиекшблиопия минимальные мозговые дисфункции включая гиперактивность, до детского церебрального паралича. Когнитивных нарушений и эпилепсии у 25-50%. Практически все исследователи отмечают корреляцию неблагоприятного исхода с наличием длительной искусственной вентиляции и развитием респираторного дистресс синдрома [11(Л4 7 б7ф 13Гб9Й34/255&5].
Оценка роли неблагоприятных факторов для определения риска повреждения центральной нервной системы (ЦНС) не всегда однозначна. У многих детей высокий риск поражения ЦНС и последующей инвалидности инвалидности предопределен задолго до рождения. Известно, что различные патологические состояния во время беременности. в конечном счете, приводят к гипоксии плода. Опыт показывает, что даже клинически незначимые отклонения в течение беременности могут сыграть решающую роль в формировании нарушений внутриутробного развития. Иногда не представляется возможным установить этиологические факторы поражения мозга новорожденного, и наоборот: у ребенка, родившегося от матери с различным спектром заболеваний и патологическим течением беременности, не обнаруживается какой-либо неврологической патологии [9-1 lQ7j5 8, 7 05 16].
Наивысшую степень риска представляют собой осложнения текущей беременности. Достаточно высокий риск преждевременных родов существует у женщин старше 35 и моложе 20 лет. Доказано, что одним из индикаторов невынашивания беременности являются преждевременные роды в анамнезе. Наличие в анамнезе искусственного прерывания беременности по величине риска невынашивания в исследованиях отечественных авторов занимает первое место, однако, по данным зарубежных авторов этот показатель значим только при рождении детей с массой менее 1000г[61,65,70,75,77,263]. Неудовлетворительное состояние соматического здоровья беременной находит свое отражение в отягощенном акушерском анамнезе. Немаловажными факторами является влияние профессии и характера работы, так риск рождения недоношенного ребенка, велик у женщин, занятых на тяжелой физической работе Влияние вредных привычек - курение, употребление алкоголя и наркотиков — больше определяет задержку внутриутробного развития плода и формирование плацентарной недостаточности. Инфицирование плода и околоплодных вод, наличие плацентита, хориоамнионита - ведет не только к преждевременному рождению, но и способствует развитию интравентрнкулярных кровоизлияниі([67 0,(72,(Гі 9 52 Д25].
Нарушение функции плаценты - одна из основных причин перинатальной заболеваемости и смертности. Плацентарная недостаточность включена в Международную классификацию болезней, травм и причин патологии плода и новорожденного.
Исходом хронической плацентарной недостаточности является хроническая внутриутробная гипоксия, замедление роста и развития новорожденного (врожденная гипотрофия), а также морфофункциональная незрелость. При изучении последствий плацентарной недостаточности выявлены нарушения адаптации новорожденного и дальнейшего развития ребенка, а также высокая частота поражения центральной нервной системы (до 30%)[ 166,467(212,].Плацентарная недостаточность является причиной не только нарушения роста и развития плода, но и глубоких изменений обменных процессов у новорожденных. В частности, кислородная недостаточность приводит к характерным изменениям метаболизма, гемодинамики и микроциркуляции при рождении у каждого второго ребенка и нарушает процессы адаптации в первые дни жизни у 50-75% детей. В настоящее время значительное количество женщин имеют возможность пролонгировать течение беременности, что влияет на увеличение рождения детей с внутриутробной гипотрофией и морфофункциональной незрелостью и перинатальным поражением ЦНС. Таким образом, к основным этиологическим факторам перинатального гипоксического поражения мозга относятся следующие:
1 Причиной хронической внутриутробной гипоксии плода в большинстве случаев являются гестозы, фето-плацентарная недостаточность, заболевания беременной, сопровождающиеся гипоксемией и гипоксией.
2:Острая гипоксия (асфиксия) возникает в результате нарушения маточно-плацентарного кровообращения в родах при преждевременной отслойке плаценты, пролапса пуповины, тяжелых кровотечений у роженицы, гипотензии, гипертонуса и разрыва матки, а также при замедлении кровотока
3 ."Асфиксия новорожденного при рождении в большинстве случаев является следствием гипоксии (асфиксии) плода.
Причиной постнатальной асфиксии являются острая тяжелая анемия (массивное кровотечение у новорожденного, гемолитическая болезнь), шок (кровоизлияние в надпочечники, генерализованная инфекция), тяжелые врожденные пороки сердца, диафрагмальная грыжа, атрезия хоан, гипоплазия легких, наркотическая депрессия вследствие наркоза у роженицы.
Результаты иммуноферментного анализа уровня белка астроцитарной глии S-100 в сыворотке крови у новорожденных с перинатальным гипоксическим поражением ЦНС
В контрольной группе уровень белка S-100 в сыворотке крови составлял 0,18-0,3 мкг/мл во все дни наблюдения. Достоверных различий между показателями у доношенных и недоношенных новорожденных выявлено не было, MbfcSD: 0,2±0,08 мкг/мл.
При анализе полученных данных нами было выявлено, что исходные уровни сывороточной концентрации белка S-100, определенные в первые сутки жизни, были максимальными у всех обследованных пациентов.
На основании результатов исследования мы изучили динамику концентрации антигена у новорожденных в зависимости от гестационного возраста, состояния при рождении и различных типах структурных поражений головного мозга, определяемых методом нейросонографии.
По сроку гестации наблюдаемые новорожденные были разделены на 3 группы: до 32 недели, 32-37 недель, и 38-4Д, недели. Каждая группа была разделена на 2 подгруппы: со структурными изменениями на НСГ (подгруппа Б) и без них (подгруппа А).
При сравнении динамики сывороточной концентрации белка S-100 у детей по гестационному возрасту в зависимости от наличия структурных изменений на НСГ были получены следующие данные (таблица 8,рисунок 8).
Максимальные значения антигена во всех группах регистрировалось в \ / первые 48 часов жизни отмечалось увеличение сывороточной концентрации белка s(oo от 3 до 12 раз. Затем наблюдалось их постепенное снижение.
При сравнении полученных данных самые высокие уровни концентрации белка S-100 были у недоношенных детей первой группы со структурными изменениями (ВЖК и ПВЛ) на НСГ. У них отмечалось повышение концентрации антигена более, чем в 10 раз по сравнению с в верхней границей нормы, и в среднем равнялось 2,67±0,04 мкг/л. Возможно, что это связано с ранним ответом глиальных элементов на гипоксию — ишемию, а также начавшимися деструктивными изменением в клетках мозга. В группах новорожденных со структурными изменениями головного мозга на НСГ с гестационным возрастом 32-37 недель и 38-41 неделя сывороточный уровень S-100 в первые сутки жизни был равен соответственно 2,46±0,06 мкг/л и 2,35±0,02мкг/л.
При динамическом наблюдении значения сывороточной концентрации S-100 у новорожденных со структурными изменениями на НСГ были значительно выше нормативных, достоверные различия сохранялись до 21 суток жизни (р 0.01). Максимальные значения антигена отмечались в 1 Б группе.
При анализе полученных данных у детей без структурных изменений на НСГ (подгруппы А), пик концентрации антигена S-100 также отмечался в первые сутки жизни. Средние значения были равны 0,9 мкг/мл, т.е. увеличение по сравнению с нормативным было не более чем в 3 раза. Возможно, это повышение сывороточного уровня S-100 связано с нейротрофическими свойствами, присущими белку, и обеспечивало необходимую защитную реакцию клеткам мозга в остром периоде гипоксического поражения.
В течение дальнейшего наблюдения у новорожденных без структурных изменений головного мозга на НСГ также регистрировалось снижение концентрации антигена. Несколько быстрее это процесс происходил в группах с гестационным возрастом 32-37 недель и 38-4Д,недел#.
Длительное, более 14 суток жизни, сохранение повышенной концентрации белка S-100 связано с увеличением частоты формирования тяжелого поражения ЦНС, а также, возможно, с активной пролиферацией микроглии при деструктивном процессе. Наиболее высокие уровни исследуемого антигена прямо коррелировали с неблагоприятным неврологическим прогнозом и формированием структурных изменений на НСГ.
У детей во вторых подгруппах (Б) каждой группы с развившимися постгипоксическими поражениями в виде внутрижелудочковых кровоизлияний и/или перивентрикулярной лейкомаляции с последующей кистозной дегенерацией или с сочетанным поражением - значения сывороточной концентрации белка S-100 были выше в 2,5-3 раза на протяжении первого месяца жизни по сравнению с детьми, у которых не было выявлено аналогичных изменений на НСГ.
Группы сравнивались между собой по методу Манна-Уитни с использованием дисперсионного анализа (ANOVA). Внутри группы переменные сравнивались знаково-ранговым методом Вилкоксона.
При проведении статистической обработки данных по методу Вилкоксона достоверные различия (р 0.01) были определены в показателях сывороточной концентрации между всеми исследуемыми данными в каждой группе, т.е. уровень белка S-100 каждой пробы достоверно различался между собой.
После проведения дисперсионного анализа (ANOVA), для получения более точной информации проводились апостериорные сравнения средних значений сывороточной концентрации белка S-100 (таблица 9).
Тяжесть асфиксии при рождении, определяемая по шкале Апгар, во многом влияет на состояние детей в неонатальном периоде и коррелирует с формированием структурных изменений головного мозга.
Для анализа изменений сывороточной концентрации S-100 в зависимости от оценки по Апгар на 1-й минуте были сформированы две группы: новорожденные с оценкой 0-4 балла; новорожденные с оценкой 5-8 баллов.
Максимальные значения антигена были отмечены независимо от оценки по Апгар на 1-й минуте в 1-е сутки жизни у всех новорожденных. Однако у детей, родившихся в состоянии тяжелой асфиксии (0-4 балла), в первые сутки, показатели сывороточной концентрации белка S-100 были существенно выше нормативных значений (в 9-10 раз) и составляли в среднем 2,49±0,13 мкг/л.
У новорожденных с оценкой по Апгар на 1-й минуте 5-ф баллов отмечалось повышение концентрации белка S-100 в 2-3 раза и в среднем регистрировались значения 1,1 ±0,08 мкг/л.
В дни дальнейшего наблюдения характер изменений концентрации был идентичен, но значения сывороточного уровня S-100 у новорожденных с тяжелой асфиксией при рождении были выше почти в 2 раза, чем у новорожденных с оценкой по Апгар 5-#- баллов, что свидетельствует о более высокой проницаемости ГЭБ для S-100 при тяжелой асфиксии. Данные представлены в таблице 10 и на рисунке 9.
Результаты иммуноферментного анализа васкулоэндотелиального фактора (VEGF).
Анализ полученных данных выявил, что концентрация васкулоэндотелиальпого фактора роста во всех исследуемых группах характеризовалась значительной разницей между минимальными и максимальными значениями.
Концентрация данного антигена в контрольной группе находилась в интервале от 122 до 400 мкг/л; M±SD: 200,125±49,73 мкг/л.
Необходимо было проанализировать динамику изменения концентрации VEGF в зависимости от гестационного возраста, состояния при рождении, вида структурного поражения головного мозга, определяемого методом нейросонографии, а также в зависимости от исхода заболевания.
По гестационному возрасту, наблюдаемые новорожденные были разделены на 3 группы: I - до 32 недели (26-31), II - 32-37 недель и III - 38-42 недели. Пробы крови производились на 1-2 сутки жизни (24 - 48 часов), 7-е и 28-е сутки. Результаты ИФА VEGF(i65) в сыворотке крови представлены в таблице 31 и на рисунке 32.
В первые 48 часов жизни, максимальные средние значения сывороточной концентрации VEGF имели место у доношенных детей с ГШШГМ и составляли в среднем - 243,165±153,63 мкг/л (27,11-657,96 мкг/л), что соответствовало нормативным показателям (контрольная группа). У новорожденных с гестацпонным возрастом 26-31 неделя уровень антигена был достоверно ниже контрольной группы - 86,145±92,45 мкг/л (18,8-288,11 мкг/л, р 0,01), а у детей с ГВ 32-37 недель соответствовал нижней границе нормы - 126,14±106,95 мкг/л (30,08-653, 85 мкг/л).
В последующих пробах (7-е и 28-е сутки жизни) концентрация белка увеличивалась и достигла уровня контрольных значений во всех группах. Достоверные различия (р 0,01), в показателях концентрации VEGF на 7-е сутки жизни, отмечались в I и III группе детей и составляли соответственно 158,175±91,97 мкг/л (26-31 недель) и 235,43±150,29 мкг/л, что отражало менее ускоренную динамику увеличения концентрации исследуемого антигена у недоношенных новорожденных с самым маленьким гестационным возрастом.
Сравнение средних значений сывороточного уровня концентрации VEGF в одинаковых по ГВ группах у детей с ГИГШ ГМ без структурных изменений на НСГ (подгруппы А) и с наличием таковых (подгруппы Б) выявило ряд существенных отличий. Данные представлены в таблице 32. Рисунок 33 отражает динамику сывороточной концентрации васкулоэндотелиального фактора роста по тем же параметрам.
Анализ результатов дает возможность сделать вывод о том, что у всех детей без структурных изменений на НСГ отмечалась тенденция к росту концентрации антигена с 1-х по 28-е сутки жизни (I III проба), вероятно, за счет выброса АГ в кровоток, что являлось отражением активации репаративных возможностей организма (васкулогенез), с максимальным уровнем в III пробе у новорожденных 32-37 недель - 555,44±248,35 мкг/л. Показатели последней пробы (28-е сутки жизни) достоверно превышали нормативные (р 0,01) у всех детей данной подгруппы (А).
У новорожденных со структурной патологией головного мозга по данным ультразвукового сканирования, напротив, фиксировалось постепенное снижение сывороточной концентрации васкулоэндотелиальпого фактора к концу исследования ("срыв" процессов восстановления). У детей с гестационным возрастом до 38 недели исходные значения были ниже нормативных значений в 1Б группе и на нижней границе нормы в ЗБ группе. К 4-й неделе жизни в 1А и группе снижение по сравнению с исходными величинами было на 30%, во 2Б - на 50%, в ЗБ- в 4 раза ; средние показатели концентрации были равны в этих подгруппах: 57,1- 69,1 мкг/л, то есть в 2 раза ниже нижней границы нормы.
Б) Уровень VEGF в сыворотке крови у детей с различной степенью тяжести при рождении.
Все обследуемые дети были разделены на 3 группы с учетом оценки по шкале Апгар: 1 группа - 0-4 балла, 2 - 5-7 баллов.
Показатели средней концентрации VEGF в зависимости от тяжести интранаталыюй асфиксии представлены в таблице 34 и на рисунке 34.
На основе полученных значений сывороточной концентрации васкулоэндотелиальпого фактора прослеживалась обратная зависимость степени тяжести состояния от величины исследуемого антигена. За время исследования в обеих группах к 28 суткам отмечен рост уровня VEGF. Достоверных различий по сравнению с контрольной группой при таком разделении выявлено не было (по методу Манна-Уитни).
При сравнении концентрации VEGF у новорожденных с острой тяжелой и умеренной асфиксией по методу Манна-Уитни были выявлены различия во всех пробах, концентрация антигена у новороженных с умеренной асфиксией была достоверно выше, чем у при тяжелой асфиксии (р 0,01). Выявлены различия в концентрации внутри групп (по методу Вилкоксона). В группе новорожденных с оценкой по Апгар 0-4 балла достоверно (Р 0,05) отличались показатели 1-й и 2-й и 1-й и 3-й пробы. У новорожденных с умеренной асфиксией при рождении различия в концентрации антигена выявлены между 1-й и 3-й пробой.
В) Уровень VEGF в сыворотке крови детей с различными структурными поражениями ЦНС.
В нашем исследовании особую роль играло изучение сывороточной концентрации данных антигенов в зависимости от вида повреждения мозга. Для этого производилось деление на группы с учетом структурных изменений при ультразвуковом сканировании:
I - новорожденные, у которых на НСГ обнаруживалось повышение перивентрикулярной эхогенности, от умеренной до выраженной, обозначаемой в протоколах описания как (++) и (+++) соответственно — (27 и 18 детей)
II - новорожденные с перивентрикулярное лейкомаляцией (15 детей)
III - новорожденные с внутрижелудочковыми кровоизлияниями (15 детей)
IV - новорожденные с сочетанием внутрижелудочкового кровоизлияния и перивентрикулярной лейкомаляции (15 детей).
Наряду с контрольной, группой сравнения была первая. В нее входили дети, перенесшие гипоксию - ишемию мозга и не имеющие структурных нарушений на НСГ, но с верифицированными изменениями в виде гиперэхогенности перивентрикулярной зоны. Новорожденные в данных группах были сопоставимы по ГВ, состоянию при рождении, клинической симптоматике и объему оказанной медицинской помощи.
Значения средних уровней сывороточной концентрации VEGF, полученные в группах с различными по характеру изменениями на НСГ представлены в таблице 35 и на рисунке 35.
Корреляционные связи изучаемых факторов при различных структурных изменениях головного мозга, их прогностическая значимость
Проведя многофакторный анализ динамики исследуемых антигенов в зависимости от гестационного возраста, состояния при рождении, наличия или отсутствия структурных изменений головного мозга на нейросонографин, мы пришли к заключению, что наиболее показательным для сравнения является их соотношение при различных типах структурных поражений головного мозга.
Приводим корреляционные связи исследуемых антигенов при каждом варианте структурных изменений головного мозга. Данные представлены в таблице 53.
Характеризуя корреляционые связи у детей без структурных изменений головного мозга на НСГ, можно отметить, что уровни трофических и ростовых факторов были в обратной зависимости от уровней фактора апоптоза, молекулы клеточной адгезии. Отмечался наиболее высокий уровень трофических и ростовых факторов как исходно, так и в динамике, уровни деструктивных показателей в этой группе были самыми низкими. Уровень BDNF не коррелировал с уровнем S-100. Возможно, это связано с тем, что концентрация S-100 здесь увеличивалась незначительно, и белок реализовал свои нейротрофические свойства (рисунок 56).
Таким образом, у детей с гипоксическим поражением мозга и без структурных изменений хорошо выражены трофические функции нервных клеток за счет адекватного синтеза нейротрофнческнх и ростовых факторов и ингибирования процессов апоптоза.
У новорожденных с ПВЛ прямые корреляционные связи были выявлены между уровнем S-100 в сыворотке крови и уровнем маркера апоптоза DR5 и молекулы клеточной адгезии ALCAM, обратные с уровнем нейротрофпческого фактора BDNF, то есть, чем выше была концентрация факторов, влияющих на тканевую деструкцию, тем больше снижалась способность клеток к синтезу нейротрофина (рисунок 57).
У новорожденных с ПВЛ BDNF прямо коррелировал с уровнем васкулоэндотелиального фактора в сыворотке крови к концу первой неделе жизни.
В условиях поражения тканей VEGF является ингибитором процессов апоптоза. У новорожденных с ПВЛ маракер апоптоза находился в обратной зависимости от концентрации VEGF , что также это доказывает.
Факторы, участвующие в процессе апоптоза и воспаления (ALAM и DR5) находились в прямой корреляционной зависимости друг от друга, чем выше была концентрация DR5, тем больше был сывороточный уровень ALAM.
Таким образом, при тяжелом гипоксически-ишемическом поражении ЦНС у новорожденных с развитием ПВЛ отмечено достоверное влияние факторов клеточной деструкции на синтез трофических антигенов.
При анализе корреляционных зависимостей у новорожденных с ВЖК и сочетанным поражением головного мозга (ВЖК и ПВЛ) дополнительно оценивались связи с цилиарным нейротрофическим фактором (CNTF).
Анализируя корреляционную зависимость между изучаемыми факторами у новорожденных с ВЖК, мы выявили, что повышение уровня S-100 в крови не зависело от уровня BDNF, но находилось в обратной зависимости от цилиарного нейротрофического и васкулоэнлотелиального факторов. Возможно, отсутствие связи между S-100 и BDNF вызвано резким повышением концентрации BDNF в сыворотке крови уже в первые сутки жизни, что обусловлено и повреждением гематоэнцефалического барьера и, возможно, лучшим синтезом этого фактора при развитии изолированного ВЖК. Увеличение BDNF также могло быть стимулировано распадом форменных элементов крови, в частности, дегрануляцией тромбоцитов.
Отмечена прямая корреляционная зависимость между белком S-100 и факторами, индуцирующими апоптоз-DRS и ALCAM. У индукторов апоптоза фиксировались обратные корреляционные связи в васкулоэндотелиальным фактором VEGF.
Уровень цилиарного нейротрофического фактора в сыворотке крови к концу второй недели жизни прямо коррелировал с мозговым нейротрофическим фактором и обратно с белком астроцитарной глии S-100.(рисунок58)
Корреляционные связи между специфическими и неспецифическими факторами патогенеза перинатального гипоксического поражения головного мозга у новорожденных с сочетанным поражением головного мозга характеризовались следующими особенностями.
Концентрация в сыворотке крови факторов, способствующие деструктивным изменениям в тканях (S-100, DR5, ALCAM) находилась в обратной корреляционной зависимости от уровня мозгового нейротрофического и васкулоэндотелиального факторов. Последние имели прямую корреляционную зависимость между собой, и VEGF прямо коррелировал с концентрацией цилиарного нейротрофического фактора к концу второй недели жизни. То есть эта корреляционная зависимость подчеркивает, что развитие сочетанного поражения головного мозга с формированием перивентрикулярной лейкомаляции на фоне внутрижелудочкового кровоизлиянии имеет предпосылки практически сразу после рождения ребенка группы риска, а уменьшение синтеза трофических и ростовых факторов на фоне индукции проапотпотических факторов способствует снижению васкуляризации и развитию глиоза ишемизированной ткани. Уровни маркера апоптоза и молекулы клеточной адгезии прямо коррелировали между собой.
Взаимосвязь индукторов и ингибиторов процесса апоптоза у новорожденных с перинатальным пшоксическим поражением головного мозга при формировании структурных изменений свидетельствует об угнетении нейротрофических факторов, и преобладании проапоптотическнх антигенов. У детей этой группы отмечались самые высокие уровни маркера апоптоза и молекулы клеточной адгезии, а также максимальный исходный уровень белка астроцитарной глпи S-100. Нейротрофический фактор BDNF был минимальным по сравнению с новорожденными других групп. VEGF был ниже, чем у других детей, как в начале наблюдения, так и к 28-м суткам жизни (в 2 раза ниже нижней границы нормы).
Данные, характеризующие корреляционные связи между уровнями исследуемых факторов и формированием постгипоксических структурных изменений головного мозга представлены в таблице 57.
Факторы, определяющие выраженность деструктивного и воспалительного процесса (S-100, DR5, ALCAM) находились в прямой корреляционной связи с формированием постгипоксических структурных изменений головного мозга у новорожденных.
Нейротрофические факторы: уровень BDNF в сыворотке крови в раннем неонатальном периоде находился в обратной зависимости с формированием постгипоксических ишемических поражений: чем ниже был его уровень, тем с большей вероятностью у ребенка формировалась перивентрикулярная лейкомаляция. Цилиарный нейротрофический фактор прямо коррелировал с формированием гипоксически-геморрагических нарушений.
Концентрация васкулоэндотелиального фактора в сыворотке крови в раннем неонатальном периоде не коррелировала с формированием структурных изменений головного мозга на НСГ.
В работе также выявлено влияние исследуемых антигенов на летальный исход заболевания. Данные представлены в таблице 58.
