Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Наследственные нервно-мышечные заболевания 14
1.1. 1. Прогрессирующие мышечные дистрофии 14
1. 1. 1. 1. Х-сцепленные ПМД Дюшенна и Беккера (дистрофинопатии) 14
1. 1. 1. 2. Конечностно-поясные ПМД 16
1. 1. 1. 3. Лице-лопаточно-плечевые ПМД 17
1. 1. 1. 4. Миотоническая дистрофия 18
1.1. 1. 5. Офтальмоплегическая миопатия 20
1.1. 1.6. ПМД Эмери-Дрейфуса 20
1.1. 1. 7. Окулофарингеальная ПМД 21
1. 1. 2. Сшшальные амиотрофии 21
1. 1.2. 1. Проксимальные С А детского возраста 21
Оглавление
Список аббревиатур 6
Введение 8
Глава I. Обзор литературы 14
1. 1. Наследственные нервно-мышечные
, заболевания f 14
1. 1. 1. Прогрессирующие мышечные дистрофии 14
1.1. 1. 1. Х-сцепленные ПМД Дюшенна и Беккера
(дистрофинопатии) 14
1. 1. 1. 2. Конечностно-поясные ПМД.. 16
1. 1. 1. 3. Лице-лопаточно-плечевые ПМД 17
1. 1. 1. 4. Миотоническая дистрофия 18
1. 1. 1. 5. Офтальмоплегическая миопатия 20
1. 1. 1.6. ПМД Эмери-Дрейфуса 20
1. 1. 1. 7. Окулофарингеальная ПМД 21
1. 1. 2. Сшшальные амиотрофии 21
1. 1.2. 1. Проксимальные СА детского возраста 21
1. 1.2. 2. ДистальныеСА 22
1. 1. 2. 3. Спинально-бульбарная амиотрофия Кенне ди 23
1. 1.3. Наследственные моторно-сенсорные невропа
1. 1.3. IVДемйелишїзируюїдие моторно-сёнсорныё невропатии
1.2. Наследственные заболевания с преимущественным во влечением экстрапирамидных систем 28
1. 2. І.Ювенильньїй паркинсонизм 29
1.2.2. Болезнь Гентингтона 33
1. 2. 3. Гепатолентикулярная дегенерация 35
1. 2. 4. Торсионная дистония 41
1.3. Наследственные атаксии 43
1.3.1. Аутосомно-доминантные спиноцеребеллярные атак сии 43
1. 3. 2. Болезнь Фридрейха 53
1.4. Наследственные заболевания с преимущественным вовлечением пирамидной системы (наследственные спастические параплегии) 54
1.5. Роль медико-генетического консультирования в неврологии 58
Глава 2. Материал и методы исследования 61
2. 1. Популяционно-географическая характеристика Хабаровского края. Историко-этническая справка 61
2. 2. Сбор информации о больных 68
2. 3. Общая характеристика обследованных больных 69
2.4. Методы исследования 70
2. 4. 1. Лабораторные и инструментальные методы обследования 70
2.4.2. Молекулярно-генетический анализ 71
2. 4.2.1. Анализ экспансии тринуклеотидных повторов...72
2. 4. 2. 2. ДНК-диагностика АР спинальных амиотрофий..73
2. 4. 2. 3. ДНК-диагностика НМД Дюшенна 74
2. 4. 2. 4. ДНК-диагностика НМСНІА 76
2. 4. 2. 5. ДНК-диагностика НМСН ПА 76
2. 4. 2. 6. ДНК-диагностика ЮП 78
2. 4. 2. 7. ДНК-диагностика ГЛД 80
2. 4. 7. 8. ДНК-диагностика НСП 80
2.4. 3. Статистический анализ 81
Глава 3. Результаты исследования 82
3.1. Наследственные нервно-мышечные болезни 82
3. 1. 1. Прогрессирующие мышечные дистрофии 82
3. 1. 1. 1. Дистрофинопатии 83
3. 1. 1. 2. Конечностно-поясные ПМД 96
3.1. 1. З.ПМДЛандузи-Дежерина 96
3. 1. 1. 4. Миотонические дистрофии 99
3. 1.1. 5. ПМД Эмери-Дрейфуса 103
3. 1. 1.6. Другие формы ПМД 104
3. 1. 2. Спинальные амиотрофии 105
3. 1. 3. Наследственные моторно-сенсорные невропатии 107
3.1. 4. Миотония Томсена 123
3.2. Наследственные заболевания с преимущественным во влечением экстрапирамидных систем 124
3. 2. 1. Ювенильный паркинсонизм 124
3. 2. 2. Болезнь Гентингтона 138
3. 2. 3. Гепатолентикулярная дегенерация 140
3. 2. 4. Торсионная дистония 147
3. 3. Наследственные атаксии 148
3. 3. 1. АД спиноцеребеллярные атаксии 148
3. 3. 2. Другие формы наследственных атаксий 160
3. 4. Наследственные спастические параплегии 162
3. 5. Нейрофизиологические исследования 164
3. 5. 1. Электронейромиография 164
3. 5. 2. Вызванные потенциалы 169
3. 5. 2. 1. Зрительные вызванные потенциалы 169
3. 5. 2. 2. Акустические стволовые вызванные потенции алы 171
3. 6. ДНК-диагностика 176
Глава 4. Обсуждение результатов 179
4. 1. Распространенность НЗНС в популяции Хабаровского края 179
4. 2. Клинико-генетическое разнообразие НЗНС 188
4. 2. 1. Прогрессирующие мышечные дистрофии 189
4. 2. 2. Спинальные амиотрофии 190
4. 2. 3. Наследственные моторно-сенсорные невропатии... 190
4. 2. 4. Наследственные заболевания с преимуществен
ным вовлечением экстрапирамидных систем 193
4. 2. 5. Наследственные атаксии 196
4.2.6. Наследственные спастические параплегии 197
Выводы 198
Практические рекомендации 201
Список литературы
- Миотоническая дистрофия
- Офтальмоплегическая миопатия
- Общая характеристика обследованных больных
- Наследственные заболевания с преимущественным во влечением экстрапирамидных систем
Миотоническая дистрофия
Прогрессирующие мышечные дистрофии (ПМД) - клинически и генетически гетерогенная группа наследственных заболеваний, характеризующаяся первичным поражением скелетной мускулатуры невоспалительного характера.
Х-сцепленные ПМДДюшенна и Беккера (дистрофинопатии) ПМД Дюшенна и Беккера (дистрофинопатии) относятся к самым частым формам мышечных дистрофий (1,00 : 3500 и 1,00 : 20 000 рожденных мальчиков, соответственно), наследуются по Х-сцепленному рецессивному типу. ПМД Дюшенна начинается в возрасте 3-6 лет, к 12 годам дети прикованы к инвалидной коляске, к 20 годам больные погибают от дыхательной недоста 15 точности и патологии сердца. Форма Беккера является «мягким» клиническим вариантом ПМД Дюшенна с более поздним началом (в 12-15 лет), относительно доброкачественным течением, длительной компенсацией двигательных функций.
ПМД Дюшенна и Беккера - аллельные заболевания, обусловленные мутацией гена дистрофина в хромосомном локусе Хр21. При ПМД Дюшенна выявляют мутации, повреждающие рамку считывания кодирующей области гена или нарушающие структуру функционально значимых доменов дистрофина, что приводит к полному отсутствию дистрофина, а при ПМД Беккера имеются внутренние делеции или дупликации гена, приводящие к низкому уровню «усеченного» дистрофина с частичной функциональной активностью (Иллари-ошкин С. Н. и др., 2002; Blake D. J. et al., 2002). К группе дистрофинопатий относится и необычный синдром - крампи с рецидивирующей миоглобинурией и сниженной толерантностью к физическим нагрузкам (Иллариошкин С. Н. и др., 2002).
ПМД Дюшенна встречается практически во всех популяциях, среди представителей разных национальностей. Распространенность заболевания составляет в среднем 6,00 : 100 000 населения и колеблется от 1,00 до 10,00 на 100 000 населения. В ряде стран (Шотландия, Дания, Франция, Канада, Австралия, Новая Зеландия, Германия) частота миопатии Дюшенна определена по данным скрининга новорожденных (определение активности креатинфосфо-киназы, последующее исследование в мышцах дистрофина и проведение ДНК-диагностики) и составляет в среднем 24,10 на 100 000 новорожденных (Руден-ская Г. Е. и др., 1996; Неретин В. Я. и др., 2004). Высокая распространенность ПМД Дюшенна отмечается на Украине (10,20 : 100 000 населения), в Норвегии (10,90 : 100 000 населения), в Канаде (9,50 : 100 000 населения); средние показатели в Нидерландах - 6,60 : 100 000 населения, в США - 6,70 : 100 000, в Японии - 6,70 : 100 000; в Швеции и Ирландии - 2,50 и 2,40 на 100 000 населения соответственно. В России наиболее высокая распространенность ПМД Дюшенна отмечается в республике Марий Эл - 7,20 : 100 000 населения, в Са 16 марской области - 5,60 : 100 000 населения; в остальных краях и областях - на уровне 2,00—4,40 : 100 000 населения (Гитер П. Л., 1991; Руденская Г. Е. и др., 1996). Распространенность ПМД Беккера в России - 0,20-0,40-0,90 : 100 000 населения, в других странах - 0,50-2,40 : 100 000 населения (Руденская Г. Е. и др., 1996).
Конечностно-поясные ПМД Конечностно-поясные ПМД (КПМД) характеризуется началом заболевания с мышц тазового пояса и бедер с последующим вовлечением мускулатуры плечевого пояса и проксимальных отделов рук и постепенной генерализацией процесса. КПМД могут передаваться по АД и АР типам (соответственно, КПМД1 и КПМД2). Значительно более частым является АР тип КПМД. Идентифицированы 11 генетических дефектов КПМД2 (Wicklund М. P. et al., 2003). КПМД2 делятся на 3 группы: саркогликанопатии, кальпаинопатии, дисферли-нопатии (Иллариошкин С. Н. и др., 2002). К саркогликанопатиям относятся КПМД2С, обусловленная мутациями гена у-саркогликана на хромосоме 13ql2, КПМД2Д, обусловленная мутациями гена а-саркогликана на хромосоме 17ql2-21.33, КПМД2Е, вызываемая мутациями гена Р-саркогликана на хромосоме 4ql2, КПМД2Р, связанная с мутациями гена 8-саркогликана на хромосоме 5q33-34. К кальпаинопатии относят КПМД2А, вызванную мутациями в гене на хромосоме 15ql5.1; к дисферлинопатии - КПМД2В, обусловленную мутациями в гене дисферлина на хромосоме 2р13. Аллельными вариантами дисферлинопатии являются редкие формы дистальных ПМД - миопатия Миоши и тибиальная дистальная миопатия (Bansal D. et al., 2003; Prelle A. et al., 2003; Tagawa K. et al., 2003). Вариант КПМД2С обусловлен мутациями в гене белка телетонина (хромосома 17qll-12), КПМД2Н - мутациями в гене TRIM (хромосома 9q31-q34); КПМД2І - мутациями в гене FKRP (хромосома 19ql3.3), КПМД2Д - мутациями в гене белка титина на хромосоме 2q31; КПМД2К - мутациями в гене РОМТ1 на хромосоме 9q34 (Рорре М. et al., 2003; Wicklund М. P. et al., 2003). Распространенность АР КПМД составляет 2,00-4,00 : 100 000 населения практически во всех популяциях. Высокая распространенность КПМДО - 8,45 : 100 000 населения - наблюдается среди туркменского населения Ашгабада; в других среднеазиатских популяциях не выявлено повышенной отягощенности данной формой - 1,99-3,94 : 100 000 населения (Багыева Г. X., 1999). В Азербайджане распространенность КПМДО составила 2,35 : 100 000 населения; в России наиболее низкий показатель отмечается в республике Марий Эл - 2,25 : 100 000, наиболее высокий - в Архангельской области - 5,00 : 100 000; за рубежом - 0,35-4,36 : 100 000 населения (Багыева Г. X., 1999).
Аутосомно-доминантные конечностно-поясные мышечные дистрофии (АД КПМД) являются более редкими, составляя около 10,0 % среди всех случаев КПМД (Иллариошкин С. Н. и др., 2002). Известны семь генетических ло-кусов АД КПМД - на хромосомах 5q22.3-31.3 (форма КПМД1А), lqll-21(КПМД1В), Зр25 (КПМД1С), 7q (КПМД1Д), 6q23 (КПМД1Е), 7q32 (КПМД1Р), 4р21 (КПМДЮ). Форма КПМД1А обусловлена мутацией структурного саркомерного белка мышечных волокон миотилина, форма КПМД 1С -мутацией мышечного белка кавеолина-3, форма КПМД 1В является аллельной с АД прогрессирующей мышечной дистрофией Эмери-Дрейфуса и обусловлена мутацией гена ламина А/С, кодирующего белки ламины - компоненты ядерной мембраны. Сведения о распространённости АД формы КПМД немногочисленны. В Самарской области распространённость составляет 0,90 : 100 000 населения (Скупченко В. В. и др., 2001). По данным Руденской Г. Е. и др., 1996, распространенность АР и АД КПМД составляет от 0,35 до 5,00 на 100 000 населения.
Офтальмоплегическая миопатия
Всем больным проводился общий анализ крови и мочи, исследовался развернутый биохимический анализ крови, по показаниям проводилось исследование уровня креатинфосфокиназы в крови, показателей медного обмена.
Электрокардиография проводилась на электрокардиографе «Cardiofax 8110», фирма «Nichon-Konden», Япония, по стандартной методике.
Электроэнцефалография проводилась на 64-канальном электроэнцефалографе фирмы «Nichon-Konden», 10-канальном электроэнцефалографе фирмы МБН (г. Таганрог).
Электронейромиографическое обследование (ЭНМГ) проводилось на че-тырёхканальном «Электронейромиографе 4» фирмы Нейрософт (г. Иваново). ЭНМГ-исследование включало глобальную ЭМГ, определение скорости распространения возбуждения по двигательным волокнам периферических нервов, определение F-волны, игольчатую ЭМГ.
Нейровизуализационные методы исследования включали рентгеновскую компьютерную томографию головного мозга, магнитно-резонансную томографию головного и спинного мозга.
Вызванные потенциалы. Регистрация вызванных потенциалов проводилась на приборе «Электронейромиограф 4 с вызванными потенциалами» фирмы Нейрософт (г. Иваново).
При регистрации зрительных вызванных потенциалов на реверсивный шахматный паттерн (ПЗВП) проводилась монокулярная стимуляция полного поля с фиксацией взгляда на центральную точку с размерами ячейки паттерна 50 мин с яркостью 70,0-80,0 % от максимальной; обследование проводилось в затемнённой комнате. Активные электроды размещались над затылочной областью, референтный - на Fpz, заземляющий - на vertex. Эпоха анализа - 500 мс, число усреднений - 100-200, в зависимости от выделяемости ЗВП.
При регистрации зрительных вызванных потенциалов на вспышечный стимул (ВЗВП) использовалась светодиодная вспышка от матрицы светодио-дов, вставленных в специальные очки. Интенсивность светодиодной вспышки 100-600 мКд, длина волны - 640 нм, засвет подаётся монокулярно при закрытых глазах больного. Размещение электродов - аналогичное при регистрации ПЗВП. Эпоха анализа - 500 мс, число усреднений - около 100.
При регистрации акустических стволовых вызванных потенциалов (АСВП) проводилась моноауральная стимуляция короткими щелчками длительностью 0,1 мс с частотой подачи сигнала 10 Гц в режиме разряжения с интенсивностью сигнала на 70 дБ выше порога слухового восприятия. Проводилось усреднение 2000 вызванных ответов в зависимости от стабильности ВП. Эпоха анализа составила 10 мс, частотная полоса - от 10-30 Гц до 2000 Гц. Регистрация ВП проводилась билатерально, активные электроды располагались на сосцевидных отростках, референтные - на vertex, заземляющие - на Fpz. Анализировались значения пиковых латентностей, межпиковые интервалы (І-ПІ, III-V, I-V), амплитуды пиков и амплитудные соотношения пиков (ПІЛ, УД). Использовалась классификация J. Hall et al. в модификации С. Н. Иллариошкина и соавт., в соответствии с которой выделялись 4 типа ВП: I тип - норма; П тип - слабая степень изменений (нарушение формы вызванного ответа, увеличение межпиковых интервалов, снижение амплитуды основных компонентов ВП); Ш - умеренная степень изменений (отсутствие III и /или V пиков); IV тип - значительные изменения (наличие лишь I пика или отсутствие чёткой визуализации пиков).
Молекулярно-генетический анализ семей с НЗНС проводился на базе ДНК-лабораторий нейрогенетического отделения ГУ НИИ неврологии РАМН, Медико-генетического научного центра РАМН и Института молекулярной генетики РАН (г. Москва) после получения информированного согласия больных и их родственников.
Использовались базовые молекулярно-генетические методы исследования: ПЦР, рестрикционный анализ, различные методики электрофореза в ага-розном и полиакриламидных гелях, анализ конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК (SSCP), прямое секвенирование и др.
Выделение геномной ДНК производилось из 10 мл свежей или замороженной венозной крови с помощью стандартной фенол-хлороформной экстракции.
Амплификация областей генома, содержащих тандемные тринуклеотид-ные повторы, осуществлялась в процессе ПЦР с использованием стандартных пар праймеров, предложенных для анализа мутаций при БГ, СЦА1, СЦА2, СЦАЗ, СЦА6, СЦА7, СЦА12, СЦА17, БФ.
Структура применявшихся праймеров указана в табл. 4. Для ПЦР использовались амплификаторы PTC-100(«MJ Reserch», США) и РНС-1 (Великобритания), общий объём реакционной смеси - 20-25 мл.
Состав реакционной смеси для каждой из проводившихся реакций:
БГ: 3MMMgCl2, 50мМКС1, 20MMTris-HCl (рН 8,3), 2% формамид, 100 мкМ dATP, dCTP и dTTP, 25 мкМ dGTP и 75 мМ 7-dAza-dGTP, 10 нмоль каждого праймера, 2,5 ед. ДНК-полимеразы Ampliaq ("Perkin Elmer-Cetus", США).
СПАЇ: 1,25 мМ MgCl2, 50 мМ КС1, ЮмМ Tris-HCl (рН 8,3), 250 мкМ каждого из дезоксинуклеотидтрифосфатов, 2 % формамид, 5 нмоль каждого праймера, 1 ед. ДНК-полимеразы Ampliaq.
СНА 2: 1 мМ MgCl2, 16,6 мМ (NHOSO4, 67 мМ Tris-HC (рН 8,8), 0,1% Tween-20, 250 мкМ каждого из дезоксинуклеотидтрифосфатов, 25 нмоль каждого праймера, 2 ед. ДНК-полимеразы Bioaq ("Биомастер", Москва). CIIA 3 (болезнь Мачадо-Джозефа): состав смеси такой же, как для СЦА2, дополнительно добавлялся формамид до конечной концентрации 2 %. БФ: состав смеси как для СЦА2, концентрация MgCb - 3 мМ.
В качестве маркеров молекулярного веса использовали различные стандартные наборы рестрикционных фрагментов (р BR 322/Alu I, pBR 322/Msp I, X /Ava П, смесь X /Hind Ш и фХ174/Нае Ш).
Для точного подсчета числа повторов проводилась "горячая" ПЦР с ра-диактивно меченным праймером с последующим электрофорезом продуктов ПЦР в 6 % денатурирующем полиакриламидном геле и авторадиографией.
2. 4, 2. 2. ДНК-диагностика АР спинальная амиотрофии Для амплификации 7-го экзона гена SMN использовали следующие праймеры. R 111/5 - AGACTATCAACTTATTTCTGATCA - 3 и 541 С 770 (5 AAGGAATGTGAGCACCTTCCTTC - З .
Для амплификации 8-го экзона гена SMN использовали праймеры: 541 С 960 (5 -GTAATAACCAAATGCAATGTGAA-3 ) и 541 С II 20 (СТАСА-CACCCTTCTCCAG-3 ). ПЦР проводилось в объеме реакционной смеси 25 мкл, содержащей 200 мкг геномной ДНК, 1,5мМ MgCb, 10 мМ Tris-HCl (рН 8,4), 200 мкМ каждого из дезоксинуклеотидтрифосфатов, 8 нМ каждого прай-мера, 0,2 ед. Ampliaq ДНК-полимеразы. Режим амплификации: денатурация - 94С/1 мин, отжиг - 55С/1 мин, элонгация-72С/1 мин, число циклов - 34.
Продукты амплификации 7-го и 8-го экзонов обрабатывались соответственно рестриктазами Dra I и Dde I с последующим анализом ДНК в 2,5 % ага-розном геле (время электрофореза 2,5 - 3 часа в режиме 5 В/см).
Анализ делеций в гене дистроФина. Скрининг наиболее частых делений в гене дистрофина проводился посредством мультиплексной ПЦР с использованием набора праймеров, предложенных Chamberlain J. S. et al. (1988), Roberts r R. G. et al. (1989) и Beggs A. H. et al. (1990) и позволяющих одновременно ам-плифицировать часть промоторной области гена дистрофина и экзоны 3, 6, 8, 13, 17, 19, 43, 44, 45, 48, 50, 52 и 60. Структура использованных праймеров представлена в таблице 5. Реакционная смесь для амплификации содержала в общем объеме 50 мкл по 0,1-0,5 мкг геномной ДНК, 10 пмоль каждого их праймеров, 67 мМ Трис-HCl (рН 8,8 при 20С), 16,6 мМ сульфата аммония, 4 мМ MgCb, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, смесь 4 динуклеотид-трифосфатов (каждый в концентрации 0,2 мМ) и 2 ед. термостабильной Taq ДНК-полимеразы (НПО "Биопол", Новосибирск или фирмы "Ферментас", Литва). Образцы денатурировали при 93 С в течение 7 мин, затем помещали в ДНК-амплификатор («Biotherm 91») и проводили 28-30 циклов амплификации в следующем режиме: 93С - 1 мин (денатурация), 55С - 1 мин (отжиг), 72С 75 2 мин (синтез); на последнем цикле стадию синтеза продлевали до 7 мин (конечная экстензия).
Анализ продуктов мультиплексной ПЦР и продуктов проводился в 1,5%-ном агарозном геле (5 В/см, 120 мин). В качестве маркера молекулярного веса использовали ДНК фага лямбда, обработанного рестриктазами Hind III или Tag I и ДНК плазмиды pUC18, рестрицированную ферментом Msp І. Для визуализации продуктов реакции гель окрашивался в водном растворе бромистого этидия (1 мкг/мл) в течение 20 мин и анализировался в ультрафиолетовом свете. В ряде случаев для анализа продуктов амплификации использовался 6% полиакриламидный гель, приготовленный стандартным способом; после окончания вертикального электрофореза гель оставляли на одной из пластин и помещали в красящий раствор, содержащий бромистый этидий (1,0 мкг/мл) на 20 мин, с последующей визуализацией ДНК в ультрафиолетовом свете.
Общая характеристика обследованных больных
ДНК-диагностика HMCHIIA Для анализа последовательностей экзонов гена MFN2 (локус СМТ2А 2), применялась полимеразная цепная реакция с праимерами, синтезированными НПФ «ЛИТЕХ», последовательность которых выбиралась из прилежащих ин-тронных областей на основе нуклеотидных последовательностей анализируемых фрагментов ДНК, имеющихся в базе данных GreneBank. Поиск точковых мутаций проводили методом SSCP-анализа, с последующим определением нуклеотидной последовательности образцов, в которых были выявлены изменения, методом прямого автоматического секвенирования продукта ПЦР по методу Сенгера на приборе ABI Prism 3100 (Applied Biosystems) с использованием набора для секвенирования и протокола фирмы производителя, как с прямого, так и с обратного праймера (табл. 6).
ДНК-диагностика ЮП С учетом особенностей спектра мутаций в паркине, в первую очередь следует осуществлять поиск разнообразных генных перестроек - делеций и мультипликаций отдельных экзонов гена, в том числе в гетерозиготном состоянии. Этот анализ может быть автоматизирован и существенно объективизирован благодаря использованию ряда новых технологий количественной по-лимеразной цепной реакции (ПЦР) - таких, например, как ПЦР в реальном режиме времени (real time PCR).
Поиск гетерозиготных структурных перестроек в гене паркине и количественный анализ дозы гена проводился разработанным в Институте молекулярной генетики РАН (Сломинский П. А. и соавт.) методом ПЦР в реальном режиме времени на приборе ANA-32 («Syntol», г. Москва). Структура прайме-ров, синтезированных для амплификации 2-12 экзонов паркина, была определена с помощью программы Vector NTI Suite 9 software. В качестве внутреннего стандарта с каждым экзоном паркина коамплифицировался ген бета-глобина. ПЦР проводилась в 25,0 мкл реакционной смеси, содержащей 10-20 нг геномной ДНК, ІхПЦР буфера («Syntol», Россия), 2,5 мМ MgCh, 10 пМ каждого из пары праймеров соответствующего экзона паркина и Р-глобина, 200 мкМ каждого из дезоксинуклеотидтрифосфатов, 1,25 ед. Hot-rescue Taq ДНК-полимеразы («Syntol», Россия) и 4 пМ зондов на отдельные экзоны генов паркина и р-глобина, сконструированных с использованием TaqMan-химии («Syntol», Россия). Амплификация проводилась в соответствии со следующим протоколом: 2 мин при 50С, 10 мин при 95С и 40 циклов по 15 с при 95С и 50 с при соответствующей отжигу температуре. Для максимальной верификации оценки интенсивности флюоресценции ПНР-продуктов все образцы тестировались трижды.
Отношение концентраций паркин/бета-глобин подсчитывалось для всех ДНК образцов. Нормальным расценивалось соотношение от 0,7 до 1,3. Показатели ниже 0,6 или выше 1,4 расценивались как гетерозиготная делеция или дупликация определенного экзона, соответственно.
В качестве контрольной группы обследованы 85 клинически здоровых лиц слявянской этнической принадлежности (170 контрольных хромосом); по возрасту и половому составу контрольная группа была сопоставима с исследуемой группой больных.
ДНК-диагностика ГЛД основана на SSCP-анализе отдельных экзонов гена А ТР 7В с последующим прямым секвенированием.
Образцы ДНК пробандов из семей с диагнозом НСП тип 4 исследуются при помощи SSCP-анализа и прямого секвенирования.
Выделение геномной ДНК из лейкоцитов периферической крови выполнялось с помощью набора реактивов для выделения DLAfo7WDNA PreplOO по протоколу производителя. Амплификация фрагментов ДНК проводилась методом полимеразной цепной реакции на программируемом термоциклере МС2 фирмы «ДНК-технология» (Россия) в 25 ц] объёме реакционной смеси следу-щего состава: 0,1-1,0 ug геномной ДНК; 0, 025 цМ каждого олигонуклеотид-ного праймера; 200 цМ каждого нуклеотидтрифосфата; 1 единица ДНК-полимеразы Biotaq («БиоМастер»); буфер для ПНР (67 mM Tris-HCl, 16,6 mM (NH4)2S04, 0,01% Twin-20, рН 8,8); 20-30 ці минерального масла, концентрация MgCb и другие особенности каждой реакции подбирались индивидуально для определенного амплификационного фрагмента. Результаты амплификации оценивались с помощью электрофореза в 7 - 8% полиакриламидном геле (соотношение акриламида к бисакриламиду 29:1,29: 1,3) с последующим окрашиванием геля раствором бромистого этидия и регистрацией в УФ-излучении (длина волны 312 нм).
Для поиска мутаций в гене SPG4 применялся метод SSCP-анализа со щелочной денатурацией. Для выявления характера мутации и определения нуклеотидной последовательности фрагментов гена использовали метод прямого секвенирования как с прямого, так и с обратного праймера, на основе ферментативного сиквенса по Сенгеру. В качестве матрицы для проведения сиквенса использовали фрагменты, полученные после проведения ПЦР. Автомагическое секвенирование проводилось согласно протоколу фирмы-производителя на приборе 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Japan).
Наследственные заболевания с преимущественным во влечением экстрапирамидных систем
В Хабаровском крае выявлены 12 больных ЮП, из них 7 женщин, 5 мужчин; по национальности - 11 русских, 1 - азербайджанец.
Критериями диагностики ЮП были АР тип наследования, начало на 2-4-м десятилетии жизни, частое сочетание паркинсонического синдрома с дисто-нией (дистонические позы стоп, туловища, реже кривошея, писчий спазм, дистония мышц глотки, гортани и другие), особенно при начале болезни в раннем возрасте; оживление сухожильных рефлексов и другие пирамидные знаки; флуктуации в выраженности симптомов паркинсонизма и дистонии на протяжении дня (улучшение утром или после дневного сна, ухудшение к вечеру); отсутствие деменции и выраженной атрофии полушарий большого мозга даже при многолетнем течении заболевания; минимальные симптомы вегетативной дисфункции; хороший многолетний терапевтический эффект небольших доз L-дофа (200-250 мг леводопы в сутки в комбинации с карбидопой), появление в среднем через 15 лет лекарственных осложнений в виде хореиформных дис-кинезий конца дозы; медленное прогрессирование на протяжении десятилетий, относительно благоприятный прогноз заболевания; исключение других причин паркинсонизма.
Средний возраст больных составил 39,83 ± 15,68 года (размах 10-59 лет); возраст начала болезни - 23,67 ±13,14 года (размах 2-39 лет); длительность заболевания - 16,18 ± 13,80 года (размах 0,13-44 года). Общая клиническая характеристика обследованных больных ЮП представлена в табл. 17. Семейный анамнез положительный у 3 больных: семейный случай ЮП у 2 сестёр - Г. Н. (34 лет) и Г. Е. (45 лет); доминантный тип наследования симптомов паркинсонизма в 3 поколениях у больной О., 51 года (родословные см. ниже).
Первыми симптомами заболевания были окулогирные кризы и тоническая судорога взора (1 больная), дистония ноги (1 больная), дистония руки (2 больных), дрожание руки (3 больных), блефароспазм (1 больная), гемидисто-ния (2 больных), постепенное или острое развитие ригидности и брадикинезии (4 больных), в одном случае (больной Б-в) заболевание началось по типу ге-мипаркинсонизма справа, в другом (больная К-ь) - с преобладанием паркин-сонических симптомов слева; средний возраст начала L-ДОПА-терапии был 32,78 ± 12,51 года (10-55 лет). В клинической картине у больных ЮП наблюдалось различное сочетание симптомов: брадикинезии, ригидности, посту-ральной неустойчивости, дисфагии, изменений речи, тремора покоя, посту-рального и тремора действия.
У 9 больных имелись разнообразные синдромы дистонии в виде спастической кривошеи (у 4 пациентов), блефароспазма (2 пациентов), оромандибу-лярной дистонии (двое больных), дистонии правой стопы или обеих стоп (трое больных), левосторонней (1 больная) и правосторонней гемидистонии (1 больная) или генерализованной дистонии (1 больная), дистонии туловища (1 больная), дистонии правой руки (1 больная) в разнообразных сочетаниях. Из оставшихся трёх больных у одной (Н., 46 лет) дистония имелась в дебюте бо 126 лезни; у двух больных дистония отсутствовала в течение небольшого периода наблюдения (до года). Относительно динамики развития дистонии у наблюдавшихся больных следует отметить, что у 1 больной (Н-ко) дистония отмечалась только в дебюте заболевания (окулогирные кризы, тоническая судорога взора), у 3 больных имевшаяся в дебюте дистония сохранилась на протяжении болезни в виде дистонии правой ноги, гемидистонии справа, гемидистонии слева; у последней больной по мере прогрессирования болезни присоединилась спастическая кривошея. У 6 пациентов дистония появлялась и нарастала по мере прогрессирования заболевания (имелась связь с длительностью болезни) - у больной О-ной к блефароспазму добавились спастическая кривошея, оромандибулярная дистония, дистония стоп, туловища; у больного Б-на развилась гемидистония слева; у больной К-рь - спастическая кривошея; у больной Г-ко Е. - дистония правой ноги; у больного Б-ва - блефароспазм, оромандибулярная дистония, спастическая кривошея; у больной Г-ко Н., имевшей в дебюте дистонию левой ноги, постепенно развилась генерализованная дистония.
Отсутствовала четкая связь дистонии с возрастом начала ЮП. Прием L-ДОПА уменьшал выраженность дистонии у 7 больных и не влиял на выраженность дистонии у 2 больных. У 4 больных наблюдались вегетативные симптомы (запоры, задержки мочи, повышенная потливость, гиперсаливация, сальность лица, похудение на 20 кг) в различных комбинациях. Оживление глубоких рефлексов выявлялось у 3 больных, причем у 2 больных имелась пирамидная симптоматика на стороне гемидистонии. У пациентки Г-ко Н., кроме того, наблюдалась левосторонняя гемигипалгезия.
Большинство больных принимают L-ДОПА в дозировке от 200 до 750 мг в сутки, кроме больной Н-ко, 46 лет, которая использует дозировку 1750 мг и имеет периоды «выключения», занимающие до 1/3-1/2 дня; длительность L-ДОПА-терапии составляет 15 лет. Повышение дозы L-ДОПА с годами отмечалось у 9 больных.
Различные осложнения лечения наблюдались у 2-х сестёр Г-ко - у старшей, 45 лет, имеются L-ДОПА-индуцированные дискинезии в виде генерализованного хореического гиперкинеза, появившиеся спустя 7 лет от начала L-ДОПА-терапии, а также периоды «выключения» (длительность L-ДОПА-терапии составляет 13 лет). У младшей сестры, 34 лет, отмечаются периоды «выключения» по окончании действия дозы препарата, занимающее 1А дня, длительность L-ДОПА-терапии - 4 года. Периоды выключения имелись ещё у 4 больных; они возникали по окончании действия дозы и занимали от 10 до 25 % времени в течение дня. Непредсказуемых или внезапных периодов «выключения», L-ДОПА-индуцированных дистоний не отмечалось. Переносимость L-ДОПА-содержащих препаратов у большинства больных была хорошей, за исключением больной О-ной, 51 года, которая длительное время не могла принимать данные медикаменты из-за побочных явлений (тошноты, рвоты, сердцебиений, болей в животе, головокружения). Пятеро больных со сроком L-ДОПА-терапии от 2-х месяцев до 23 лет не имеют осложнений лечения.
Стадии паркинсонизма по Hoehn и Yahr у больных ЮП в период «включения» оценены от 0 стадии до 3; на «выключении» - от 1 до 5; баллы по UPDRS на «включении» - от 6 до 70, на «выключении» - от 7 до 87. По шкале SCHWAB и ENGLAND оценка на «включении» составила от 50,0 до 100,0 % , на «выключении» - от 30,0 до 90,0 % .
Анамнез заболевания: в середине ноября 1999 г. (в возрасте 10 лет) после перенесённого острого бронхита на фоне повышения температуры тела до 39 С появились головные боли, тошнота, рвота, заторможенность, общая скованность, застывания; на вопросы отвечал односложно. Выявлялись гипоми-мия, лёгкий тремор кистей, горизонтальный мелкоамплитудный нистагм при взгляде влево, гиперсаливация, сальность лица, дисфагия, повышение тонуса в конечностях по пластическому типу, микрография, высокие сухожильные рефлексы, двусторонний рефлекс Бабинского, выраженные оральные рефлексы (Маринеску-Радовичи, хоботковый, дистанс-оральный); самостоятельно не ходил, нуждался в самообслуживании. Общие анализы крови, мочи, биохими 128
ческие анализы крови, анализ ликвора в норме, глазное дно не изменено. На компьютерных томограммах головного мозга: желудочки и цистерны не расширены, объемных образований не выявлено. Поставлен диагноз: Вирусный энцефалит с паркинсоническим, псевдобульбарным, пирамидным синдромами (постэнцефалитический паркинсонизм?). Назначены: наком 250 мг/сут, юмекс, преднизолон 60 мг, дезинтоксикационная, симптоматическая терапия. С начала декабря 1999 г. стал самостоятельно ходить, хорошо глотал, сохранялись брадикинезия, оральные рефлексы, ригидность в левых конечностях, микрография. После выписки из стационара в январе 2000 г. отмечалось значительное уменьшение брадикинезии, ригидности; получал курсовое лечение нако-мом до 250-500 мг/сут в течение 1-2 месяцев с перерывами в 1-2 месяца.
Анамнез жизни: родился от 1-ой беременности, нормальных родов, раннее развитие без особенностей. Наследственность не отягощена. Перенесённые заболевания: ОРВИ, ветряная оспа, аскаридоз, фарингит, острый отит, фимоз.
![Клинико-иммунологический анализ церебральных расстройств при остром вирусном гепатите В [Электронный ресурс]](/i/i/4255/203375.png "Клинико-иммунологический анализ церебральных расстройств при остром вирусном гепатите В [Электронный ресурс] Мухин Андрей Александрович")
![Клинико-физиологический анализ эссенциального тремора [Электронный ресурс]](/i/i/4422/206503.png "Клинико-физиологический анализ эссенциального тремора [Электронный ресурс] Магомедова Резеда Курбановна")
![Клинико-психофизиологический анализ типичных и атипичных панических атак (ПА) [Электронный ресурс]](/i/i/4450/180176.png "Клинико-психофизиологический анализ типичных и атипичных панических атак (ПА) [Электронный ресурс] Фадеев Артур Викторович")