Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Этиология клиника, диагностика и лечение вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами у пациенток репродуктивного возраста (обзор литературы)
1.1. Современные представления о вульвовагинитах, вызванных условно-патогенными микроорганизмами 1 б
1.1.1. История термина 16
1.1.2. Состав нормальной микрофлоры влагалища у женщин репродуктивного возраста 18
1. 1.3. Современные представления об этиологической роли условно патогенных микроорганизмов в развитии воспалительных заболеваний нижних отделов урогенитальной системы у женщин репродуктивного возраста 27
1.1.4. Факторы, способствующие поддержанию нормального микробиоценоза влагалища 30
1.1.5: Факторы, способствующие нарушению микробиоценоза влагалища 33
1.2. Клиническая характеристика и;методы лабораторной диагностики;вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, у женщин репродуктивного возраста 36
1.3. Основные подходы к лечению вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами 40
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования
2.1. Клиническая характеристика больных. 46
2.2. Лабораторные методы исследования
2.2.1. Микробиологические методы исследования 49
2.2.2. Молекулярно-биологические методы исследования 54
2.2.3. Иммуноферментный метод исследования 59
2.3. Статистическая обработка 60
ГЛАВА 3. Результаты клинического обследования пациенток с вульвовагинитами, вызванными условно-патогенными микроорганизмами
3.1. Анализ анамнестических данных обследованных пациенток 61
3.2. Анализ результатов клинического обследования 76
ГЛАВА 4. Качественный и количественный состав вагинального микробиоценоза у женщин с вульвовагинитами, вызванными условно-патогенными микроорганизмами, и клинически здоровых пациенток 79
ГЛАВА 5. Оценка возможности использования днк-чипов для изучения состояния вагинального микробиоценоза 95
5.1. Определение спекра микроорганизмов для включения в состав ДНК-чипа 95
5.2. Подбор олигонуклеатидных зондов для идентификации микроорганизмов 98
5.3. Оценка результатов, полученных при исследовании мотодом ДНК-чипа 102
5.4. Оценка клинической чувствительности и специфичности метода ДНК-чипа 106
5.5. Оценка экономической целесообразности использования ДНК-чипа в сравнении с микробиологическим методом и методом ПНР... 109
ГЛАВА 6. Результаты изучения чувствительности условно-патогенных микроорганизмов к антибактериальным препаратам 128
ГЛАВА 7. Оценка эффективности различных методик лечения вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами 134
Заключение 146
Выводы 174
Практические рекомендации 176
Список литературы
- Современные представления об этиологической роли условно патогенных микроорганизмов в развитии воспалительных заболеваний нижних отделов урогенитальной системы у женщин репродуктивного возраста
- Молекулярно-биологические методы исследования
- Анализ результатов клинического обследования
- Подбор олигонуклеатидных зондов для идентификации микроорганизмов
Введение к работе
Актуальность проблемы Одной из важнейших медико-социальных проблем в настоящее время является инфекционная патология репродуктивной системы женщины. Ведущее место в структуре данной патологии занимают воспалительные процессы, вызванные условно-патогенными микроорганизмами. Так, по данным разных авторов, частота бактериальных инфекций урогенитального тракта достигает 80% среди патологических состояний женской половой сферы (Кира Е.Ф., 2001 г., Тютюник В.Л., 2001 г., Яковлев С.В., 2002 г., Пестрикова Т.Ю. с соавт., 2009 г.).
Многочисленными исследователями установлен полимикробный характер вульвовагинитов, ассоциированных с энтеробактериями, колиформными бактериями, стафилококками и стрептококками. При этом, в большинстве исследований была продемонстрирована роль условно-патогенных микроорганизмов как моновозбудителей воспалительных процессов урогенитального тракта (Мазорчук Б.Ф., 2007, Фофанова И.Ю., 2008).
Известно, что возникновению воспалительных процессов вульвы и влагалища способствуют нарушения трофики тканей урогенитального тракта, вызванные эндогенными и экзогенными причинами. Так, установлена корреляционная связь между дисбактериозом, обусловленным кишечной и влагалищной микрофлорой (Савичева А.М., 1996 г., Кира Е. Ф., 2001 г.). Ряд авторов отводит существенную роль снижению иммунологической реактивности организма и неблагоприятному влиянию гиперэстрогении на баланс биотопа урогенитального тракта, но до настоящего времени значение гормонального фона женщины в изменении микрофлоры урогенитального тракта не определено (Newton E.R., 2001 г., Levinson W. , 2004 г.). Объектом дискуссий также является и возможность половой трансмиссии условно-патогенных микроорганизмов (Воронова О.А., 2004 г., Mumtaz S., 2008 г.).
На сегодняшний день лабораторная диагностика вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, включает микроскопический и культуральный методы исследования (Анкирская А.С., 2000 г., Воропаева Е.А., 2005 г.). Однако культуральный метод сложен, трудоемок, длителен по времени выполнения. Решение проблемы быстрой идентификации бактериальной микрофлоры возможно путем использования передовой технологии ДНК-чипов, позволяющей выявлять микроорганизмы непосредственно в материале соскоба из влагалища, минуя стадию культивирования и выделения чистой культуры. (Степанова Ю.Н., 2003 г., Атрошкина М.Е., 2009 г., Липова Е.В., 2009 г., Palka-Santini M., 2009 г.).
Лечение вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, часто проводится без учета этиологических факторов, что приводит к рецидивам заболевания через непродолжительный период времени и росту резистентности условно-патогенных микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Так, Johnson L. в 2008 г. была отмечена высокая устойчивость микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae к препаратам группы фторхинолонов, которые широко используются в терапии вульвовагинитов. При этом в настоящее время отсутствуют единые подходы и рекомендации по терапии вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, у женщин репродуктивного возраста.
Цель исследования Оптимизировать тактику ведения женщин репродуктивного возраста с вульвовагинитами, вызванными условно-патогенными микроорганизмами, на основании определения факторов риска возникновения заболеваний, изучения состава вагинального микробиоценоза, оценки клинической значимости современных методов лабораторной диагностики и анализа показателей чувствительности инфекционных агентов к антибактериальным препаратам.
Задачи исследования
-
Изучить факторы риска развития вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, у женщин репродуктивного возраста.
-
Исследовать качественный и количественный состав вагинального микробиоценоза у женщин репродуктивного возраста с вульвовагинитами, вызванными условно-патогенными микроорганизмами и определить возможность использования ДНК-чипов для оценки состояния вагинального микробиоценоза.
-
Изучить чувствительность условно-патогенных микроорганизмов – этиологических агентов вульвовагинитов к антибактериальным препаратам.
-
Оценить эффективность различных методик терапии пациенток с вульвовагинитами, вызванными условно-патогенными микроорганизмами.
-
На основании полученных данных разработать алгоритм ведения пациенток с вульвовагинитами, вызванными условно-патогенными микроорганизмами.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Основными факторами риска развития вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, у женщин репродуктивного возраста являются: раннее начало половой жизни; большое количество половых партнеров; применение в сексуальной практике нетрадиционных форм половых контактов при отсутствии барьерной контрацепции или нерегулярном ее использовании; нерациональное и бесконтрольное применение антибактериальных препаратов широкого спектра действия; нарушение правил личной и/или половой гигиены; гормональный дисбаланс, связанный с гиперэстрогенией и гиперпролактинемией; наличие дисбактериоза и других заболеваний кишечника.
-
Состав вагинального микробиоценоза у женщин с вульвовагинитами, вызванными условно-патогенными микроорганизмами, характеризуется преобладанием в структуре Corynebacterium spp. (91,4%), Escherichia coli (54,5%), Enterococcus faecalis (54,0%), Staphylococcus saprophiticus (29,3%), Klebsiella pneumoniae (18,2%), Streptococcus anginosus (18,2%), Streptococcus agalactiae (16,2%) в количестве более 102 - 104 КОЕ/мл и облигатных анаэробов Bacteroides spp. (10,1%), Fusobacterium nucleatum (8,6%), Propionibacterium spp. (8,1%) в ассоциациях 4 и более микроорганизмов.
Состав вагинального микробиоценоза здоровых женщин характеризуется преобладанием в структуре облигатно-анаэробных Lactobacillus spp. (89,4%) и Corynebacterium spp. (42,4%).
При вульвовагинитах, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, происходит замещение облигатно-анаэробных видов лактобактерий на факультативно-анаэробные.
ДНК-чип является современным методом этиологической диагностики вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, позволяющим осуществлять одновременную идентификацию большого числа как патогенных, так и условно-патогенных микроорганизмов непосредственно в биологическом материале, минуя стадию культивирования, что значительно сокращает время обследования пациентов.
Применение технологии ДНК-чипов имеет экономическое преимущество перед микробиологическими исследованиями: стоимость комплексной диагностики состава вагинального микробиоценоза с использованием ДНК-чипов в 1,9 раза меньше себестоимости микробиологических методов исследования.
Чувствительность и специфичность метода ДНК-чипов для идентификации возбудителей ИППП (Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis и Mycoplasma genitalium) является максимальной (100%). Для идентификации непатогенных и условно-патогенных микроорганизмов (Lactobacillus spp., Esсherichia coli, Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Gardnerella vaginalis, Fusobacterium nucleatum, Streptococcus anginosus) установлена высокая чувствительность метода ДНК-чипов (97,2-100,0%).
-
Препаратами выбора при лечении вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, являются амоксициллин/клавулоновая кислота, нитрофураны и цефтриаксон. Препараты группы фторхинолонов в терапии вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, необходимо назначать только при подтверждении чувствительности к ним выделенных культур микроорганизмов.
-
Терапию вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, следует проводить индивидуально с учетом результатов чувствительности выделенных культур микроорганизмов. Целесообразно сочетать системную антибактериальную терапию с назначением местного поликомпонентного антимикробного препарата широгого спектра действия.
Научная новизна При изучении факторов риска развития вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, у женщин репродуктивного возраста установлено, что гормональный дисбаланс, представленный гиперэстрогенией и гиперпролактинемией способствует нарушению нормоценоза вагинального биотопа.
Определена роль условно-патогенных микроорганизмов в развитии вульвовагинитов у женщин репродуктивного возраста. Продемонстрировано клиническое значение Corynebacterium spp., представителей семейств Enterobacteriaceae, Micrococcaceae и облигатно-анаэробных микроорганизмов (Bacteroides spp., Fusobacterium nucleatum, Propionibacterium spp.) в ассоциации 4 и более инфекционных агентов.
Впервые показана максимальная чувствительность и специфичность метода ДНК-чипов для идентификации возбудителей ИППП и высокая чувствительность (97,2-100,0%) для идентификации непатогенных и условно-патогенных микроорганизмов.
Впервые изучена экономическая эффективность использования ДНК-чипов для оценки вагинального микробиоценоза, при этом установлены преимущества метода ДНК-чипов по сравнению с микробиологическими методами.
Систематизированы данные по чувствительности условно-патогенных микроорганизмов к антибактериальным препаратам у женщин с вульвовагинитами, при этом установлена высокая чувствительность инфекционных агентов к амоксициллин/клавулоновой кислоте (чувствительны 93,4%-100,0% штаммов), цефтриаксону (чувствительны 93,6%-100,0% штаммов) и нитрофуранам (чувствительны 92,4%-100,0% штаммов).
Показана более высокая эффективность сочетанного применения системного антибактериального препарата с комбинированным антимикробным препаратом местного действия по сравнению с монотерапией, проводимой системным антибактериальным препаратом (p=0,039) или комбинированным антимикробным препаратом местного действия (p=0,005).
Практическая значимость На основании результатов проведенных исследований разработан алгоритм ведения пациенток с вульвовагинитами, вызванными условно-патогенными микроорганизмами.
Внедрение в практику метода ДНК-чипов позволяет осуществлять одновременную идентификацию большого числа патогенных, условно-патогенных и непатогенных микроорганизмов непосредственно в биологическом материале, минуя стадию культивирования, что значительно сократит время обследования пациентов и повысит экономическую эффективность исследования.
Результаты изучения чувствительности условно-патогенных микроорганизмов к антибактериальным препаратам позволят оптимизировать схемы терапии вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами.
Внедрение результатов в практику Результаты исследования внедрены в практику работы Консультативно-диагностического центра ФГУ «ГНЦДК» Минздравсоцразвития России.
По результатам исследования подготовлены Медицинские технологии «Вульвовагиниты, вызванные условно-патогенными микроорганизмами, у пациенток репродуктивного возраста: диагностика и терапия» и «Применение технологии ДНК-чипов в комплексной диагностике инфекций, передаваемых половым путем» (Москва, 2011 г.).
Разработан патент «Способ и ДНК-чип для комплексной диагностики инфекций, передаваемых половым путем» (номер заявки 2009140661 от 05.11.09 года).
Апробация работы Результаты проведенного исследования доложены на:
-
X Всероссийском съезде дерматовенерологов (Москва, октябрь 2008г.).
-
Научно-практической конференции ФГУ «Государственный научный центр дерматовенерологии Росмедтехнологий» (Москва, май, 2009 г.).
-
XI Всероссийском съезде дерматовенерологов и косметологов (Екатеринбург, октябрь, 2010 г.).
Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 193 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, 5 глав, содержащих результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы, практические рекомендации, заключение, список литературы. Работа иллюстрирована 38 таблицами и 19 рисунками. Список литературы содержит 133 источника, в том числе 85 отечественных и 47 зарубежных авторов.
Современные представления об этиологической роли условно патогенных микроорганизмов в развитии воспалительных заболеваний нижних отделов урогенитальной системы у женщин репродуктивного возраста
Состав нормальной микрофлоры влагалища у женщин репродуктивного возрастало утверждению многих авторов, противоинфекционная резистентность урогенитального тракта обеспечивается сложными защитными механизмами, в число которых входят: нормальная микрофлора влагалища, взаимодействие которой с иммунной системой» организма обеспечивает колонизационную резистентность, урогенитального тракта; микрозкологияі шейки матки, слизистая? оболочка которой обладает чрезвычайно высокими; бактерицидными свойствами, являясь барьером для восходящей; инфекции; состояние: иммунологической; реактивности: организма-, на локальном: и общем уровнях, к которым относят иммунные и неспецифические факторы. защиты,, обеспечивающие- естественную резистентность организма? к инфекциям [19; 26, 27, 68].
Ряд. авторов первостепенное значение в детерминировании колонизационной резистентности урогенитального тракта отводит нормальной микрофлоре влагалища. Колонизационная резистентность представляет собой совокупность эволюционное сложившихся- механизмов, обеспечивающих стабильность количественного и качественного состава микрофлоры в пределах конкретной- экологической ниши; что предотвращает заселение влагалища, патогенными;, микроорганизмами.: или.: массивную колонизацию» условно-патогенными микроорганизмами, входящими; в состав нормального: микроценоза [4, 16; 30;% 84, 89]. Микробиоценоз влагалища является; сложной: саморегулирующейся средой; поддержанию постоянства, которой способствует совокупность таких факторов, как; эстроген-гестагеновый баланс, местные факторы: иммунной защиты, преобладание в; микрофлоре влагалища- анаэробных лактобактерий и другие [3; 32, 54, 69];.
Как и: другие микроценозы, вагинальный; микроценоз у женщин репродуктивного: возраста в норме состоит из постоянно обитающих (индигенная;. автохтонная- микрофлора) и транзиторных (аллохтонная, случайная- микрофлора) микроорганизмов; Индигенная; микрофлора доминирует по численности популяции, однако, как отмечают некоторые авторы,, количество представляющих ее: видов невелико, но- именно она определяет колонизационную резистентность. При этом транзиторная. часть микрофлоры разнообразна по видовому составу, но общая численность микроорганизмов,, ее составляющих, в норме не превышает 3-5% от всего пула микроценоза и играет важную роль в стимуляции иммунной системы макроорганизма [Зі, 31].
Особенностью нормальной микрофлоры влагалища является многообразие видов облигатных и факультативно-анаэробных. микроорганизмов, щ в значительно меньшей степени; аэробных микроорганизмов. У здоровых женщин репродуктивного возраста общее количество микроорганизмов в вагинальном отделяемом составляет 106- 108 КОЕ/мл и состоит из разнообразных видов (до 40 и более) [5, 34,.41, 54]. По данным же Andra В. и соавт. (1998 г.);. во влагалищной среде могут присутствовать не менее 61 фенотипа микроорганизмов, но их набор остается относительно; постоянным, если женщина остается здоровой на протяжении значительного времени. В исследованиях многих авторов показано, что анаэробы в женских половых путях значительно преобладают над аэробами и факультативными анаэробами в течение всей жизни женщины, а соотношение анаэробных микроорганизмов к аэробам в репродуктивном возрасте в среднем составляет 10:1 [14, 28, 32]. Многими учеными было установлено, что среди анаэробов женских половых органов чаще других встречаются следующие три основных вида микроорганизмов: бактероиды (57 - 78% всех.анаэробов); пептококки, пептострептококки (33 -77%) и клостридии; (5%) [23, 35, 54]. Что касается аэробных представителей вагинального микроценоза здоровых женщин, то преимущественно выявляются S. saprophyticus (около 50%), S. epidermitidis (до 40%),.. coli (до 16%), Klebsiella (до 5% наблюдений), а содержание их во влагалище не превышает 107 КОЕ/мл [23, 32].
По данным Анкирской А.С. (1999 г.) и Башмаковой М:А. с соавт. (1995 г.), у здоровых женщин в репродуктивном возрасте грамположительные лактобациллы являются доминирующими бактериями влагалищной среды и составляют 95-98% его биотопа. Чаще всего выделяются следующие виды лактобацилл: L. acidophilus, L. brevis, L. jensenii, L. casei, L. leishmanii, L. plantarum, значительно реже — L. buchneri, L. casei, L. crispatus, L. fermentum, L. gasseri, L. johnsonii, L. reuteri, L. rhamnosus, L. ruminis, L. salivarius, L.vaginalis [5, 32, 84, 106].
Согласно исследованиям Сидоровой И.С. с соавторами (2005 г.), лактобациллы не являются единственной- «протективной» составляющей микрофлоры влагалища. Описана роль бифидобактерий как одного из наиболее вероятных дополнительных микробных компонентов, обеспечивающих колонизационную резистентность влагалища. Среднее количество бифидобактерий в вагинальном секрете составляет 104 КОЕ/мл. Концентрация бифидобактерий в норме варьирует от 103 до» 107 КОЕ/мл. Наиболее часто встречаются, по данным Коршунова В.М. (1999), В. bifidum и В.breve (у 38% женщин), В. adolescentis (у 25% женщин) и В. longum (у 13% женщин). Коршунов В.М., Уртаева З.А. с соавторами (1999 г.) привели данные о том, что клеточная стенка бифидобактерий обладает иммуностимулирующей активностью и обеспечивает формирование более выраженного иммунного ответа макроорганизма в отношении чужеродного агента.
Мартикайнен З.М. (1996 г.) и другие исследователи полагают, что среди условно-патогенных транзиторных микроорганизмов чаще всего встречаются коагулазоотрицательные стафилококки (в первую очередь — Staphylococcus epidermidis), а также - Corynebacterium spp., Bacteroides — Prevotella spp. и Mycoplasma hominis, которые обычно присутствуют в умеренном количестве - до 104 КОЕ/мл. Коршунов В.М. с соавторами (1999 г.) отмечают, что в значительно меньшем количестве встречаются Micrococcus spp., Propionibacterium spp., Veilonella spp., Eubacterium spp., редко — Clostridium spp., Actinomyces spp., Fusobacterium spp., Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Neisseria spp., E. coli и др.
Молекулярно-биологические методы исследования
С целью оптимизации диагностики вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, с помощью ДНК-чипа было проведено исследование биоматериала, полученного от 123 (46,59%) пациенток, в том числе 99 (80,5%) пациенток I группы и 24 (19,5%) пациенток II группы. С целью изучения специфичности метода ДНК-чипа в исследование дополнительно были включены 14 женщин, у которых при диагностике микробиологическими методами и методом ПЦР были выявлены возбудители ИГШП: Neisseria gonorrhoeae — у 2 (14,3%) пациенток, Chlamydia trachomatis — у 11 (78,6%) пациенток, Mycoplasma genitalium — у З (21,4%) пациенток.
Этапы исследования включали: 1. Получение испытуемого образца биоматериала от пациенток. 2. Выделение тотальной ДНК из образца биоматериала с использованием стандартного набора для выделения «ДНК-экспресс» (НПФ «Литех», Россия, № ФС 032а2002/0923-05). 3. Амплификация испытуемого образца ДНК, полученного в предыдущей стадии, методом полимеразно-цепной реакции (ПЦР) с одновременным введением в состав продуктов амплификации олигонуклеотида, меченного флуорофором Су5 (Cy5-dCTP). Брали 4 стерильные пробирки объемом 0,2 мл для приготовления проб для амплификации ДНК. Каждая пробирка содержала следующие реагенты: водный раствор трех нуклеозидтрифосфатов (dATP, dTTP, dGTP) в концентрации 100 мкМ каждый (Силекс, Россия, кат № 1310); нуклеозидтрифосфат dCTP в концентрации 90 мкМ (фирма «Силекс», Россия, кат № 1310); нуклеозидтрифосфат dCTP, модифицированный Су5, в концентрации 10 мкМ (Синтол, Россия); два специфичных праймера, в концентрации 10 пмоль каждый (Синтол, Россия); 1х ПЦР-буфер [раствор 0,66 М трис-НС1; 25 MM MgCl2 (кат. № Т 6791, фирма «Sigma», США)]; 0.05 ед/мкл Taq-полимераза1 (Promega, США); 3 мкг испытуемой! ДНК-пробы. В каждую пробирку добавлялась, ионизированная вода до конечного объема1, смеси 25 мкл. Пробирки закрывались и устанавливались, в ПЦР-амплификатор. На амплификаторе запускалилась установленная программа. После окончания реакции амплификации пробирка вынималась из амплификатора. 4. Детекция меченных флуорофором Су5 продуктов амплификации, проводилась методом электрофореза в агарозном геле с использованием набора «ЭФ вариант 300» (ФГУН «ННИИЭ» Роспотребнадзора, Россия, серия 08.09.08)
Из каждой пробирки с продуктами амплификации, отбирали 5 мкл и вносили в лунку 2%-ного агарозного геля. В отдельную лунку вносили 10 мкл маркера молекулярных масс ДНК. Камеру с гелем помещали в форезную камеру; в камеру заливали ТАЕ буфер (40 мМ трис-ацетат, 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты дииатриевая соль, рН 7,6), содержащий 0,5 мкг/мл этидия бромида. Камеру подключали к источнику тока, соблюдая полярность (ДНК движется к положительному электроду).
Оптимальное напряжение электрического поля 10 В/см; время прохождения электрофореза - 18-20 мин. Учёт результатов амплификации испытуемой ДНК-пробы проводился по наличию на электрофореграмме специфических полос амплифицированной ДНК.
Визуализацию продуктов амплификации осуществляли с помощью видеосистемы для документирования гель-электрофореграмм по появлению светящихся оранжево-красных полос при облучении УФ-излучением с длиной волны 310 нм. 5. Проведение реакции гибридизации путем инкубации меченных флуорофором Су5 продуктов амплификации геномов идентифицируемых микроорганизмов на ДНК-чипе. ДНК-чип вставляли в рамку-держатель для чипов. Сверху на чип надевали рамку-трафарет. В одной стерильной пробирке объемом 0,5 мл смешивали содержимое четырех пробирок, содержащих продукты амплификации фрагментов геномов идентифицируемых микроорганизмов и добавляли равный объем гибридизационного буфера (20х SSPE буфер: 3 М NaCl, 20 мМ NaH2P04xH20, 20 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты дииатриевая соль, рН 7,4). Полученную смесь подвергали инкубации при 95С в течение 3 минут с последующим быстрым замораживанием смеси при -20С в течение 2 минут для денатурации ДНК.
На поверхность одного эррея вносили 40 мкл смеси денатурированных продуктов амплификации ДНК идентифицируемых микроорганизмов. Рамку-держатель закрывали крышкой. Чип инкубировался в термошейкере при температуре 37С при вращении платформы 300 об/мин в течение 2 ч.
После инкубации содержимое из лунок рамок-трафарета аккуратно убирали, не повреждая центральное поле лунки, с помощью вакуумного медицинского отсасывателя. В каждый эррей внесили по 100 мкл раствора для отмывки № 1 (5х раствор SSC: 0,75 М NaCl, 75 мМ азС6Н507х5.5 Н20; содержащий 0,1%-ый раствор твин-20), инкубировали в термошейкере 15 минут при комнатной температуре при вращении платформы 300 об/мин. После инкубации содержимое из лунок рамок-трафарета снова аккуратно убирали с помощью вакуумного медицинского отсасывателя. В каждый эррей вносили по 100 мкл раствора для отмывки № 2 (2х раствор SSC: 0.3 М NaCl, 0.03 М №зСбН507х5.5 Н20; содержащий 0,1%-ый раствор твин-20), инкубировали в термошейкере 15 минут при комнатной температуре при вращении платформы 300 об/мин. Чип аккуратно вынимали из рамки держателя, ополаскивали дистиллированной водой и высушивали с помощью центрифугирования в течение 1 минуты при 1000 об/мин.
После проведения анализа чип сканировали на многоканальном сканере для биочипов, активируя канал Су5. Сканированные изображения сохраняли в формате tif. Сканированные образы в формате tif открывались в специальной программе для последующей интерпретации изображения. Процедура проводилась согласно инструкции (описания) к конкретному программному обеспечению. В данной программе вносились все необходимые параметры для точного наложения «сетки» по центру локализации слотов. Полученные результаты сохранялись в формате Excel.
Анализ результатов клинического обследования
На момент обследования 167 (84,3%) пациенток I группы имели половые контакты с одним постоянным половым партнером в течение длительного времени, 2 (11,1%) пациентки одновременно имели половые контакты с двумя половыми партнерами. За период ведения половой жизни у 82 (41,4%) пациенток было до пяти половых партнеров, у 69 (34,8%) женщин - от шести до десяти партнеров, у 42 (21,2%) пациенток - от одиннадцати до двадцати партнеров, 5 (2,5%) пациенток,имели в своей сексуальной практике половые контакты с 20 и более партнерами. Среди пациенток II группы 80,3% обследованных имели половые контакты с одним половым партнером в течение длительного времени. У 52 (78,8%) пациенток в течение всего периода сексуальной практики было до пяти половых партнеров, у 8 (12,1%) женщин - от шести до десяти, у 6 (9,1%) женщин — от одиннадцати до двадцати половых партнеров (таблица 10).
Таблица 10 Результаты сексуального анамнеза (п=264) Анализируемые показатели I группа (п=198) II группа (п=66) Р абс. % абс. % Количество половых партнеров на момент обследования:0 1 2 29 1672 14,684,31,0 11 53 2 16,7 80,3 3,0 0,366 Количество половых партнеров за период ведения половой жизни:до 5от 6 до 10от 11 до 20более 20 82 6942 5 41,4 34,8 21,2 2,5 52 8 6 78,8 12,1 9,1 0,001 Таким образом, распределение по числу половых партнеров между группами значимо различалось: у пациенток I группы в среднем половых партнеров за весь период сексуальной практики было больше, чем у пациенток II группы. На применение барьерной контрацепции при половых контактах указывали 86 (43,4%) пациенток I группы, из них нерегулярно использовали презерватив 57 (28,8%) женщин, регулярно — 29 (14,6%) женщин, при этом 4 (2,0%)- пациентки сочетали нерегулярное использование презерватива с применением оральных контрацептивов. Более половины (112; 56;6%) опрошенных пациенток I группы отрицали применение презервативов:, при этом в качестве мер контрацепции 8 (7,1%) из них отдавали предпочтение оральным контрацептивам, применяя их на протяжении длительного времени, 19-(11,2%) - прерванному половому акту, 4 (2,4%) — местным спермицидам, 1 (0,6%) - внутриматочной спирали, 1 (0,6%) -физиологическому методу (таблица 11).
Частота использования презервативов:Регулярное использование Нерегулярное использование 29 57 14,6 28:8 30 16 45,5 24,2 0,001
Применение других методов контрацепции в условиях отсутствия или нерегулярного использования презервативов:Оральные контрацептивы Внутриматочная спираль Местные спермициды Прерванный половой акт Физиологический метод 12 1 4 19 1 7,10,62,411,20,6 64 16,7 11,1 0,404 0,9990,5750,459 0,999
Анализ полученных данных показал, что 30 (45,5%) пациенток. II группы регулярно использовали презерватив как метод барьерной контрацепции, 16 (24,2%) пациенток применяли его нерегулярно. Следует отметить, что среди обследованных пациенток II группы барьерную контрацепцию, не применяли 20 (30,1%) женщин. На долю использования оральных контрацептивов, пришлось 16,7% случаев, прерванного полового акта -11,1% случаев (таблица 11). Таким образом, отсутствие барьерной контрацепции либо нерегулярное ее применение достоверно чаще (р 0,001) наблюдалось у пациенток I группы.
Наиболее частыми формами половых контактов у пациенток I группы являлись генитально-оральные - у 99 (50,0%) обследованных. Только генитальные контакты практиковала 21 (10,6%) пациентка, генитально-анальные контакты - 6 (3,0%) пациенток. Все формы половых контактов (оральные, генитальные, анальные) в сексуальной практике отмечали 72 (36,4%) пациентки.
Пациентки II группы чаще практиковали только генитальные контакты (31 женщина - 47,0%) или генитально-оральные (27 женщин - 40,9%). Практику орально-генитально-анальных контактов отмечали 8 (12,1%) женщин. Генитально-анальные половые контакты пациентки контрольной группы не практиковали (рисунок 6).
Анализ полученных данных показал, что пациентки I группы достоверно чаще (р 0,001) практиковали нетрадиционные формы половых контактов, что представляло возможным предположить контаминацию условно-патогенными микроорганизмами несвойственными для их существования вне привычных экологических ниш, что приводит к воспалительным процессам слизистых оболочек нижних отделов урогенитального тракта.
В ходе изучения сексуального анамнеза обращало на себя внимание, что в большинстве наблюдений (61,0%) половые партнеры, женщин Г группы обследованы не были.1 Обследование 66 мужчин (половых партнеров женщин I группы) показало, что 49 (74,2%) из них были здоровыми, а у 17 (25,8%) в анамнезе была выявлена различная патология мочеполовой системы: неспецифический уретрит - у 8 (47,1%) обследованных, баланопостит — у 3 (17,6%) обследованных, хронический простатит - у 4 (23,5%) обследованных. Более половины партнеров (57,6%) пациенток II группы также не были обследованы. Из 28 (42,4%) обследованных половых партнеров у 2 (7,1%) был выявлен баланопостит, у 1 (3,6%) — хронический простатит, остальные 25 (37,9%) являлись здоровыми.
Согласно данным анамнеза, у 59 (29,8%) пациенток I группы до момента настоящего обследования регистрировались инфекции, передаваемые половым путем: хламидийная инфекция - у 30 (15,2%) обследованных, аногенитальные бородавки - у 16 (8,1%), трихомоноз — у 7 (3,5%), сифилис - у 4 (2,0%), гонорея - у 3 (1,5%) и генитальный герпес - у 3 (1,5%) обследованных.
Об ИППП в анамнезе свидетельствовала 21 (31,8%) пациентка контрольной группы: хламидийная инфекция выявлялась у 9 (13,6%) обследованных, аногенитальные бородавки — у 7 (10,6%), трихомоноз — у 4 (6,1%), генитальный герпес - у 4 (6,1%), сифилис - у 2 (3,0%), гонорея - у 1 (1,5%) обследованной (рисунок 7).
Резюмируя вышеизложенное, можно утверждать об отсутствии четкой взаимосвязи между частотой развития вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, и такими факторами риска как: акушерско-гинекологическая патология, применение оральных контрацептивов и других небарьерных средств предохранения, нарушение микрофлоры вагинального биотопа в анамнезе (нарушения, обусловленные генитальными, микоплазмами, бактериальный вагиноз, кандидоз вульвы и вагины), а так же наличие ИППП и очагов хронических инфекционных заболеваний.
Подбор олигонуклеатидных зондов для идентификации микроорганизмов
Чувствительность. ДНК-чипа для идентификации микроорганизмов оценивали отдельно для группы патогенных, непатогенных и условно-патогенных микроорганизмов. С целью изучения специфичности метода ДНК-чипа в исследование дополнительно были включены 14 женщин, у которых при обследовании были выявлены возбудители ИППП: Neisseria gonorrhoeae (2 (14,3%) пациентки), Chlamydia trachomatis (11 (78,6%) пациенток), Mycoplasma genitalium (3 (21,4%) пациентки). У 8 (57,14%) из 14 дополнительно включенных в исследование пациенток была выявлена Ureaplasma urealyticum.
По результатам бактериологического исследования биообразцов, полученных от 137 пациенток, был выявлен рост Lactobacillus spp. — у 65 (47,5%) обследованных, Gardnerella vaginalis — у 20 (14,6%), Е. coli — у (40,1%), Enterococcus faecalis - у 63 (45;9%); Enterococcus faecium - у 3-(2,2%), Staphylococcus aureus - у 1 (0,7%), Streptococcus spp. - у 5 (3,6%), Sti eptococcus anginosus — у 17 (12,4%), Fusobacterium nucleatum — у 20 (14,6%), Ureaplasma wealyticum - у 8 (5,8%), Neisseria gonorrhoeae - у 2 (1,5%). обследованных. Согласно результатам-исследования методом ПЦР у 11 (8%) пациенток былиь идентифицированы Chlamydia trachomatis, у 3 (2,2%) пациенток — Mycoplasma genitalium:
При исследовании методом ДНК-чипа данные микроорганизмы были выявлены Lactobacillus spp. — у 108 (78,8%) обследованных, Gardnerella vaginalis - у 21 (15,3%), Е. coli - у 55 (40,1%), Enterococcus faecalis - у 65 (47,4%), Enterococcus faecium — у 3 (2,2%), Staphylococcus aureus — у 1 (0,7%), Streptococcus spp. - у 6 (4,4%),- Streptococcus anginosus — у 20 (14,6%), Fusobacterium nucleatum - у 22 (16,1%), Ureaplasma urealyticum — у 8 (5,8%), Neisseria gonorrhoeae - у 2 (1,5%), Chlamydia trachomatis — у 11 (8%), Mycoplasma genitalium - у 3 (2,2%) обследованных.
Таким образом, на основании проведенного исследования показано, что- абсолютная (100,0%) чувствительность метода ДНК-чипа была-определена для непатогенных микроорганизмов, представленных Lactobacillus spp., патогенных микроорганизмов {Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis и Mycoplasma genitalium) и для группы следующих условно-патогенных микроорганизмов: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus spp., Enterococcus faecium, Streptococcus anginosus, Gardnerella vaginalis. Так же высокая-чувствительность исследуемого метода была отмечена для Fusobacterium nucleatum, которая составила 99,1% и для Enterococcus faecalis — 97,2%.
Определение чувствительности метода ДНК-чипа для большинства облигатных анаэробных микроорганизмов вызывало затруднение, в связи с тем, что данные микроорганизмы являются! труднокультивируемыми .и их идентификация возможна только с помощью молекулярно-биологических методов.
По результатам исследования, была установлена специфичность ДНК-чипа для ряда условно-патогенных микроорганизмов, которая составила 100,0% для Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecium и 96,9%o для Enterococcus faecalis. Для остальных микроорганизмов таких, как Streptococcus anginosus, Streptococcus spp., Fusobacterium nucleatum специфичность метода составила менее 87,0%), а для Lactobacillus spp. -60,2%. В связи с тем, что непатогенные и условно-патогенные микроорганизмы идентифицировались с помощью всех примененных методов исследования как у пациенток I группы, так и у пациенток II группы, интерпретация специфичности определения данных микроорганизмов на ДНК-чипе представляла затруднения. Поэтому показатель клинической специфичности оценивался в основном по отношению к возбудителям ИППП {Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis и Mycoplasma genitalium) (рисунок 12).
На основании того, что результаты идентификации патогенных микроорганизмов на ДНК чипе у 14 пациенток, дополнительно включенных в исследование, полностью совпали с результатами, полученными микробиологическими методами и методом ПЦР, их специфичность была оценена как 100,0%. А при. оценке специфичности для- непатогенных и условно-патогенных микроорганизмов на ДНК-чипе необходимы дополнительные исследования с использованием культур микроорганизмов, содержащих или не содержащих, определенный вид возбудителя;
Таким образом; установлена максимальная (100;0%) чувствительность выявления, для возбудителей ИПГШ (Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis и Mycoplasma genitalium); высокая- (97,2-100;0%) чувствительность для выявления1 ряда непатогенных и условно-патогенных микроорганизмов: Lactobacillus spp:, Escherichia coli, Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Gardnerella vaginalis, Fusobacterium nucleatum, Streptococcus anginosus). Также установлена максимальная (100,0%) специфичность выявления для.возбудителей:ИППП (Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis и Mycoplasma genitalium) и Enterococcus faecium. Низкая (менее 87,0%) специфичность метода выявлена для Streptococcus anginosus, Streptococcus spp., Fusobacterium nucleatum и 60,2% — для Lactobacillus spp.. Подобные значения низкой специфичности выявления микроорганизмов в клиническом материале на ДНК-чипе для ряда условно-патогенных микроорганизмов могут объясняться недостаточным количеством биоматериала, полученного от пациентов- на этапе забора биоматериала и/или выделении бактериальной ДНК, а также недостаточным количеством амплифицированного продукта на этапе амплификации фрагментов бактериальной ДНК, что диктует необходимость дальнейших исследований.
Оценка экономической целесообразности использования ДНК-чипа в сравнении с микробиологическим методом и методом ПЦР Расчет себестоимости производился в соответствии с «Методическими рекомендациями по расчету себестоимости медицинских услуг в учреждениях здравоохранения». Данные расчета стоимости одного исследования, проводимого с использование ДНК-чипов, представлены в таблице 21. Себестоимость оного исследования методом ДНК-чипов-составила 713,95 рублей:
