Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Генетические и иммунологические аспекты патогенеза псориаза (обзор литературы) 17
1.1. Общие сведения о псориазе 17
1.2. Гены предрасположенности псориаза 18
1.2.1. Роль апоптоза в патогенезе псориаза 25
1.2.2. Регуляция программируемой клеточной гибели 26
1.2.2.1. Рецепторы семейства фактора некроза опухолей 28
1.2.2.2. Семейство цистеиновых протеаз 30
1.2.2.3. Семейство белков Вс1-2 31
1.2.2.4. Другие участники апоптоза 32
1.2.3. Полиморфизм гена IL12B 34
1.2.4. Полиморфизм гена TRAF3IP2 36
1.3. Современные представления об иммунных механизмах развития псориаза 38
1.3.1. Роль Т-лимфоцитов в патогенезе псориаза 39
1.3.1.1. Т-хелперы 1 типа 40
1.3.1.2. Т-хелперы 17 типа 41
1.3.1.3. Т-регуляторные лимфоциты 44
1.3.1.4. Т-клетки памяти 48
1.3.2. Роль дендритных клеток в патогенезе псориаза 50
1.3.3. Участие лимфоиднои ткани, ассоциированной с кожей, в патогенезе псориаза 53
1.4. Резюме 57
Глава 2. Материалы и методы исследования 59
2.1. Общая характеристика больных 59
2.2. Оценка частоты генных полиморфизмов в группах больных псориазом и здоровых доноров 63
2.2.1. Выделение ДНК из лейкоцитов 63
2.2.2. Генотипирование 64
2.2.2.1. Выбор генов-кандидатов и генных полиморфизмов 65
2.2.2.1.1. Полиморфные гены программируемой клеточной гибели 65
2.2.2.1.2. Полиморфные гены цитокина IL12B и адаптера Тп17-лимфоцитов -TRAF3IP2 67
2.2.2.2. Аллель-специфическая ПЦР в режиме «реального времени» 68
2.2.2.3. Контроль результатов ПЦР-амплификации 75
2.2.2.4. Рестрикционный метод ПНР 76
2.3. Анализ уровня экспрессии мРНК генов в коже 77
2.3.1. Проведение биопсии кожи 77
2.3.2. Выделение мРНК из срезов кожи 77
2.3.3. Определение экспрессии мРНК генов в коже 78
2.4. Определение содержания Т-регуляторных клеток в периферической крови 80
2.5. Микроскопическое исследование кожи 82
2.5.1. Гистологическое исследование 83
2.5.2. Непрямой иммуногистохимический метод исследования 83
2.6. Статистический анализ 86
Глава 3. Результаты генотипирования образцов ДНК 92
3.1. Анализ распределения генотипов и аллелей полиморфных генов программируемой клеточной гибели 92
3.1.1. Ген DR4Glu228Ala (А228С) 93
3.1.2. reHDR4Lys441Arg (A441G) 98
3.1.3. reHCaspl0Ile479Leu(A479T) 105
3.1.4. Ген p53Arg72Pro (G72C) 110
3.1.5. Генные полиморфизмы, которые были исключены из исследования 120
3.1.6. Генные полиморфизмы, которые не были обнаружены в исследованных выборках 121
3.1.7. Полиморфные гены апоптоза, у которых не обнаружена ассоциация с предрасположенностью к псориазу 122
3.2. reHlL12BA/Trsl2188300 129
3.3. Ген TRAF3IP2 Trp74Arg (A74G) 135
3.4. Резюме 140
Глава 4. Определение уровня экспрессии мРНК генов в коже больных псориазом и здоровых людей 143
4.1. ГенГЮХРЗ 143
4.2. TeHTNFa 146
4.3. reHTRAF3IP2 150
4.4. TeHlL17RA 153
4.5. Резюме 156
Глава 5. Определение количества Т-регуляторных лимфоцитов в периферической крови 158
5.1. Относительное и абсолютное содержание Т-регуляторных клеток в периферической крови 158
5.2. Резюме 164
Глава 6. Морфологическое исследование кожи больных псориазом и здоровых лиц 169
6.1. Гистологическое исследование срезов кожи 169
6.2. Иммуногистохимическое исследование срезов кожи 173
6.2.1. Результаты иммуногистохимического исследования кожи с маркерами В-лимфоцитов 174
6.2.1.1. СЭ20+-клетки 174
6.2.1.2. СБ79а+-клетки 176
6.2.1.3. Рах5+-клетки 178
6.2.2. Результаты иммуногистохимического исследования кожи с маркерами Т-лимфоцитов 181
6.2.2.1. СОЗ+-клетки 181
6.2.2.2. СБ4+-клетки 184
6.2.2.3. СБ8+-клетки 187
6.2.2.4. CD45RA+-miensH 191
6.2.2.5. CD45RO+-ioieTKH 194
6.2.2.6. ІІЛ7А+-клетки 197
6.2.2.7. FOXP3+-ioieTKH 200
6.2.3. Результаты иммуногистохимического исследования кожи с маркерами дендритных клеток 203
6.2.3.1. СБ1а+-клетки 203
6.2.3.2. CD207/Langerin+-ioieTKH 207
6.2.3.3. С011с+-клетки 210
6.2.3.4. СВ83+-клетки 214
6.2.3.5. СВ23+-клетки 219
6.2.4. Результаты иммуногистохимического исследования кожи с маркерами пролиферации и ингибиторов апоптоза 221
6.2.4.1. Кі67+-клетки 221
6.2.4.2. «Двойные позитивные» СОЗє+-Кі67+-клетки 224
6.2.4.3. Вс1-2+-клетки 227
6.2.4.4. Вс1-6+-клетки 230
6.2.5. Иммуногистохимические параметры кожи больных псориазом с различными генотипами гюлиморфных генов 233
6.3. Резюме 236
Заключение 243
Выводы 253
Практические рекомендации 256
Список литературы 258
- Т-регуляторные лимфоциты
- Ген DR4Glu228Ala (А228С)
- Относительное и абсолютное содержание Т-регуляторных клеток в периферической крови
- СБ8+-клетки
Введение к работе
Актуальность исследования. Псориаз является распространенным хроническим мультифакториальным иммуноопосредованным воспалительным заболеванием кожи и суставов [Nograles K.E. et al., 2010, Perera G.K. et al., 2012]. Развитие псориаза происходит у генетически предрасположенных людей под воздействием провоцирующих факторов окружающей среды [Молочков В.А. и др., 2007, Фриго Н.В. и др., 2009, Кунгуров Н.В. и др., 2011b, Минеева А.А. и др., 2012, Nair R.P. et al., 2010, Oka A. et al., 2012]. Повышенный научный интерес к псориазу, многочисленные исследования, направленные на изучение механизмов его развития, обусловлены высокой распространенностью этого дерматоза, социальной и психологической дезадаптацией больных [Кубанова А.А. и др., 2010a, Бутов Ю.С. и др., 2011, Самцов А.В., 2011, Терлецкий О.В., 2011, Потекаев Н.Н., Серов А.Н., 2012b, Langenbruch A.K. et al., 2012, Parrish L., 2012,]. Многие исследователи отмечают повышение частоты тяжелых и резистентных к терапии форм псориаза, удлинение сроков нетрудоспособности больных, увеличение финансовых затрат на лечение [Перламутров Ю.Н., Ольховская К.Б., 2007, Курдина М.И., 2011, Кунгуров Н.В. и др., 2012].
Известные в настоящее время гены предрасположенности псориаза лишь частично раскрывают этапы развития этого дерматоза [Павлова О.В., Скрипкин Ю.К., 2007, Кубанова А.А. и др., 2010b, Львов А.Н. и др., 2012, Duffin K.С. et al., 2009]. Выявление генетических маркеров позволяет определить риск развития заболевания, прогнозировать клиническое течение болезни, осуществлять персонализированный подбор методов лечения [Федорова С.А., Хуснутдинова Э.К., 2010, Фриго Н.В. и др., 2010, Hebert H.L. et al., 2012]. В последние десятилетия проводится интенсивный поиск генов, ассоциированных с предрасположенностью к развитию псориаза и его фенотипическими проявлениями, генетических детерминант эффективности различных методов терапии [Пирузян Э.С. и др., 2009, Ellinghaus E. et al., 2010, Duffin K.С. et al., 2009, Strange A. et al., 2010].
Программируемая клеточная гибель является основным регулятором распространенности и продолжительности иммунного воспаления. После реализации эффекторных функций значительная часть иммунокомпетентных клеток удаляется из организма путем апоптоза, что приводит к подавлению воспалительного процесса [Elmore S., 2007, Xu G., Shi Y., 2007, Mueller D.L., 2010]. Снижение интенсивности программируемой клеточной гибели сопровождается развитием избыточного иммунного воспаления и аутоагрессии. Нарушение программируемой клеточной гибели может являться ключевым звеном в развитии псориаза [Владимиров В.В. и др., 2010, Минеева А.А. и др., 2012, De la Fuente H. et al., 2012, Meisgen F. et al, 2012]. Предполагается, что дефицит активности апоптоза при псориазе приводит к замедлению элиминации дендритных клеток и Т-лимфоцитов, аккумуляции этих клеток в очагах воспаления и избыточной продукции ими провоспалительных медиаторов – цитокинов, хемокинов, молекул адгезии, факторов роста [Кубанов А.А., Петровский Ф.И., 2009, Владимирова Е.В. и др., 2011, Kastelan M. et al., 2009, Vereecke L., 2011, Favaloro B. et al., 2012].
Вариабельность интенсивности программируемой клеточной гибели у разных людей, обусловленная их генетической гетерогенностью, может объяснить существующие различия в характере течения псориаза и ответе этих больных на проводимую терапию [Bulat V. et al., 2011, Shishodia S., 2012, Meisgen F. et al., 2012, Sun J. et al., 2012]. Программируемая клеточная гибель является генетически регулируемым процессом. Наиболее распространенной разновидностью вариации генома являются генные полиморфизмы, которые широко представлены в популяции, и, в отличие от мутаций, приводящих к снижению жизнеспособность организма, имеют менее заметные фенотипические проявления [Imyanitov E.N., 2009, Уткин О.В., Новиков В.В., 2012]. Исследование полиморфных генов апоптоза представляется перспективным в плане выявления генетических факторов, влияющих на предрасположенность к развитию псориаза и клинические проявления заболевания.
Ген IL12B кодирует белок р40, являющийся общей субъединицей интерлейкина-12 и интерлейкина-23. Интерлейкин-23 вовлечен в дифференцировку «наивных» Т-лимфоцитов в Т-хелперы 17 типа (Th17), играющих значимую роль в развитии псориаза [Кубанова А.А. и др., 2010a, Nestle F.O. et al., 2009, Ellinghaus E., et al., 2010]. Ген TRAF3IP2 кодирует протеин, взаимодействующий с белком TRAF3 (TRAF3 – фактор-3, связывающий рецептор фактора некроза опухолей). Белок TRAF3IP2 обладает протеинкиназной активностью и участвует в проведении сигнала от мембранного рецептора в ядро через транскрипционный фактор NF-B. Белок TRAF3IP2 необходим для реализации аутоиммунного «интерлейкин-17-зависимого» воспаления [Qian Y. et al., 2007, Liu C. et al., 2009, Huffmeier U. et al., 2010].
В нормальной коже в ответ на внедрение патогена развивается защитный воспалительный ответ, длительность, амплитуда и масштабы которого регулируются в зависимости от степени повреждения тканей [Eming S.A. et al., 2007]. При псориазе происходит нарушение регуляции факторов, контролирующих формирование и адекватность патофизиологической воспалительной реакции [Катунина О.Р., Резайкина А.В., 2011, Потекаев Н.Н., Серов А.Н., 2012b, Coimbra S. et al., 2012]. Следствием этого является развитие патологического иммунного ответа, характеризующегося хроническим течением воспалительного процесса, чрезмерной его выраженностью (аутоагрессивностью) и системностью поражений [Nograles K.E. et al., 2010, Perera G.K. et al., 2012]. Псориаз представляет модель Т-клеточно-опосредованного аутоиммунного заболевания. Патоморфологические изменения кожи и суставов являются результатом воспалительного процесса, вызванного накоплением в этих тканях активированных Т-лимфоцитов и дендритных клеток, продуцирующих медиаторы воспаления [Клеменова И.А., Алейник Д.Я., 2007, Мордовцев В.Н. и др., 2009, Знаменская Л.Ф. и др., 2011b, Nestle F.O., 2009, Valdimarsson H. et al., 2009, Perera G.K. et al., 2012, Coimbra S., 2012]. Исследование в пораженной коже популяций клеток, инициирующих иммунный ответ при псориазе, контролирующих его выраженность и продолжительность, их количественные изменения, а также изучение экспрессии мРНК основных медиаторов воспаления позволит глубже понять иммунопатогенез этого заболевания [Данилов С.И., Кашутин С.Л., 2010, Катунина О.Р., 2010a, Знаменская Л.Ф., 2011a].
Расширение фундаментальных и прикладных исследований в области изучения генетических основ и иммунопатогенеза псориаза является одной из актуальных научных проблем современной дерматовенерологии и основой для реализации перспективного направления совершенствования медицинской науки – развития персонализированной и доказательной медицины, фармакогенетики. Выявление новых генетических маркеров предрасположенности, разработка метода прогнозирования развития псориаза, псориатического артрита, степени тяжести заболевания на основании данных генотипирования позволит осуществлять индивидуальный подбор методов лечения и определять дальнейшую стратегию терапии. Научная оценка роли генетических и иммунологических факторов в формировании псориаза и его клинических проявлений лежит в русле развития и внедрения инновационных методов диагностики и высокотехнологичной медицинской помощи, совершенствования современной дерматовенерологии и клинической лабораторной диагностики, определенных государственной программой «Развитие здравоохранения в Российской Федерации», утвержденной Распоряжением Правительства РФ № 2511-p от 24 декабря 2012, Приказом Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 16 марта 2010 года № 151н «Об утверждении порядка оказания медицинской помощи больным дерматовенерологического профиля и больным лепрой».
Цель исследования – изучить роль полиморфных генов программируемой клеточной гибели, Т-лимфоцитов и дендритных клеток в патогенезе псориаза.
Задачи исследования:
-
Изучить частоту полиморфных аллелей генов программируемой клеточной гибели у больных псориазом, выявить варианты, ассоциированные с риском развития псориаза.
-
Провести анализ ассоциаций полиморфизмов генов апоптоза у больных псориазом с различными клиническими проявлениями заболевания в зависимости от наличия псориатического артрита, сезонности обострений, характера течения, степени тяжести.
-
Разработать критерии оценки риска развития и прогноза течения псориаза на основании результатов генотипирования и оценить прогностическую значимость метода генетического тестирования.
-
Исследовать уровень экспрессии мРНК генов ядерного фактора транскрипции FOXP3, цитокина TNF, адаптера Th17-лимфоцитов TRAF3IP2, рецептора цитокина IL17A – IL17RA в коже больных псориазом, изучить их корреляцию с генотипом, численностью субпопуляций Т-лимфоцитов, дендритных клеток и клиническими проявлениями заболевания.
-
Оценить содержание Т-регуляторных лимфоцитов в периферической крови больных псориазом в разные периоды заболевания.
-
Проанализировать клеточный состав воспалительного инфильтрата кожи больных псориазом: В- и Т-лимфоцитов, дендритных клеток, активности пролиферации и ингибирования апоптоза клеток с учетом периода заболевания.
-
Выявить взаимосвязь между численностью субпопуляций Т-лимфоцитов, дендритных клеток, активностью пролиферации и клиническими проявлениями псориаза.
Научная новизна. Впервые проведено систематическое молекулярно-эпидемиологическое исследование полиморфизмов генов программируемой клеточной гибели, направленное на выявление генетических маркеров предрасположенности к псориазу. Установлено, что в формировании генетической компоненты развития псориаза значимая роль принадлежит полиморфизму генов апоптоза и медиаторов воспаления: DR4 Glu228Ala, Casp10 Ile479Leu, rs12188300 IL12B A/T и TRAF3IP2 Trp74Arg.
Обнаружены новые генетические детерминанты, ассоциированные с риском развития псориатического артрита: аллель G (Arg) гена DR4 Lys441Arg и аллель Т полиморфизма rs12188300 гена IL12B A/T. Выявлены полиморфные варианты, ассоциированные с клиническими особенностями течения псориаза: аллель А (Lys) гена DR4 Lys441Arg – со степенью тяжести, аллель G (Arg) DR4 Lys441Arg – с сезонностью заболевания.
Выявлено изменение уровня экспрессии мРНК генов FOXP3, TNF и IL17RA в пораженной коже больных псориазом в зависимости от клинической картины заболевания и генотипа пациента. Определены особенности динамики численности Т-регуляторных лимфоцитов в периферической крови больных в разные периоды псориаза, содержание Т-регуляторных клеток с учетом особенностей клинических проявлений болезни.
Установлено, что в коже больных псориазом в прогрессирующий период в дермальных инфильтратах в основании псориатических папул наблюдается пролиферация Т-лимфоцитов, что свидетельствует об участии интрадермальной пролиферации Т-клеток в формировании иммунного ответа при рецидивах псориаза. У больных псориазом в ремиссию в коже на месте разрешившейся псориатической папулы количество Т-клеток памяти (CD45RO+), дендритных клеток (CD83+- и CD11c+), клеток, экспрессирующих маркеры ингибирования апоптоза (bcl2 и bcl6), в несколько раз превышает аналогичные показатели в коже здоровых людей.
Практическая значимость работы. Разработан и научно обоснован генетический метод прогнозирования развития и течения псориаза. Включение новых генетических маркеров псориаза – полиморфизмов генов DR4 Glu228Ala, Casp10 Ile479Leu, rs12188300 IL12B A/T, TRAF3IP2 Trp74Arg в генетическое тестирование, выполняемое родственникам больного псориазом первой и второй степени родства, необходимо для оценки риска развития заболевания.
Для носителей аллеля Ala гена DR4 Glu228Ala риск развития псориаза увеличивается в 1,6 раза, аллеля Ile гена Casp10 Ile479Leu – в 2,8 раза, аллеля Т полиморфизма rs12188300 гена IL12B A/T – в 1,8 раза и аллель Trp гена TRAF3IP2 Trp74Arg – в 1,5 раза. Сведения о высоком риске развития псориаза, полученные в ходе генетического тестирования лиц с отягощенным по псориазу семейным анамнезом, целесообразно использовать при их профессиональной ориентации.
Больным псориазом целесообразно проведение генотипирования для оценки риска развития псориатического артрита и характера течения болезни. Аллель Arg гена DR4 Lys441Arg повышает риск формирования псориатического артрита в 2,7 раза, аллель Т полиморфизма rs12188300 гена IL12B A/T – в 2,1 раза, аллель Lys гена DR4 Lys441Arg увеличивает риск развития тяжелой степени псориаза в 2,6 раза, аллель Arg DR4 Lys441Arg летнюю форму заболевания – в 2,0 раза.
Присутствие в генотипе больного псориазом аллеля Arg гена DR4 Lys441Arg и аллеля Т полиморфизма rs12188300 гена IL12B A/T ассоциировано с высоким риском формирования псориатического артрита и развития тяжелой формы псориаза. Таким больным необходимо более активное проведение цитостатической и иммуносупрессивной терапии для ранней профилактики развития осложнений и снижения уровня инвалидизации.
Полученные результаты исследования численности, соотношения и динамики субпопуляций дендритных клеток и Т-лимфоцитов в разные периоды псориаза, выявление возможности пролиферации Т-лимфоцитов в коже больных псориазом в период обострения могут быть использованы для оптимизации существующих методов лечения псориаза и научно-обоснованной разработки новых способов его терапии, ориентированных на тропные к коже или транскутанно действующие средства таргетного подавления иммунного воспаления.
Личное участие автора в получении результатов. Диссертант подготовил обзор литературных данных по теме исследования, разработал дизайн исследования, выполнил отбор пациентов, сбор жалоб и данных анамнеза заболевания, изучение медицинской документации, весь объем клинических исследований, осуществил забор и гистологическую обработку биопсийного материала, подбор праймеров и оптимизацию условий ПЦР, генотипирование образцов ДНК, определение в коже уровня экспрессии мРНК генов медиаторов воспаления. Провел анализ и фотодокументирование полученных гистологических и иммуногистохимических препаратов, с применением компьютерной программы анализа изображения осуществил морфометрический анализ исследуемых препаратов. Автор выполнил формирование базы данных, провел обработку полученных результатов, их статистический анализ и обобщение, интерпретировал полученные данные, сформулировал выводы, разработал и обосновал практические рекомендации.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Полиморфные гены DR4 Glu228Ala, Casp10 Ile479Leu, IL12B A/T (rs12188300), TRAF3IP2 Trp74Arg ассоциированы с развитием псориаза, DR4 Lys441Arg и rs12188300 IL12B A/T – развитием псориатического артрита, DR4 Lys441Arg – степенью тяжести псориаза, DR4 Lys441Arg – сезонностью обострений заболевания.
-
Уровень экспрессии мРНК генов IL17RA и FOXP3 в коже больных псориазом в прогрессирующий период выше, чем в коже здоровых людей. Экспрессия мРНК FOXP3 и TNF в коже пациентов с псориазом в ремиссию превышает экспрессию этих генов у здоровых лиц. Имеется ассоциация между уровнем экспрессии мРНК FOXP3 и полиморфным геном р53 Arg72Pro.
-
Абсолютное и относительное количество Т-регуляторных лимфоцитов в периферической крови пациентов с псориазом больше, чем у здоровых людей. Наиболее высокие показатели абсолютного числа Т-регуляторных клеток в крови наблюдаются в прогрессирующий период у больных псориазом и псориатическим артритом. Генотип Arg/Arg гена DR4 Lys441Arg у больных псориазом ассоциирован с повышенным абсолютным количеством Т-регуляторных клеток в крови.
-
Воспалительный инфильтрат в пораженной коже больных псориазом состоит преимущественно из Т-лимфоцитов и дендритных клеток, среди которых преобладают эффекторные CD45RO+-лимфоциты и CD11c+-клетки, в период ремиссии в коже на месте разрешившейся псориатической папулы количество Т-клеток памяти (CD45RO+), дендритных клеток (CD83+- и CD11c+) в несколько раз превышает их численность у здоровых людей. В коже больных псориазом в прогрессирующий период в области поражений наблюдается пролиферация Т-лимфоцитов.
-
Гетерозиготный генотип АТ гена IL12B A/T ассоциирован с морфометрическими параметрами пораженной кожи больных псориазом: увеличением толщина эпидермиса, количества Ki67+-клеток эпидермиса, IL17A+, CD1a+- и CD207+-клеток.
Апробация результатов. Основные положения работы доложены и обсуждены на: II Всероссийском конгрессе дерматовенерологов (Санкт-Петербург, 2007); X Всероссийском съезде дерматовенерологов и косметологов (Москва, 2008); II Российской научно-практической конференции «Санкт-Петербргские дерматологические чтения» (Санкт-Петербург, 2008); Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» (Санкт-Петербург, 2008); III Всероссийском конгрессе дерматовенерологов (г. Казань, 2009); II Континентальном конгрессе дерматологов международного дерматологического общества, IV Всероссийского конгресса дерматовенерологов (Санкт-Петербург, 2011); X научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения больных в многопрофильном лечебном учреждении» (Санкт-Петербург, 2011); 20-го конгрессе Европейской Академии дерматологии и венерологии (EADV) (г. Лиссабон, Португалия, 2011); 9-й весенней сессии Европейской Академии дерматологии и венерологии (EADV) (г. Верона, Италия, 2012); III Международной научной конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий» (г. Казань, 2012); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Терапевтическая школа С.П. Боткина и ее вклад в развитие отечественной клинической медицины» (Санкт-Петербург, 2012); VI Российской научно-практической конференции «Санкт-Петербургские дерматологические чтения» (Санкт-Петербург, 2012).
Реализация и внедрение полученных результатов исследования. Результаты настоящего исследования внедрены в учебную, научно-исследовательскую и клинико-диагностическую работу кафедры кожных и венерических болезней ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ, ФГБУ «НИИ Онкологии им. Н.Н. Петрова» МЗ РФ, ФГБУ «Уральский НИИ дерматовенерологии и иммунопатологии» МЗ РФ, ГБОУ ВПО «Северный государственный медицинский университет» МЗ РФ, ФГКУ «442 Окружной военный клинический госпиталь Западного военного округа» МО РФ, Центра генной диагностики ФКУЗ «Ростовский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора России.
Основные положения диссертации опубликованы в 36 научных работах, из которых 17 – в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 281 странице компьютерного текста, иллюстрирована 100 таблицами и 75 рисунками. Состоит из введения, 6 глав с описанием данных литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, содержащего 61 источник на русском и 212 источников на иностранных языках.
Т-регуляторные лимфоциты
Т-регуляторные клетки представляют субпопуляцию Т-лимфоцитов и выполняют значимую роль в поддержании иммунологической толерантности в организме. Они контролируют силу и продолжительность иммунного ответа через угнетение активности Т-хелперов и Т-цитотоксических клеток. Дисбаланс между регуляторными и эффекторными клетками приводит к неадекватному иммунному ответу при псориазе и является центральным звеном в патогенезе этого заболевания [Tang Q., Bluestone J.A., 2008]. Предполагается существование двух подклассов Т-регуляторных клеток: врожденные или естественные, созревающие в тимусе, и индуцибельные или адаптивные, образующиеся из недифференцированных (наивных) Т-лимфоцитов на периферии [Bluestone J.A., Abbas А.К., 2003]. Т-регуляторные клетки оказывают супрессорное действие на эффекторные Т-лимфоциты и антигенпрезентирующие клетки посредством секреции интерлейкина-10 (IL10) и трансформирующего фактора роста-р\ Кроме того, естественные Т-регуляторные клетки способны к подавлению аутоиммунных реакций путем цитокин-независимого межклеточного взаимодействия [Bacchetta R. et al., 2005]. Воспалительный процесс в псориатических очагах больных псориазом поддерживается за счет Т-клеточных иммунных механизмов. Активация Т-лимфоцитов в пораженной коже сопровождается продукцией провоспалительных цитокинов и факторов роста, приводящих к избыточной пролиферации кератиноцитов и нарушению их дифференцировки [Nestle F.O., 2008].
Специфичным маркером Т-регуляторных клеток является транскрипционный фактор FOXP3 (ядерный фактор транскрипции-3, связанный с X хромосомой), посредством которого реализуется их супрессорная активность [Fontenot J.D., Rudensky A.Y., 2005]. Продемонстрировано, что FOXP3 может ингибировать факторы транскрипции NFAT (ядерный фактор активированных Т-лимфоцитов) и NFKB (ядерный фактор транскрипции каппа В), контролирующие реализацию клеточного иммунного ответа при псориазе [Bettelli Е. et al., 2005]. Транскрипционные факторы NFAT и NFKB, взаимодействуя с промоторными и/или энхансерными участками генов, регулируют транскрипцию генов, ответственных за дифференцировку Т-клеток и экспрессию мРНК важнейших медиаторов воспаления - цитокинов (TNF-a, y-IFN, IL-2 (интерлейкина-2) и др.), факторов роста клеток (GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора)) и IL-3 (интерлейкина-3), мембранных костимулирующих молекул (CD40L (лиганда молекулы CD40) и CTLA-4 (антигена цитотоксических Т-лимфоцитов-4)), молекул адгезии (ICAM (молекулы межклеточной адгезии), VCAM (молекулы адгезии эндотелия сосудов)) и хемокинов [Feske S. et al., 2000, Куклина Е.М., Ширшев СВ., 2001].
Известно, что индукция FOXP3 в наивных С04-позитивных Т-клетках посредством TGF-p (трансформирующего фактора роста-р) ведёт к увеличению числа Т-регуляторных клеток [Chen W. et al., 2003]. Бельтюкова А.С. с соавт. (2010) обнаружили у больных псориазом увеличение экспрессии гена FOXP3 как в пораженной, так и в визуально здоровой коже [Бельтюкова А.С. и др., 2010]. При исследовании биоптатов кожи больных псориазом Yun W.J. с соавт. (2010) выявили коррелирующее с тяжестью болезни увеличение Т-регуляторных клеток в очагах поражения, по сравнению с кожей здоровых людей. Кроме этого, они обнаружили снижение количества Т-регуляторных лимфоцитов у пациентов в начале развития обострения псориаза. В периферической крови различий в количестве Т-регуляторных клеток между группами больных псориазом и здоровых доноров не было найдено [Yun W.J. et al., 2010].
Sugiyama H. с соавт. (2005) провели исследование функциональных свойств Т-регуляторных клеток, извлеченных из псориатических очагов и периферической крови больных псориазом и здоровых лиц. Они обнаружили, что содержание Т-регуляторных клеток в крови не имело различий, но у больных псориазом выявлялось нарушение их активности. Это нарушение проявлялось в снижении способности подавлять стимулированную аллоантигеном пролиферацию С04+СБ25-Т-лимфоцитов in vitro [Sugiyama Н. et al., 2005].
Неожиданные результаты были получены в эксперименте Bovenschen H.J. с соавт. Они обнаружили способность Т-регуляторных клеток, экспрессирующих FOXP3+, в псориатических очагах в условиях высокого содержания IL23 дифференцироваться в клетки продуцирующие ИЛ17А. Эти Т-лимфоциты имели фенотип CD4+IL17A+FOXP3+ [Bovenschen H.J. et al., 2011].
Многие исследователи предполагают, что процесс воспаления при псориазе имеет аутоиммунную природу [Nestle F.O., 2008, Valdimarsson Н. et al., 2009]. В то же время, у больных системной красной волчанкой, представляющей классическое аутоиммунное заболевание, отмечается значительное снижение Т-регуляторных клеток в периферической крови, которое зависит от активности процесса [Liu M.F. et al., 2004]. При исследовании больных ювенильным идиопатическим артритом Olivito В. с соавт. обнаружили значительное снижение Т-регуляторных и повышение ТЫ7-клеток в периферической крови, по сравнению со здоровыми подростками. При этом в синовиальной жидкости пораженных суставов отмечалась более высокая экспрессия мРНК FOXP3, чем в контроле. Выявлено почти трехкратное увеличение концентрации транскрипционного фактора FOXP3 в Т-регуляторных клетках синовиальной жидкости, по сравнению с аналогичными клетками периферической крови [Olivito В. et al., 2009].
Фактор некроза опухолей-а является цитокином с плейотропным действием, обладающим многочисленными провоспалительными и костимулирующими эффектами на различные клетки [Потекаев Н.Н., Серов А.Н., 2012а, Bonifati С, Ameglio F.,1999]. Участие фактора некроза опухолей-а в регуляции взаимодействия Т-эффекторных и Т-регуляторных клеток в процессе воспаления было изучено в экспериментальных работах Chen X. с соавт. (2007) [Chen X. et al., 2007]. На клеточных культурах, состоящих из CD4+CD25- Т-лимфоцитов и Т-регуляторных клеток, они продемонстрировали, что кратковременная (менее 48 часов) экспозиция фактора некроза опухолей-а приводит к подавлению супрессорного действия Т-регуляторных клеток на пролиферацию Т-эффекторов. Более длительное присутствие фактора некроза опухолей-а сопровождалась восстановлением супрессорной активности Т-регуляторных клеток, подавлению секреции цитокинов и пролиферации CD4+CD25- Т-лимфоцитов. Авторы предположили, что физиологическое значение данного феномена заключается в задержке иммуносупрессивного действия Т-регуляторных клеток с целью реализации процесса воспаления посредством Т-эффекторов с последующим торможением иммунного ответа [Chen X. et al., 2007]. Фактор некроза опухолей-а оказывает непосредственное действие на Т-клетки через экспрессируемый на их поверхности рецептор TNFRII. Применение антиNFRII моноклональных антител приводит к уменьшению численности Т-регуляторных клеток в области псориатических высыпаний [Chen X., Oppenheim J.J., 2011]. С этой позиции можно попытаться объяснить парадоксальный факт, когда на фоне терапии ревматоидного артрита моноклональными антителами к фактору некроза опухолей-а у пациентов манифестировал псориаз или у больных псориатическим артритом развивались псориатические высыпания на коже [Collamer A.N. et al., 2008, Ma H.L. et al., 2010]. Возможно, в этих случаях нейтрализация стимулирующего действия фактора некроза опухолей-а сопровождалось подавлением Т-регуляторных клеток, что приводило к инициации псориатического воспаления в коже.
В ряде исследований было установлено, что при аутоиммунных заболеваниях наблюдается снижение числа Т-регуляторных клеток в периферической крови, а злокачественные новообразования формируются на фоне их увеличения. Повышение количества Т-регуляторных лимфоцитов в опухоли коррелирует с ее неблагоприятным развитием исследований [Buckner J.H., 2010, Rook G.A., Dalgleish А.,2011].
Таким образом, результаты проведенных исследований имеют противоречивые сведения о численности Т-регуляторных лимфоцитов при псориазе. Единство всех авторов сводится к мнению, что эти клетки играют значимую роль в развитии псориаза.
Ген DR4Glu228Ala (А228С)
Генотипирование полиморфизма Glu228Ala (А228С) гена DR4 было выполнено 282 больным псориазом и 484 здоровым донорам. Анализ распределения аллелей и генотипов данного полиморфизма выявил повышение встречаемости «редкого» аллеля С (Ala) среди больных псориазом - 104/564 (18%), в сравнении со здоровыми лицами 124/968 (13%) (OR=l,54, 95% СІ: 1,16-2,04, р=0,003) (Таблица 3.1).
Частота носителей «редкого» аллеля С (Ala) у больных псориазом (лица с генотипами АС и СС) была выше - 95/282 (34%), чем в группе контроля - 116/484 (24%) (относительно лиц с генотипом АА - OR=l,61, 95% СІ: 1,15-2,26, р=0,006).
Распределение частот генотипов полиморфизма Glu228Ala (А228С) гена DR4 в выборках «случаев» и «контролей» соответствовало равновесию Харди-Вайнберга, о чем свидетельствует уровень значимости р 0,05 (тест %-квадрат, степень свободы=1) для каждой группы (Таблицы 3.2, 3.3).
Данные распределения вариантов полиморфизма Glu228Ala (А228С) гена DR4 были проанализированы в мультипликативной модели наследования (Таблица 3.4).
Оценочный тест для анализа изменения степени ассоциации между генотипом DR4 Glu228Ala (А/С) и предрасположенностью к развитию псориаза в зависимости от числа полиморфных аллелей (тренд-тест Кохрана-Армитажа) проводили, используя аддитивную модель наследования (Таблица 3.5). Данный тест показал статистически значимые различия между сравниваемыми генотипами (р=0,003), что свидетельствует о наличии тенденции к повышению степени ассоциации генотипа с риском развития псориаза при увеличении в генотипе количества аллелей С (Ala).
Для оценки прогностической значимости генотипирования мы произвели оценку таких статистик связи, как относительный риск, чувствительность, специфичность, прогностичность положительного результата, прогностичность отрицательного результата, а также границ 95% доверительных интервалов для них.
Статистические показатели прогностической ценности метода генотипирования «редкого» аллеля С (Ala) полиморфизма DR4 Glu228Ala (А/С) с целью оценки риска развития псориаза представлены в таблице 3.6.
Отношение правдоподобия для положительного результата - 1,3, что показывает - вероятность развития псориаза у обследуемых при выявлении аллеля С (Ala) гена DR4 Glu228Ala (А/С) повышается в 1,3 раза. Отношение правдоподобия отрицательного результата - 0,8. Полученное значение показывает, что вероятность развития псориаза повышается на коэффициент 0,8 (снижается в 1,3 раза) у обследуемого, не имеющих варианта С (Ala) полиморфизма А228С гена DR4. Отношение шансов диагностического теста - 1,6, т.е. риск развития псориаза у лиц с положительным результатом теста (наличие аллеля С (Ala)) по сравнению с лицами с отрицательным результатом теста выше в 1,6 раза.
На следующем этапе с целью выявления возможного модифицирующего влияния полиморфизма Glu228Ala (А228С) гена DR4 на течение псориаза мы проанализировали распределение полиморфных вариантов в подгруппах больных псориазом, имеющих псориатический артрит и пациентов без псориатического артрита, с различной степенью тяжести заболевания, сезонностью обострений, течением и возрастом начала псориаза (Таблица 3.7).
При сравнении встречаемости аллелей и генотипов полиморфизма Glu228Ala (А/С) гена DR4 в сравниваемых подгруппах (использовалась мультипликативная модель наследования) статистически значимых различий не выявлено.
Относительное и абсолютное содержание Т-регуляторных клеток в периферической крови
Относительное и абсолютное содержание С04+-лимфоцитов и Т-регуляторных клеток определили в периферической крови 51 пациента в прогрессирующий период псориаза, 32 больных в ремиссию и 60 здоровых доноров (Таблица 5.1). Средний возраст больных в группе с псориазом в прогрессирующем периоде составил 46,07±13,66 лет, в ремиссии - 45,24±15,12 лет, здоровых доноров - 44,73± 11,71 лет. Тендерная характеристика групп сравнения: больные в прогрессирующий период - 39 (76%) мужчин и 12 (24%) женщин, в ремиссию - 19 (73%) мужчин и 7 (27%) женщин, здоровые лица - 42 (70%) мужчин и 18 (30%) женщин. Показатели относительного и абсолютного количества С04+-лимфоцитов и Т-регуляторных клеток в каждой группе имели нормальное распределение.
Относительное содержание СБ4+-лимфоцитов в периферической крови больных псориазом в прогрессирующий период - 45,804± 10,628% было ниже, чем у здоровых доноров - 42,061±4,423% (р=0,029). Различия между относительным количеством С04+-лимфоцитов в крови больных псориазом в ремиссию -45,962±10,783% и здоровых людей - 42,061±4,423%, а также пациентов в прогрессирующий период - 45,804±10,628% и ремиссию - 45,962±10,783% не достигли статистической значимости (р=0,093 и р=0,952, соответственно).
Абсолютное количество СБ4+-лимфоцитов в периферической крови больных псориазом в прогрессирующий период - (1,000±0,420)х109/л, ремиссию - (1,089±0,476)хЮ% и здоровых лиц - (1,043±0,471)х109/л не имело статистически значимых различий (р 0,05 при каждом сравнении).
Установлено, что абсолютное количество Т-регуляторных клеток в крови пациентов с псориазом в прогрессирующий период - (0,081±0,041)х109/л было выше, по сравнению со здоровыми лицами - (0,061±0,030)х109/л (р=0,006). Количество Т-регуляторных лимфоцитов у больных в ремиссию в периферической крови - (0,089±0,050)х10 /л, было выше, чем у здоровых доноров (0,061±0,030)х109/л (р=0,011). Различия в абсолютном числе Т-регуляторных клеток в периферической крови у больных псориазом в прогрессирующий период - (0,081 ±0,041)х109/л и ремиссию - (0,089±0,050)х109/л были статистически не значимы (р=0,448).
Относительное содержание Т-регуляторных клеток в периферической крови больных псориазом в прогрессирующий период - 8,237±2,395% и ремиссию -8,192±2,326% было выше, чем у здоровых доноров - 5,897±1,657% (р 0,001 при каждом сравнении). Различия в относительном количестве Т-регуляторных лимфоцитов у пациентов в прогрессирующий период - 8,237±2,395% и ремиссию - 8,192±2,326% не имели статистически значимых различий (р=0,937).
На следующем этапе мы провели сравнение показателей относительного и абсолютного количества Т-регуляторных лимфоцитов в периферической крови у больных псориазом в прогрессирующий период в подгруппах, отличающихся различной степенью тяжести, сезонностью обострений, началом болезни, наличием или отсутствием псориатического артрита (Таблица 5.2).
При проведении анализа в указанных подгруппах у пациентов с непрерывно рецидивирующим течением выявлено увеличение в периферической крови относительного и абсолютного количества С04+-лимфоцитов — 49,714±9,414% и (1,188±0,494)хЮ /л, соответственно, по сравнению с больными, имеющими интермиттирующее течение - 43,067±Ю,716% и (0,868±0,304)х109/л, соответственно (р=0,023 и р=Ю,013, соответственно). В то же время, в этих подгруппах отмечено уменьшение относительного содержания Т-регуляторных клеток у пациентов с непрерывно рецидивирующим течением - 7,367±2,530%, по сравнению с больными с интермиттирующим течением - 8,847±2,132% (р=0,035). При этом разница в абсолютном количестве Т-регуляторных клеток у пациентов с непрерывным и интермиттирующим течением - (0,087±0,053)х109/л и (0,076±0,031)хЮ/л, соответственно, не достигла статистической значимости (р=409).
Наиболее высокие относительные и абсолютные показатели CD4+-лимфоцитов (53,100±9,814% и (1,349±0,568)хЮ9/л, соответственно) и абсолютное количество Т-регуляторных клеток ((0,114±0,066)хЮ9/л) наблюдались у пациентов с непрерывно рецидивирующим псориазом, имеющих псориатический артрит. У этой группы больных абсолютное количество Т-регуляторных лимфоцитов было почти в 2 раза выше, чем у здоровых лиц - (0,114±0,066)х109/л и (0,061±0,030)х109/л, соответственно (р=0,005).
В других подгруппах больных статистически значимых различий относительного и абсолютного содержания субпопуляций СВ4+-лимфоцитов и Т-регуляторных клеток обнаружено не было.
Корреляционный анализ между относительным и абсолютным содержанием субпопуляций СБ4+-лимфоцитов, Т-регуляторных клеток в прогрессирующий период псориаза выявил слабую обратную связь между толщиной эпидермиса и относительным содержанием Т-регуляторных клеток в периферической крови (г= -0,297, р=0,045), слабую прямую связь между относительным количеством CD4+-лимфоцитов и индексом PASI (г=227; р=0,047); в период ремиссии обнаружена умеренная прямая связь между абсолютным количеством Т-регуляторных лимфоцитов и общим количеством Кі67+-клеток (г=0,600; р=0,002).
Мы сравнили численность СБ4+-лимфоцитов и Т-регуляторных клеток в периферической крови больных псориазом, имеющих разные генотипы полиморфных генов, исследованных в данной работе (Таблица 5.3).
Относительное и абсолютное количество Т-регуляторных лимфоцитов в периферической крови было выше у больных псориазом, обладающих гомозиготным по «частому» аллелю генотипом АА (Arg/Arg) гена DR4 Lys441 Arg - 8,914±2,056% и (0,090±0,048)х109/л, соответственно, по сравнению с гетерозиготами AG (Arg/Lys), 6,900±2,210% и (0,062±0,022)хЮ9/л, соответственно (р=0,011 и р=0,016, соответственно).
При других комбинациях аллелей полиморфных генов различия в численности С04+-лимфоцитов и Т-регуляторных клеток были статистически не значимы.
СБ8+-клетки
Количество CD8+-baieTOK в коже больных псориазом в прогрессирующий период - 109/0,38 мм2, было в 3,9 раза больше, чем у пациентов в период ремиссии псориаза - 28/0,38 мм2 (р 0,01), и в 7,3 раза больше, чем у здоровых людей - 15/0,38 мм2 (р 0,01) (Таблица 6.8). Доля цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+) от числа всех Т-клеток (CD3+) составила у больных псориазом в прогрессирующий период 40%, в ремиссию - 30%, у здоровых лиц - 44%.
В прогрессирующий период псориаза СБ8+-клетки в коже распределялись следующим образом: в эпидермисе локализовалось 22,5% цитотоксических лимфоцитов, располагаясь, главным образом, в базальном и шиповатом слоях вблизи дермальных сосочков (Рисунок 6.19), в сосочковой дерме - 74,5%, причем вблизи эпидермо-дермальной границы (преимущественно на вершинах вытянутых сосочков) — 20,4% и в составе дермальных инфильтратов - 54,1% (Рисунок 6.20). В период ремиссии доля С08+-клеток в эпидермисе была в 2,6 раза меньше - 8,6%, увеличилось относительное количество клеток в сетчатом слое дермы - 14,4%) (Рисунок 6.21). Доля СБ8+-клеток в ремиссию в сосочковом слое дермы - 77% практически не отличалась от прогрессирующего периода псориаза, несколько уменьшилось присутствие клеток вблизи эпидермо-дермальной границы - 13,4%. У здоровых людей в эпидермисе встречалось всего 5,3% клеток (Рисунок 6.22), в сосочковом слое дермы - 59,2%, причем в эпидермо-дермальной зоне всего 8,1%, доля цитотоксических лимфоцитов в сетчатом слое дермы была наибольшей среди сравниваемых групп - 35,5% (С08+-клетки встречались вокруг придатков кожи).
При проведении корреляционного анализа выявлена сильная прямая связь между численностью в коже CD8+-ioieTOK и СБ4+-клеток (г=0,818, р 0,01), CDllc+-KneTOK (г=0,722, р 0,01), общим количеством Кі67+-клеток (г=0,762, р 0,01). Корреляционный анализ показал умеренную прямую связь между количеством СБ8+-клеток и толщиной эпидермиса (г=0,504, р 0,01), количеством СБ1а+-клеток (г=0,386, р 0,01), индексом PASI (г=0,320, р 0,01), экспрессией в коже мРНК TNFa (г=0,304, р 0,01).
![Роль гипоксических изменений и эндогенной интоксикации в патогенезе псориаза и их коррекция реамберином [Электронный ресурс]](/i/i/4347/212741.png "Роль гипоксических изменений и эндогенной интоксикации в патогенезе псориаза и их коррекция реамберином [Электронный ресурс] Костянова Елена Николаевна")
