Введение к работе
Актуальность проблемы.
Несмотря на снижение показателей заболеваемости сифилисом в России за последние три года, эпидемиологическая ситуация остается весьма напряженной. На фоне эпидемии существенно увеличилась регистрация форм заболевания, почти не встречавшихся в предыдущие десятилетия, таких, как врожденный сифилис, ранний нейросифилис (Лосева O.K. и соавт.,1998; Тихонова Л.И. и соавт., 2001). Кроме того, современный этап характеризуется преобладанием скрытых форм и наметившимся учащением случаев поздних форм сифилиса (Шувалова Т.М и соавт., 1998). В связи с этим возрастает роль научных исследований, направленных на совершенствование методов диагностики данного заболевания.
В настоящее время ведущее место в лабораторной диагностике сифилиса занимают серологические методы. Так как ни одна из предложенных серологических реакций не обладает абсолютной чувствительностью и специфичностью, диагностика сифилиса основывается на комплексном использовании скрининговых и подтверждающих тестов (Приказ МЗ РФ № 87 от 26.03.2001 г. «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса»).
Особенности биологии бледной трепонемы - трудность культивирования, наличие атипичных форм (цист, гранул и L-форм), нахождение возбудителя в труднодоступных для исследования очагах, полимембранных фагосомах, внутриядерное паразитирование, - сужает возможности общепринятых методов диагностики, в связи с чем разработка новых высокочувствительных и высокоспецифичных методов, позволяющих поднять диагностику сифилиса на качественно новый уровень, представляет теоретический и практический интерес (Дмитриев Г.А., 1999; Фриго Н.В., 2001).
Одним из перспективных направлений в современной лабораторной диагностике сифилиса является разработка ДНК-методов, в частности полимеразной цепной реакции (ПЦР). На сегодняшний день в России и за
рубежом ведутся, но еще далеки от завершения исследования, касающиеся оптимального выбора праймеров, методов экстракции ДНК/РНК, определения сроков сохранности ДІЖ/РНК в клиническом материале, места ПЦР среди других лабораторных тестов, в связи с чем метод в настоящее время имеет только исследовательский статус.
Публикации, касающиеся анализа результатов применения ПЦР в контексте рассматриваемой темы, представляют значительную редкость, носят предварительный и часто противоречивый характер, что аргументировало проведение исследований в данном направлении. Цель исследования:
Оценить возможности метода полимеразной цепной реакции в детекции бледной трспонсмы в биологических жидкостях больных сифилисом. Задачи исследования:
-
Определить оптимальные мишени и условия постановки ПЦР для обеспечения надежной детекции ДНК/РНК.
-
Определить оптимальные способы подготовки проб, позволяющие максимально эффективно и в короткое время экстрагировать ДНК и РНК из образцов клинического материала и проводить ПЦР-анализ в условиях клинической лаборатории в течение рабочего дня.
-
Определить возможные сроки сохранности ДНК и РНК T.pallidum.
-
Определить чувствительность ПЦР на препаратах очищенной ДНК и лизатах клеток патогенных спирохет, модельных образцах и клиническом материале.
-
Провести сравнительный анализ результатов регламентированных методов диагностики сифилиса и ПЦР-анализа на различных стадиях заболевания.
Научная новизна и практическая значимость исследования:
Впервые применен высокочувствительный вариант ПЦР с использованием обратной транскриптазы (РТ-ПЦР) на 16S рРНК T.pallidmn для исследования клинического материала от больных различными формами
ифилиса (решение о выдаче патента на изобретение «Способ выявления 'reponema pallidum у больных сифилисом» по заявке №2000133049.Приоритет 9.12.2000.).
Модифицированы и определены оптимальные методы экстракции ДНК и НК из клинических образцов для проведения анализа.
Полученные данные о сохранности амплифицируемых
оследовательностей 16S рРНК T.pallidum позволяют разработать адекватные ребования к транспортировке и хранению клинического материала.
Установлена более высокая чувствительность метода ПЦР при сследовании соскобов с эрозивных и язвенных сифилидов в сравнении с емнопольной микроскопией, что дает возможность использования ПЦР-нализа в диагностике первичного сифилиса.
Результаты исследования ликвора представляют базу для дальнейших сследовании с целью определения места ПЦР в диагностике нейросифилиса.
)сновные положения, выносимые на защиту:
. Разработана высокочувствительная тест-система ПЦР с обратной транскрипцией на 16S рРНК T.pallidum, позволяющая детектировать 1-0,1 микроорганизма в пробе.
. Определена длительная (до 8 недель) сохранность амплифицируемой последовательности 16S рРНК, что расширяет возможности применения дашгой методики в научно-исследовательских и диагностических целях.
. Показана более высокая чувствительность ПЦР с обратной транскрипцией на 16S рРНК T.pallidum по сравнению с темнополыюй микроскопией при исследовании соскобов с эрозивных и язвенных сифилидов.
. Установлена необходимость предварительной подготовки клинического материала, что позволяет снизить влияние ингибиторов с одновременным повышением чувствительности ПЦР.
6 Апробация работы.
Результаты исследований и основные положения диссертации доложены и обсуждены на:
3 Всероссийской конференции «ПЦР-генодиагностика инфекционных заболеваний», г. Москва, 27-29 января 2000г.
VIII Всероссийском съезде дерматологов и венерологов, г. Москва, 19-22 июня 2001г.
Международном конгрессе по ИППП и ВИЧ, г. Берлин, 24-27 июня 2001 г.
Научно-практической конференции ЦНИКВИ, г. Москва, 22 февраля 2002 г.
Публикации:
По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.
Структура и объем работы.
![Возможности коррекции адаптационных реакций фитоплацентарного комплекса в III триместре беременности [Электронный ресурс]](/i/i/4318/201040.png "Возможности коррекции адаптационных реакций фитоплацентарного комплекса в III триместре беременности [Электронный ресурс] Хоменко Юлия Борисовна")
