Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Эпидемиология урогенитального хламидиоза 9
Этиология и биологические свойства хламидий 10
Геномика хламидий 15
Особенности клинических проявлений заболеваний, вызванных C.trachomatis 18
Лабораторная диагностика хламидийной инфекции 21
Этиотропная терапия урогенитального хламидиоза 27
Механизмы устойчивости бактерий к антибактериальным препаратам 31
Механизмы обеспечивающие устойчивость бактерий к
макролидам 32
1.9 Механизмы резистентности к фторхинолонам 33
1.1 ОАнтибактериальная устойчивость микроорганизмов обусловлен
ная изменениями в клеточной стенке 36
1.11 Антибиотикорезистентность хламидий 37
ГЛАВА 2 МАТАРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 40
Клиническая характеристика больных 40
Методы обследования больных и методика забора клинического материала 41
Специальные методы исследования 44
2.4 Статистические методы обработки 48
ГЛАВА З КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ УРОГЕНИТАЛЬНОИ ХЛАМИДИЙНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ 50 3.1 Анализ клинико - анамнестических данных пациентов
с урогенитальной хламидийной инфекцией 50
3.2 Анализ результатов микробиологического обследования пациентов с
урогенитальной хламидийной инфекцией 67
3.3. Результаты лечения пациентов 74
3.3.1 Результаты клинико-микробилогического обследования пациентов
после
лечения 74
3.3.2 Анализ отдаленных результатов лечения 87
ГЛАВА 4 РЕЗУЛЬТАТЫ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ
МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 89
4.1 Результаты определения чувствительности к препаратам
фторхинолонового ряда и определение нуклеотидной последовательности
Quinolon-Resistance-Determining-Region gyrA и рагС клинических изолятов
С. trachomatis 91
4.2 Определение чувствительности клинических изолятов C.trachomatis
к препаратам тетрациклинового ряда 96
4.3 Результаты тестирования чувствительности к макролидам и
определение нуклеотидной последовательности пептидилтрансферазной
петли гена 23SpPHK клинических изолятов C.trachomatis, устойчивых к
макролидам 97
ГЛАВА 5 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 103
ВЫВОДЫ 119
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 120
УКАЗАТЕЛЬ ЛИТЕРАТУРЫ 122
ПРИЛОЖЕНИЕ 149
Список сокращений
A3 - азитромицин
АМП - антимикробный препарат
АТФ - аденозинтрифосфат
БТШ60 - белок теплового шока с молекулярной массой 60 кДа
ВЗОМТ - воспалительные заболевания органов малого таза
ДНК-дезоксирибонуклеиновая кислота
ДОКС - доксициклин
3111111 - заболевания, передающиеся половым путем
ИФА - иммуноферментный анализ
ЛФЛ - ломефлоксацин
ЛПС - липополисахарид
ЛЦР - лигазная цепная реакция
МБК - минимальная бактерицидная концентрация
МИК - минимальная ингибирующая концентрация
МЛ - макролиды
МЛК - устойчивый к макролидам
МФЦПВ- мелкие формы цитоплазматических включений
ОФЛ - офлоксацин
ПТ - промежуточное тельце
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ПИФ - прямая иммунофлюоресценция
РНК - рибонуклеиновая кислота
РТ - ретикулярное тельце
УГХ - урогенитальный хламидиоз
ФХ - фторхинолоны
ФХК- устойчивый к фторхинолонам
ЦФЛ -ципрофлоксацин
Эр - эритромицин
ЭТ - элементарное тельце
EDTA-этилендиаминтетраацетат
erm - erythromycin ribosome mettylaition
MOMP - Maijor Outer Membrane Protein
ORF - Open reading frame
QRDR - Quinolon Reistance- Determining Region
Введение к работе
C.trachomatis относится к патогенным для человека микроорганизмам, а уро-генитальная хламидийная инфекция - к наиболее распространенным инфекциям, передаваемым половым путем [57, 127]. На его долю приходиться примерно 50-70% всей патологии урогенитального тракта. [75, 79, 210]. Ежегодно в мире официально регистрируется около 80 млн. случаев заболеваний, вызванных C.trachomatis [64]. В США заболевания, вызванные C.trachomatis, признаны самыми распространёнными заболеваниями, передаваемыми половым путём [229]. Отмечено, что хламидии обнаруживаются у 5% здоровых людей и более чем у 20% пациентов кожно-венерологических клиник [211]. Вследствие своего широкого распространения и существенного влияния на здоровье населения урогенитальная хламидийная инфекция представляет одну из самых серьезных проблем здравоохранения [1,3,17,15,45,64,65,68,70]. Широкому распространению урогенитального хламидиоза, как отмечают многие авторы, способствуют прежде всего два фактора. Одним из них является высокая заражаемость при половых контактах, другим — бессимптомное течение инфекции [63,65]. Клинический спектр заболеваний вызываемых C.trachomatis достаточно разнообразен. У женщин это чаще всего уретрит, эндоцервицит, а также воспалительные заболевания органов малого таза, перитонит, перигепатит [43,209]. У мужчин это уретрит и сопутствующие ему осложнения (эпидидимит, орхоэпидидимит, везикулит, простатит и др.). Одним из самых грозных осложнений длительно не диагностируемой и неле-ченной урогенитальной хламидийной инфекции являются нарушения репродуктивной функции [54, 72,107].
Особый интерес для клиницистов представляет лечение хламидийной инфекции, которое несмотря на постоянно появляющиеся новые рекомендации остается актуальной проблемой. Поскольку хламидии являются бактериями, их лечение проводится антибиотиками. Препаратами выбора для лечения урогенитально хламидийной инфекции являются тетрациклины, мак-
ролиды и некоторые фторхинолоны. Однако до настоящего времени нет единого подхода к терапии урогенитального хламидиоза, остается неоднозначной оценка клинической эффективности "новых" антибактериальных препаратов. Остается открытым вопрос об истинной способности существующих препаратов и режимов лечения действительно уничтожать хламидии [20]. Широкое использование антибиотиков приводит к появлению резистентных к ним штаммов микроорганизмов, что в свою очередь ограничивает эффективность антимикробной терапии. В литературе достаточно давно стали появляться данные об отсутствии эффекта от адекватной антибактериальной терапии [62, 74,150], все чаще появляются сообщения об обнаружении штаммов С. trachomatis устойчивых к антибактериальным препаратам рекомендуемым для лечения УХИ [206]. Возможность формирования устойчивости С. trachomatis к фторхинолонам была показана in vitro [115]. Данные, полученные при изучении механизмов устойчивости, свидетельствуют о том, что первичной мишенью действия фторхинолонов у C.trachomatis является ДНК-гираза. Селекция мутаций происходит в локусе типичном для грамот-рицательных бактерий. Первое достоверное сообщение об обнаружении штаммов C.trachomatis устойчивых к макролидным антибиотикам появилось сравнительно недавно [206]. Достаточно недавно, появились первые работы об обнаружении мутаций в гене 23SpPHK у устойчивых к макролидам клинических изолятов C.trachomatis, однако связи между антибиотикорези-стентностью и неудачами лечения установлено не было [49,80].
Что касается тетрациклинов, то необходимо отметить сообщения об обнаружении штаммов C.trachomatis устойчивых к доксициклину, а также сообщения о выделении полирезистентных штаммов, устойчивых наряду с другими антибиотиками и к доксициклину [162,206].
Возможно, что случаи устойчивости C.trachomatis к антибактериальным препаратам встречаются чаще, чем принято считать, однако не всегда проводит-
ся контроль излеченности, и поэтому такие случаи просто не регистрируются.
Таким образом, изучение проблем терапии урогенитальной хламидийной инфекции остается актуальной задачей медицинской науки и практики. Применение новых препаратов должно сопровождаться теоретическими и эпидемиологическими исследованиями: определением ингибирующих и бактерицидных концентраций, выявлением частоты встречаемости резистентных клинических изолятов и изучением молекулярных механизмов формирования резистентности клинических изолятов С. trachomatis.
Целью данной работы являлось: Изучение причин неудач лечения УГХ на основе сравнительного анализа эффективности терапии урогениального хламидиоза различными атибактериальными препаратами (группы макролидов, тетерациклинов, фторхинолонов), выявление резистентных форм хламидий и исследование молекулярных механизмов устойчивости C.trachomatis к антибактериальным препаратам.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1.Провести сравнительную оценку клинико-микробиологической эффективности наиболее распространенных схем лечения урогенитального хламидиоза.
Провести сравнительный анализ различных методов диагностики урогенитальной хламидийной инфекции (идентификация C.trachomatis методом ПЦР и методом выделения на культуре клеток McCoy).
Изучить основные причины неудач лечения урогенитального хламидиоза нижних отделов мочеполового тракта и выявить клинические изоляты C.trachomatis, устойчивые к фторхинолонам, макролидам и тетрациклинам.
В устойчивых к фторхинолонам клинических изолятах C.trachomatis исследовать молекулярные изменения в генах гиразы и топоизомеразы IV.
5. В устойчивых к макролидам клинических изолятах C.trachomatis исследовать молекулярные изменения в гене 23SpPHK).
Научная новизна: Впервые в клинической практике был исследованы причины неуспешного лечения УГХ, а также исследован уровень антибиотико-резистентности клинических изолятов C.trachomatis, выделенных от больных после неуспешного лечения к основным АБП, используемым в терапии УГХ, с определением МИК и изучением молекулярных механизмов данного явления.
Впервые установлено, что двойные мутации Val60->Ala и Hisl29->Gln, в генах мишеней фторхинолонов у клинических изолятов C.trachomatis генотипа Е, выделенных от больных после неуспешного лечения и устойчивых к высоким концентрациям фторхинолонов in vitro нахоящиеся за границами QRDR могут являться проявлениями полиморфизма гена gyrA, что позволяет сделать вывод о наличии у хламидий альтернативных механизмов устойчивости к данным антибиотикам.
Практическая значимость: На основе полученных данных разработан и внедрен в практику алгоритм обследования и ведения пациентов с урогени-тальной хламидийной инфекцией.
Внедрение результатов исследования в практику здравоохранения: Основные положения работы нашли применение в практической работе в НКДО ГУ ЦНИКВИ Минздрава РФ, женском венерологическом отделении больницы № 14 имени В.Г. Короленко, в КБ № 6 ФУ "Медбиоэкстрем" МЗ РФ, что позволило повысить эффективность диагностики и этиотропной терапии урогенитального хламидиоза.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Эпидемиология урогенитального хламидиоза
Инфекции, вызванные С. trachomatis, относятся в настоящее время к наиболее распространенным заболеваниям, передаваемым половым путём [57,127] и самым "дорогостоящим" из 3111111. Несмотря на то, что разработаны достаточно чувствительные и высокоспецифичные методы диагностики, предлагаются все новые антибактериальные препараты, схемы и методы лечения заболеваемость продолжает повсеместно увеличиваться. В экономически развитых странах хламидиоз является наиболее распространённой инфекцией, передаваемой половым путём и в 2-3 раза превышает гонорею [189,203]. Например, в США ежегодно регистрируется более 4 млн. новых случаев этого заболевания [82,129,144]. Последствия не выявленной и не леченной инфекции наносят обществу демографический и экономический ущерб, оцениваемый астрономическими суммами, так экономические потери от хламидиоза в США оценены в 1 млрд. долл. ежегодно [55,71]. Результаты многолетних исследований, проводимых и публикуемых Центром по контролю за болезнями (CDC) США с 1988 года позволяют наиболее полно оценить значение хламидийных инфекций [117,118]. В 1999 году в США частота выявления хламидийных инфекций составила 254,1 случаев на 100000 населения. При этом на 100000 женщин было выявлено 404,5 случаев, а на 100000 мужчин-94,7 случаев. Чаще всего хламидийные инфекции выявляют среди молодых женщин в возрастных группах от 15 до 19 и от 20 до 24 лет (соответственно 2483,8 и 2187,1 на 100000 женщин соответствующего возраста). Среди здоровых женщин в возрасте от 15 до 24 лет, посещающих клиники по планированию семьи, частота обнаружения хламидий в среднем составляет 5,5% (в различных регионах от 26 до 15,0%). Анализ многолетней динамики выявления хламидий среди различных групп населения свидетельствует, что увеличение частоты регистрации хламидий-ной инфекции происходит на фоне снижения ее встречаемости. Эксперты
CDC считают, что увеличение выявления случаев хламидийной инфекцией является результатом совершенствования диагностики, а снижение общего количества случаев происходит за счет эффективных программ по выявлению и лечению. Необходимо отметить, что в России заболеваемость урогени-тальной хламидийной инфекцией за последнее время значительно возросла [69,81], официально зарегистрированная заболеваемость урогенитальной хламидийной инфекцией составила на 2000г. 126,2 на 100 тыс. населения и заняла 3-е место после сифилиса и трихомониаза [66]. На различную распространённость хламидийной инфекции по территориям указывают многие специалисты [44,118,74], занимающиеся этой проблемой, считая, что полученные данные все же не отражают реального положения вещей и на самом деле она значительно выше.
1.2 Этиология и биологические свойства хламидий. В настоящее время насчитывается более 20 нозологических форм, связанных с хламидийной инфекцией, обусловленной С.trachomatis. Впервые внутриклеточные включения хламидий наблюдали в поражённых клетках при трахоме глаз Halberstadter и Prowazek в 1907 году, а морфологию и цикл внутриклеточного размножения описали S. Bedson и J. Bland в 1932 году; ВІ953 году А. А. Авакяну удалось обнаружить хламидийные тельца не только внутри клеток, но и в межклеточных пространствах, несколько позже было установлено, что развитие тельца-включения занимает 48ч. [39]. Токсономия и номенклатура хламидий длительное время были неточными и во многом противоречивой, и была основана на анализе отдельных феноти-пических, культуральных и морфологических признаков. Открытие новых микроорганизмов, с характерными для хламидий циклом развития, параллельно с исследованиями генома ранее известных представителей рода Chlamydia, привело к необходимости пересмотра классификации и номенклатуры порядка Chlamydiales. Новая классификация основана на описании критериев геносистематики бактериальных таксономических групп различного уровня:
наличие 95% гомологии в нуклеотидной последовательности генов 16S и 23 SpPHK для всех представителей рода, 90%-семейства, 80%-порядка и/или класса микроорганизмов.
Согласно новому определению, предложенному К. D. Everett, порядок Chla-mydiales включает облигатных внутриклеточных бактерий, которые имеют сходный с хламидийным цикл развития, характеризуются наличием грампо-ложительных или грамотрицательных инфекционных элементарных телец (ЭТ), и обладают > 80% уровнем гомологии по последовательности генов 16S и 23SpPHK [125]. Согласно новой классификации C.trachomatis является исключительно паразитом человека, вызывает трахому, урогенитальные заболевания, некоторые формы артрита, конъюнктивит и пневмонию новорожденных.
Вид C.trachomatis подразделяется на два биовара: trachoma (серовары А-К) и LGV (L1-L3) [88,89]. Серовары А-С выделяются в зонах эндемичных по трахоме (конъюнктивит хламидйной этиологии), серовары L1-L3 соответствуют штаммам выделенным у больных, имеющих клинические признаки венерической лимфогранулёмы. Антигены биовара LGV дают перекрёстные реакции с антителами других серотипов, поэтому их используют для выявления антител к хламидиям разных серологических вариантов и даже видов (например, при диагностике орнитоза).
Серовары D-K выделяют при различных клинических формах урогениталь-ной патологии человека, в том числе осложнённых пневмонией и конъюнктивитом [160].
По своей структуре и химическому составу хламидии напоминают классические бактерии, но не обладают многими метаболическими механизмами, необходимыми для самостоятельного размножения [2,8,11,12, 13, 24, 30, 32, 37, 77, 92, 94]. Облигатный паразитизм определяет использование продуктов метаболизма клетки-хозяина [109, 168, 227].
Наличие клеточной стенки, по химическому составу сходной с бактериальной, двух типов нуклеиновых кислот-РНК и ДНК, чувствительтность к ряду антибиотиков, приближают хламидии к грамотрицательным бактериям (11, 12, 13]. С.trachomatis не растут на искусственных питательных средах. Микроорганизмы рода Chlamydia размножаются только внутри клеток организма хозяина, обладая выраженным тропизмом к цилиндрическому эпителию слизистых урогенитального тракта [35, 38].
Клеточная стенка хламидии имеет характерное для грамотрицательных бактерий двухслойное строение и отделена от плазматической мембраны электронно-прозрачным периплазматическим пространством [109]. Пептидогли-кановый слой отсутствует, что отчасти обуславливает умеренную окраши-ваемость хламидии по способу Грама [95]. Ригидность клеточной стенки обусловлена множественными дисульфидными поперечными связями между основным белком наружной мембраны (Major Outer Membrane Protein (МОМР) и двумя богатыми цистеином белками: белком оболочки с молекулярной массой 60 кД и липополипротеином наружной мембраны с молекулярной массой 12 кД [123,124,142]. Эти белки важны для обеспечения стабильности и непроницаемости ЭТ [151]. На основной белок наружной мембраны (МОМР) приходится 60% общего количества белка [155]. МОМР различных видов хламидии содержит видо-, био- и серо-типоспецифические эпитопы, представленные на поверхности ЭТ. Кроме того, в нем имеются также области с высоким сходством среди видов (родоспецифические эпитопы), что объясняет возможность появления перекрёстных реакций [130]. Считается, что МОМР вовлечен в процесс инфицирования клетки-хозяина [217,218]. Наиболее вариабельными областями МОМР являются так называемые области vd2 и vd4. Предполагается, что их изменчивость связана с ускользанием хламидии от иммунного ответа организма [174]. Также в иммунном ответе хозяина важную роль играет БТШ60 (белок теплового шока) [192], он принадлежит к семейству Gro EL стрессо-
вых белков. Аминокислотная последовательность хламидийного БТШ60 очень консервативна и на 48% гомологична последовательности БТШ60 человека. За счет антигенной перегрузки организма и стимуляции запуска перекрёстного аутоиммунного ответа поддерживается постоянная воспалительная реакция. Кроме МОМР, предполагаемыми адгезинами хламидий являются Отр2, 28кДА, GrpE-подобный белок, гликопротеины 18 и 32 кДА, МІР (macrophag infectivity ро1еппаюг)-подобный белок [199,200,223,216].
Как и у других грамотрицательных бактерий, в клеточной стенке хламидий содержаться липополисахариды, представляющие собой один из основных родоспецифических антигенов микроорганизма [13] (липополисахарид-ный комплекс, реактивной половиной котрого является 2-кето-Здезоксиоктановая кислота), используемый при диагностике заболевания иммунофлюоресцентными методами с применением специфических антител [102,128]. Эпитоп, определяющий родоспецифичность, расположен в углеводном участке липополисахаридов и представлен олигосахаридом из 3 мономеров [133]. Доказано, что синтетический олигосахарид аналогичного состава связывается с моноклональными антителами к родоспецифическому антигену хламидий [91].
От других микроорганизмов хламидий отличаются уникальным жизненным циклом, который включает в себя последовательную смену двух функционально и морфологически различных форм, адаптированных для внутри- и внеклеточного существования [11,12,13,92,93,123]. Внеклеточные формы-инфекционные метаболически неактивные элементарные тельца (ЭТ) взаимодействуют с рецепторами гепарин-сульфата на поверхности эпителиальных клеток и путём эндоцитоза проникают в клетку [184,215,234]. Затем, проходя стадию промежуточных телец (ПТ) в течение 2-8 часов реорганизуются в ретикулярные тельца (РТ): ослабляются дисульфидные связи между МОМР и другими внешними белками мембраны, что приводит к повышению проницаемости мембраны хламидийной клетки, увеличению транспорта пи-
тательных веществ и возрастанию метаболической активности [95,224]. Помимо изменений клеточной стенки поверхности, происходит деконденсация хромосом хламидий, для активации процессов транскрипции и трансляции. Через 2 часа после интернализации начинается экспрессия некоторых генов (recA, rpoB, rpoD, groEL и др.). В мембрану фагосомы встраиваются секрети-рованные хламидией белки IncA, IncD, IncE, IncF и IncG, которые, как предполагаются, препятствуют слиянию фагосом с лизосомами [202,135]. Ретикулярные тельца делятся бинарно внутри образующейся фагосомы, которая представляет собой микроколонию и выявляется при микроскопии как хламидийное включение [109,141]. После периода роста и деления РТ подвергаются обратной трансформации через стадию ПТ в ЭТ. Цикл развития считается завершённым после выхода из клетки инфекционных ЭТ в результате лизиса клетки-хозяина или экзоцитоза, далее ЭТ инвазируют новые, еще неинфицированные клетки [179]. Полный цикл развития хламидий длится в течение 40-72 часов, в зависимости от природы клеток-хозяев, условий среды и штамма хламидий [94]. Иногда клетки-хозяева сохраняют жизнеспособность, что считается одной из причин бессимптомного развития заболевания. Хотя жизненный цикл развития хламидий хорошо охарактеризован микроскопически, механизмы контроля и регуляции внутриклеточного развития остаются неизвестными. Идентификация временной последовательности синтеза белков выявляет наличие строгой регуляции процессов дифференци-ровки жизненных форм хламидий. ЭТ, попадающие в клетку путём эндоци-тоза, метаболически инертны, однако синтез белков определяется уже через 15 минут после их поглощения клеткой [92].
Вопрос о персистирующей или латентной инфекции в последнее время всё чаще обсуждается в литературе [27]. Хотя теоретически эти понятия различаются, в клинической практике они могут иметь одинаковые проявления и описываться как бессимптомная или субклиническая инфекция [92]. Вопрос о наличии латентных форм хламидий мало изучен и нуждается в даль-
нейшей разработке. Значительно больше известно о персистенции хламидий, что подразумевает длительное сохранение хламидий без выраженного роста и размножения. Ранее такое состояние считалось одним из основных факторов в патогенезе хламидиозов [12,13,27].
Считается, что персистенция хламидий - это ответ на стресс. Во многих работах было показано, что провоцировать переход в персиситирующее состояние может любое негативное воздействие, в том числе и антибактериальная терапия [105].
С помощью методов ультраструктурного анализа доказана возможность персистенции хламидий в эпителиальных клетках и фибробластах инфицированных слизистых мембран. Хламидий поглощаются периферическими моноцитами и распространяются в организме, моноциты оседая в тканях, превращаются в тканевые макрофаги (в суставах, в сосудах, в области сердца). Тканевые макрофаги могут сохранять жизнеспособность в течение нескольких месяцев, Являясь мощным антигенным стимулятором, приводя к образованию фиброзных гранулём в здоровой ткани. Независимо определяется ли хламидийный антиген в месте проникновения инфекции, хламидий или их фрагменты могут высвобождаться из клеток и вызывать образование специфических антител. У персистирующих хламидий изменена морфология и экспрессия ключевых антигенов, отмечается уменьшение синтеза всех основных структурных компонентов, придающих прочность клеточной стенке (МОМР, белок клеточной стенки массой 60 кДа и липополисахарид (ЛПС)). На этом фоне идёт непрерывный синтез БТШ60, правоцирующего воспаление.
1.3 Геномика хламидий Впервые о секвенировании генома было сообщено в 1998 году [214]. Геном хламидий имеет небольшой размер и составляет не более 15% генома кишечной палочки. Он состоит из хромосомы, содержащей 1042519 пар оснований (58,7%) и плазмиды, имеющей в своём составе 7493 пар оснований. Анализ
генома позволил выделить 894 гена, кодирующих различные белки. Сходство с ранее исследованными белками других бактерий помогло определить функциональное назначение 604 (68%) кодируемых белков. 35 (4%) белков были схожи с белками, имеющимися у других бактерий, функции которых пока еще не доказаны. В остальных 255 (28%) белках последовательности были непохожи на ранее изученные. Анализ белков показал, что 256 (29%) хламидийных белков группируются в 58 семейств в пределах генома. Сходное группирование белков имеет место у бактерий с небольшим геномом, таких как Mycoplasma sps. и Haemophilus influenzae. Длительное время считалось, что хламидии из-за характерного дефекта ряда ферментных систем не способны самостоятельно окислять глутамин и пируват, а также осуществлять фосфорилирование и эффективное окисление глюкозы. Предполагалось также, что хламидии являются облигатными внутриклеточными энергетическими паразитами, использующими метаболическую энергию эукариотиче-ской клетки с помощью АТФ и других макроэргических соединений. В настоящее время анализ генома показал, что хламидии способны синтезировать АТФ, хотя и в незначительных количествах, путём гликолиза и расщепления гликогена. Гликолитический цикл редуцирован, поскольку отсутствуют некоторые ферменты, что компенсируется через пентозофосфатный и гексозо-фосфатные шунты. Некоторые факты, обнаруженные в ходе исследования, не нашли своего объяснения в связи с тем, что хламидии в процессе приспособления к внутриклеточному паразитизму выработали уникальные структуры и биосинтетические механизмы, не имеющие аналогов у других бактерий. Не объяснён тот факт, что у хламидии не обнаружен высококонсервативный ген ftsZ, необходимый для клеточного деления всех прокариот. Поскольку он ответственен за образование клеточной перегородки во время деления клетки. У хламидии нет такого компонента клеточной стенки, как пептидогликан, который имеется как у грамотрицательных, так и грамположительных бактерий, но при этом в геноме содержаться гены, кодирующие белки необходи-
мые для его полного синтеза [140]. Недостаток данного компонента клеточной стенки компенсируется наличием уникального комплекса богатых цис-теином белков оболочки, связанных между собой дисульфидными связями, придающими структурную стабильность хламидийной клеточной стенке [122]. С помощью метода сканирующей электронной микроскопии на поверхности хламидии были выявлены куполообразные структуры, пронизанные микрофиламентами. Микрофиламенты выходят из центра и достигая мембраны включений прнизывают её. Функцию этой структуры связывают с транспортом питательных веществ от эукариотической клетки к паразиту. После того как в геноме хламидии были обнаружены гены, кодирующие аппарат секреции 3 типа, который обуславливает вирулентность грамотрици-тельных бактерий, было сделано предположение, что это образование осуществляет передачу белковых факторов от паразита к эукариотической клетке [90]. Система секреции 3 типа позволяет грамотрицательным бактериям экспортировать белки из клетки и облегчает проникновение этих белков внутрь клетки-хозяина через контактирующие поверхности. Гены, кодирующие этот секреторный аппарат, очень консервативны, но секретируемые субстраты уникальны для каждого вида бактерий. Функциональное назначение субстрата, секретируемого хламидией в клетку неизвестно. Возможно, эти факторы ингибируют апаптоз [126], или перенаправляют клеточный везикулярный транспорт к хламидийным включениям [135].
В отличие от других бактерий, геном которых уже известен, хламидии содержат необычно большое количество генов - не менее 20. Предполагается, что они были получены предшественниками хламидии, паразитировавшими на растениях, в результате горизонтального переноса [214].
После определения нуклеотидной последовательности хламидийного генома было идентифицировано несколько ORF (Open reading frame), предположительно кодирующих белки, обладающие цитотоксическим действием
[95]. Эти ORF имеют значительный уровень гомологии с LCTs (Large cytotox-ins) Clostridium difficile [104]. LTSs обладают глюкозилтрансферазной активностью и модифицируют внутриклеточные регуляторные молекулы, например, ГТФ-связывающие белки суперсемейства RAS, вследствие чего влияют на формирование цитоскелета и процессы внутриклеточного транспорта. Инвазия клеток хламидиями может запускать программу гибели клеток по механизму апоптоза, в результате чего клетки секретируют проинфламма-торные цитокины, что может быть одной из составляющих восполительного ответа [187].
1.4 Особенности клинических проявлений заболеваний, вызванных C.trachomatis
Длительность инкубационного периода при хламидийной инфекции составляет от 5 до 30 дней (в среднем 10-14 дней). Вне зависимости от локализации возбудитель поражает клетки цилиндрического эпителия ("ампула" уретры, цервикальный канал, прямая кишка и т.д.) с частичным вовлечением в инфекционный процесс плоских эпителиоцитов, а также железистых клеток. Первоначальным очагом инфекции наиболее часто является слизистая уретры у мужчин и канала шейки матки у женщин. Клиническая картина зависит от времени с момента инфицирования, локализации поражения, выраженности местных и общих реакций макроорганизма и варьирует от полного отсутствия клинической симптоматики до выраженных клинических проявлений [29,32,78,182]. Бессимптомное течение часто приводит к тому, что инфекцию выявляют на стадии серьёзных осложнений - сальпингоофорита, эндометрита, эпидидимита, простатита, которые могут закончится бесплодием и импотенцией [5,7]. Клинический спектр инфекций, передаваемых половым путем достаточно разнообразен (таблица 1).
Таблица 1 Заболевания, вызванные C.trachomatis и их осложнения (WHO Collaborating centre, 1990)
Необходимо отметить, что острые и подострые воспалительные процессы мочеполовых органов наблюдаются лишь у 5-10% женщин и 10-15% мужчин [76]. Наиболее частыми проявлениями хламидийной инфекции урогени-тального тракта являются признаки уретрита у мужчин и цервицита у женщин [4, 32,103,170,182].
Хламидийный уретрит у мужчин протекает чаще всего хронически и менее тяжело чем гонококковый. Больных беспокоят слизистые или слизисто-
гнойные выделения из уретры, жжение и зуд в мочеиспускательном канале, учащенные позывы на мочеиспускание. Объективно определяют гиперемию губок уретры, при микроскопии отделяемого из уретры часто выявляют "абактериальный" лейкоцитоз, а при 2-х стаканном исследовании взвесь в пробах мочи [32]. При уретрите с незначительными субъективными жалобами бывают очень скудные выделения в виде "утренней капли". Хламидийный эпидидимит является следствием каналикулярного заноса хламидий из задней уретры, развивается на фоне первичного поражения уретры и относится к наиболее серьезным осложнениям хламидийной инфекции [33,98,100,182]. Может протекать остро, подостро и хронически. Неадекватная терапия уро-генитальной инфекции у мужчин также может осложняться развитием простатита [9,18,31,50]. Однако, этиологическая роль С. trachomatis в возникновении простатита все еще не доказана [178]. Хламидийный парауретрит, везикулит и другие местные осложнения не имеют, как правило, каких-либо особенностей, выражены слабо.
Хламидийная инфекция у женщин чаще всего протекает при полном отсутствии жалоб и с незначительными объективными проявлениями [19]. Основными клиническими проявлениями являются незначительные слизистые или слизисто-гнойные выделения из цервикального канала, наличие фолликулярного цервицита, повышенная кровоточивость шейки матки и лейкоцитоз при микроскопии материала из цервикального канала [19,21,24,87]. Бессимптомное течение инфекции и как следствие поздняя ее диагностика и лечение часто приводят к различным осложнениям и нарушению репродуктивной функции [51,58,231].
Воспалительные заболевания органов малого таза (ВЗОМТ) являются осложнениями в 40-80% случаев наблюдаемых при хламидийной инфекции и в последние годы все чаще привлекают внимание исследователей [112,190,191,205].
В литературе освещены убедительные данные, свидетельствующие о том, что хламидийная инфекция способствует не вынашиванию беременности. C.trachomatis выявляются у каждой второй женщины с хроническим воспалением урогенитальной сферы, у 57% женщин страдающих бесплодием, у 87% женщин с невынашиваемостью беременности [54].
У беременных, больных хламидиозом, нарушается барьерная функция цервикальной слизи и появляется возможность распространения инфекционного процесса на эндометрий и нижний полюс плодного яйца. Описаны случаи внутриутробного инфицирования плода и его антенатальной гибели. Причем характер перинатальных поражений не зависит от длительности течения хламидийной инфекции у матери. Даже впервые выделенная латентная форма может привести к перинатальным потерям и вызвать тяжелые заболевания у плода и новорожденного [72]. По данным ВОЗ, 60-70% детей, родившихся от матерей, страдающих хламидийной инфекцией, оказываются инфицированны [119, 139].
1.5 Лабораторная диагностика хламидиозов Как было уже отмечено выше, четких различий в клинических проявлениях воспалительных реакций в ответ на инфицирование хламидиями в сравнении с другими инфекционными агентами не отмечено и это значительно осложняет клиническую диагностику хламидиоза, поэтому решающее значение в выявлении хламидийных инфекций имеют методы лабораторной диагностики [26,30,64,114,132,210,219,221,222].
В настоящее время существует ряд диагностических методов, используемых для выявления хламидийной инфекции:
- Микроскопические (окраска препаратов по Романовскому-Гимзе, раствором Люголя и др., иммунофлюоресцентный анализ);
Иммунологические с целью выявления антител или антиненов хламидии (реакция связывания комплемента (РСК), иммуноферментный анализ (ИФА), МФА прямой и непрямой);
Культуральные (выявление возбудителя на культуре клеток, куриные эмбрионы, лабораторные животные);
Молекулярно-биологические (полимеразная цепная реакция (ПЦР), лигаз-ная цепная реакция (ЛЦР), метод ДНК-зондов и др.)
Выбор того или иного метода диагностики определяется характером процесса и возможностями лаборатории. Наиболее распространенными из них являются: ПЦР, ИФА, ПИФ и выделение возбудителя на культуре клеток. Каждый из этих методов имеет свои преимущества и недостатки, поэтому рекомендуется использовать комбинацию нескольких методов обследования.
Самый простой и доступный метод диагностики урогенитального хлами-диоза является метод цитологического окрашивания соскобного материала от больного по Романовскому-Гимзе, однако данный метод нельзя считать пригодным, так как из-за малых размеров возбудителя можно выявить только хламидийные включения, а не отдельные микроорганизмы. Таким методом можно выявить хламидии только у 15-30% больных. Кроме того, несмотря на то, что метод достаточно прост, на просмотр препарата уходит 30-40 минут, и метод не применим для скрининга [29,64].
Эпидемиологической ценностью обладают серологические методы диагностики урогенитального хламидиоза, которые основаны обнаружении растворимого антигена хламидии в исследуемых пробах, самым распространенным из них является метод ИФА [40,42,48,53,86,176,193]. В настоящее время существует большое количество отечественных и зарубежных имму-ноферментных тест-систем. Методика постановки и оценка результатов проводятся в соответствии с рекомендациями фирм-изготовителей.
Чаще используются наборы реактивов Imx Select Хламидия (Abbott Laboratories) и Chlamydia-antigen ELISA (Medac Diagnostica). Тест Imx Select Хла-
мидия (Abbott Laboratories) основан на технологии ИФА-анализа на микрочастицах (МИФА) и предназначен для качественного определения липополи-сахаридного антигена C.trachomatis в эндоцервикальных и уретральных мазках на анализаторе Imx. Данный набор содержит компоненты, полученные из человеческого материала, что обуславливает необходимость соблюдения при работе правил биологической безопасности. Тест-система Chlamydia-antigen ELISA (Medac Diagnostica) является экономичным и в то же время достаточно специфичным и чувствительным методом в рутинной диагностике хлами-дийной инфекции. Этот тест представляет собой метод твердофазного ИФА-анализа для определения антигенов хламидий. Твердая фаза покрыта хлами-дийными моноклональными антителами установленной специфичности. Амплификация достигается с использованием технологии полимерной конъюгации, в результате чего происходит фиксация, при которой на каждый связанный участок антигена приходится полимерный комплекс с высокомолекулярным фрагментом. Благодаря этому впервые стало возможным идентифицировать внеклеточно расположенные ЭТ, что выгодно отличает этот метод диагностики от большинства других, сводившихся к обнаружению типичных внутриклеточных включений [26]. Визуально положительные пробы окрашиваются в желто-оранжевый цвет. Интенсивность окраски пропорциональна количеству антигена хламидий. Точный результат исследования определяют с помощью микроЭВМ, спектрофотометра "Мультискан" или другого аппарата для ИФА при длине волны 492 нм.. Преимуществами данного метода являются: относительная простота проведения и возможность проанализировать большое количество образцов за несколько часов.
При хламидийной инфекции в организме происходит последовательный синтез иммуноглобулинов IgM, IgA и IgG. Острая фаза заболевания характеризуется выработкой IgM антител против специфических хламидийных LPS. Маркеры острой стадии определяются через 5-6 дней после начала заболевания, а также в первые дни обострения хронического процесса. Период полу-
распада IgM составляет пять дней. В последующем продукция IgM нарастает, достигая, пика к 8-10 дню. Прогрессирование заболевания характеризуется появлением IgA антител, которые можно обнаружить через 10 дней от момента первичных симптомов заболевания [30]. Незначительное время могут одновременно присутствовать IgM и IgA.
Затем происходит постепенное снижение уровня IgA и постепенное нарастание концентрации IgG. Диагностически значимый уровень IgG в крови начинает регистрироваться на 15-20 дни от начала болезни [38].
Прогрессирование заболевания, переход в хроническую стадию характеризуется одномоментным обнаружением диагностически значимых титров IgA и IgG в сыворотке крови. При первичной хламидийной инфекции титры IgA и IgG антител изменяются в динамике, как в сторону повышения, так и понижения и разнонаправлены по отношению друг к другу. Однако при уже сформировавшемся хроническом процессе показатели IgA и IgG остаются на одном уровне. Колебания только на одну титровую единицу не являются достоверным признаком иммунологического изменения. В ряде случаев, что составляет поданным разных авторов от 3 до 10%, при хроническом хламидио-зе, прежде чем выявятся антитела IgG, в течении нескольких недель регистрируются низкие титры антител IgA в крови. У пациентов с бессимптомным течением болезни и постоянно низким титром в сыворотке IgA (при отсутствии других Ig) в течении многих недель, следует думать о наличии перси-стентной формы хламидийной инфекции. Длительно циркулирующе в низком титре IgG указывают на давно перенесенную хламидийную инфекцию [86].
Необходимо отметить, что серологические показатели без бактериологического анализа могут считаться при сероконверсии или при обнаружении IgA или IgG антител, что случается примерно в 30-40% случаев [114].
На необходимость четкого нарастания антител в парных сыворотках в 2-4 раза от первоначального уровня при выявлении IgG, указывают многие
авторы, т. к. однократное выявление антихламидийных антител может быть связано не только с текущим заболеванием, но и с перенесенной инфекцией хламидийной этиологии [41,42,45, 152].
Использование для прямой индикации хламидий в пораженных клетках флюоресцирующих поликлональных антител значительно повышает вероятность обнаружения возбудителя, однако этот метод все же существенно уступает культуральному методу [64].
В эпидемиологическом плане нельзя забывать, что существует риск перекрестных реакций С. trachomatis, С. psittaci, C.pneumoniae, особенно при использовании родоспецифического теста [37]. Необходимо отметить, что вследствие низкой чувствительности и специфичности при постановке ИФА возможно большое количество ложноположительных результатов, поэтому данный метод нуждается в применении подтверждающих тестов.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - наиболее распространенный в настоящее время метод в диагностике заболеваний, передающихся половым путем, за счет высокой (90-100%) чувствительности и специфичности одновременно [45,116,132,166].
Метод ПЦР впервые разработан в 1983 г. [86]. Суть метода заключается в том, что в исследуемый образец, предположительно содержащий тот или иной инфекционный агент, вносятся синтезированные в лаборатории нуклео-тидные последовательности (праймеры), комплиментарные генетическому материалу искомого возбудителя. Такие праймеры способны специфически взаимодействовать с геномной ДІЖ (или РНК) инфекционного агента. Если исследуемую пробу подвергнуть температурной обработке, то двухспираль-ная ДІЖ, содержащаяся в инфекционном агенте, денатурирует и становится доступной для взаимодействия с двумя праймерами, комплиментарными определенной зоне геномной ДНК. Подвергая такой образец повторным циклам денатурации и ренатурации ДНК, при которых происходит специфическое связывание праймеров с соответствующей зоной ДНК, в определённых усло-
виях (содержащиеся в реакционной смеси дезоксинуклеотидфофатов и термофильной ДНК полимеразы) происходит избирательное размножение (амплификация) участка ДНК определенного размера, который задается при выборе праймеров. Таким образом, процесс амплификации включает в себя три стадии: денатурации, отжига или ренатурации и элонгации [36]. Данный метод широко используется для специфической детекции различного генетического материала вирусной и бактериальной природы [36]. Однако, несмотря на широкое использование молекулярных методов при определении хлами-дий в клинических образцах, ряд ведущих специалистов считают, что результат одного лабораторного теста часто не является единственным основанием для постановки диагноза или принятия решения о тактике ведения пациента [52].
Метод культивирования хламидий на клеточных линиях используется с 70-х годов. Многие авторы признают его самым надежным методом диагностики хламидийной инфекции [14,22,24,30,46,55,74]. К сожалению, данный метод по-прежнему остается самым трудоемким, длительным и требующим довольно дорогостоящего оборудования и высокой квалификации персонала, поэтому использование в широкой практике такого метода не представляется возможным. Необходимо отметить, что основным достоинством культурального метода является выделение только живых форм возбудителя, и это свойство выгодно отличает его от молекулярных методов обследования, могущих в силу своей высокой чувствительности давать ложноположительные результаты [171]. До недавнего времени метод культивирования хламидий на культуре клеток считался "золотым стандартом", но с появлением молекулярных методов диагностики полимеразной и лигазной цепной реакции, в качестве стандарта используется "расширенный золотой стандарт", сочетающий культуральный метод с одним из некультуральных методов, чаще всего амплификационных [99,198]. Совпадение результатов, полученных двумя этими методами, позволяет врачу быть уверенным в правильной диагностике. Гораздо сложнее
ностике. Гораздо сложнее обстоит дело, если при использовании двух методов получены разные результаты, т. е. налицо "расходящийся диагноз". Классики хламидиологии [52,197] рекомендуют поступать следующим образом: при положительном результате в культуре и отрицательном в амплификаци-онном тесте (ПЦР) ставится положительный диагноз, при отрицательном результате в культуре и положительном результате в амплификацилнном тесте проводиться дополнительный некультуральный метод.
1.6 Этиотропная терапия урогенитального хламидиоза Несмотря на то, что предлагаются все новые антибактериальные препараты, схемы и методы лечения, оптимизация методов терапии больных уро-генитальным хламидиозом по-прежнему остается одной из основных проблем современной венерологии [10,16,62,65,67,74,76]. Предлагаемые схемы лечения имеют лишь эмпирическое обоснование, поскольку корреляции между результатами исследования чувствительности хламидий в культуре клеток и эффективностью лечения не установлены. Результаты клинических испытаний также не имеют абсолютной ценности, так как оценку эрадикации хламидий осуществляют в различные сроки от недели до месяца, более отдаленные результаты не оценивают, причины неудач терапии не исследуют. Формирование устойчивости к антибиотикам как один из факторов неэффективности проведенной терапии привлекло внимание лишь в последнее время. Поскольку C.trachomatis - внутриклеточный паразит, то выбор препаратов, активных в отношении этого микроорганизма ограничивается только теми, которые способны проникать внутрь клетки. Кроме того, антихламидий-ный агент должен: создавать в клетке необходимую концентрацию, подавляющую размножение возбудителя; длительно сохранять эффективную концентрацию в тканях, так как цикл размножения хламидий примерно 48 часов, а чувствительностью к антибиотикам обладают только ретикулярные тельца (РТ); иметь низкую токсичность и минимальные побочные реакции.
На основе многочисленных исследований в настоящее время при лечении хламидийной инфекции применяют три основных группы антибиотиков: тет-рациклины, макролиды и фторхинолоны, а обычный перечень выбора составляют: азитромицин (A3), доксициклин (ДОКС), офлоксацин (ОФЛ), эритромицин (Эр) и т. п. [194].
Клиническая эффективность тетрациклиновых антибиотиков при хламидийной инфекции изучена достаточно хорошо. По-прежнему одним из высокоэффективных препаратов при лечении хламидийной инфекции остается препарат группы тетрациклинов - доксициклин [101,183], однако невозможность применения при беременности и у детей ограничивает его использование [23]. Тетрациклины имеют широкий спектр действия, относительно низкую токсичность, обуславливающие побочные эффекты. Механизм действия связан с присоединением молекулы антибиотика к S7 белку рибосомы. В результате происходит угнетение белкового синтеза. Кроме того, тетрациклины связывают ионы двухвалентных металлов, ингибируя тем самым ферментные системы. Эти препараты имеют высокий уровень активности in vitro в отношении хламидий, однако, у них слабо выражен бактерицидный эффект: минимальная бактерицидная концентрация (МБК) значительно выше, чем минимальная ингибирующая концентрация (МИК).
К числу активных противохламидийных препаратов относятся макролиды - антибиотики основу химической структуры, которых составляет макро-циклическое лактонное кольцо и особым преимуществом которых является способность быстро проникать и накапливаться в клетках эукариот, что является существенным при лечении заболеваний, вызванных внутриклеточными бактериями. В клинике из макролидных антибиотиков лучше всего изучены эритромицин и азитромицин. Эффективность эритромицина по данным многочисленных испытаний (0,5 мг 4 раза в сутки 7 дней) при урогенитальной хламидийной инфекции составляет 77-91% [83,164,169,170,185,213], эфф-
фективность азитромицина, по данным клинических испытаний, составляет 88-98% [110,137,161,165,172,212].
Азитромицин может накапливаться в фагоцитах, которые выполняют транспортную функцию по доставке препарата в место воспаления. В отличие от других макролидов, азитромицин не оказывает стимулирующего воздействия на моторику желудочно-кишечного тракта. В настоящее время опубликовано много исследований, в которых подтверждается высокая эффективность одномоментного лечения неосложненного урогенитального хламидиоза, одним граммом азитромицина. Это стало возможным благодаря уникальной фармакокинетике азитромицина: его длительной способности сохраняться в тканях. Между тем нельзя оставить без внимания работы, свидетельствующие о том, что одномоментное лечение хламидиоза нередко не приводило к полному излечению этой инфекции [25]. По мнению Гомберга М. А., критерии оценки данной схемы лечения в большой степени зависят от правильности подбора пациентов для такой терапии, однородности испытуемых групп и групп сравнения, а также качества и сроков использования диагностических тестов, применяющихся для контроля микробиологического излечения, что также подтверждают и другие авторы [25,138,183,196,208]. Антимикробный эффект макролидов, обусловлен нарушением синтеза белка в микробной клетке. Предложена общая модель, объясняющая механизм действия, различных макролидов. Антибиотик связывается с рибосомой рядом с пептидилтрансферазным центром, а затем в зависимости от длины и конфор-мации вновь синтезированной белковой цепи, в большей или в меньшей степени ингибирует ее дальнейший рост. Большие 16-членные макролиды, присоединяясь к рибосоме вследствие своего размера, занимают в пространстве место, предназначенное для удлиняющейся белковой цепи. Это приводит к дестабилизации комплекса рибосома-пептидил-тРНК и к ингибированию элонгации большей части белков. Маленькие, преимущественно 14-членные макролиды, только частично блокируют элонгацию белковой цепи, в зависи-
мости от ее конформации. Например, практически не ингибируется синтез олигофенилаланина в отличие от олиголизина или большинства природных белков, синтез которых блокируется практически полностью [230].
Часто случается, что, хотя элонгация цепи заблокирована, комплекс ри-босома-пептидил-тРНК остается стабильным. В этом случае может происходить трансляция генов семейства erm. Белки Erm метилируют рибосому, которая при этом, теряет способность связывать макролиды. Устойчивость, приобретенная таким образом, называется индуцированной. Способностью индуцировать устойчивость обладают в основном 14-членные МЛ, такие как Эритромицин, однако она во многом определяется также пространственной структурой МЛ [230].
Фторхинолоны - синтетические препараты, являющиеся фторированными производными налидиксовой кислоты и других хинолонов. По результатам многочисленных исследований Комиссий FDA США из всей группы фторхинолонов только офлоксацин рекомендован для лечения негонококковых уретритов, вызванных С. trachomatis [6,158,175]. Фторхинолоны оказывают бактерицидный эффект, ингибируя два жизненноважных фермента микробной клетки - ДНК-гиразу и топоизомеразу IV - в результате происходит фрагментация хромосомной ДНК [108,147,173]. Было обнаружено, что вначале образуется комплекс хинолон-гираза-ДНК. Основную роль здесь играет N-концевой домен субъединицы А, образуя специфический тирозил-фосфатный эфир между Туг 122 и 5Л-концевыми фосфатами одиночных цепей ДНК. Этот комплекс стабилен и не приводит к релаксации суперскрученной ДНК, однако вызывает бактериостатический эффект. Процесс обратим при низких концентрациях некоторых препаратов. В дальнейшем увеличение концентрации этих препаратов приводит к диссоциации комплекса, освобождению двухцепочечных разрывов и гибели клетки вследствие фрагментации хромосомной ДНК. Для некоторых фторхинолонов проявление бактерицидного эффекта требует активного клеточного метаболизма - синтеза РНК и
белка. В экспериментах in vitro наблюдается т. н. "парадоксальный эффект", когда при высоких концентрациях препаратов происходит снижение бактерицидной активности. Это происходит, потому что в больших концентрациях ФХ подавляют синтез белка и РНК, т. е. модулируют действие хлорамфени-кола и рифампицина [145,147,163]. Однако такие концентрации препаратов в организме при терапевтических дозах не достигаются. Для ЦФЛ, ОФЛ и ло-мефлоксацина (ЛФЛ) установлено, что снижение синтеза белка и РНК не уменьшает их бактерицидного действия [147].
1.7 Механизмы устойчивости бактерий к антибактериальным препаратам
Устойчивость микроорганизмов - возбудителей инфекционных болезней к антибактериальным препаратам является основным фактором, ограничивающим эффективность антимикробной терапии. Очевидность этого положения не вызывает сомнения, а актуальность проблемы распространения антибиотикорезистентности подтверждается многочисленными публикациями, посвященными этому вопросу. Феномен устойчивости необходимо рассматривать с двух точек зрения: как чисто микробиологическое явление, характеризующее взаимоотношения микроорганизмов и антибиотиков, и как клиническую ситуацию неэффективности этиотропной терапии. Клиническое значение микробиологической устойчивости далеко не однозначно. В ряде случаев антибиотик сохраняет клиническую эффективность и при инфекциях, вызванных устойчивыми к нему микроорганизмам, также появление у бактерий приобретенной резистентности не обязательно сопровождается снижением клинической эффективности антибиотика [61]. Резистентность микроорганизмов к антибиотикам может быть природной и приобретенной. Истинная природная устойчивость характеризуется отсутствием у микроорганизмов мишени действия антибиотика или недоступности мишени вследствие первично низкой проницаемости или ферментативной инактивации. Природная резистентность является постоянным видовым признаком и легко
прогнозируется. Под приобретенной устойчивостью понимают свойство отдельных штаммов бактерий сохранять жизнеспособность при тех или концентрациях антибиотиков, которые подавляют основную часть микробной популяции. Возможны ситуации, когда большая часть микробной популяции проявляет приобретенную устойчивость. Формирование антибиотикорези-стентности во всех случаях обусловлено генетически: приобретением новой генетической информации или изменением уровня экспрессии собственных генов. Известны следующие биохимические механизмы устойчивости бактерий к антибиотикам [60].
Модификация мишени действия антибактериальных препаратов.
Инактивация антибактериальных препаратов.
Активное выведение антибактериальных препаратов из микробной клетки (эффлюкс).
4. Нарушение проницаемости структур микробной клетки.
5. Формирование метаболического "шунта".
1.8 Механизмы, обеспечивающие устойчивость бактерий к макролидам. Основными механизмами, обеспечивающими устойчивость бактерий к МЛ являются: модификация мишени действия; активное выведение и ферментативная инактивация.
Достаточно скоро после введения в клиническую практику Эритромицина в 1953 году, появились клинические изоляты стафилококков, устойчивых к МЛ. У большинства штаммов устойчивость была связана с постранс-крипционной модификацией 23S рРНК аденин-специфической метилтранс-феразой (метилазой). Ген, кодирующий этот белок, получил название erm (erythromycin ribosome methylaion). В настоящее время выделено и охарактеризовано около 30 вариантов генов erm. Метилирование аденина в позиции 2058 23S рРНК в консервативном участке - петле домена V, включенного в перенос пептидильного остатка (ранние опыты с E.coli) [111] приводит к появлению устойчивости бактерий ко всем видам МЛ [230]. Вскоре после иден-
тификации семейства генов erm был обнаружен другой механизм резистентности, также основанный на изменении структуры рРНК. Было показано, что единичные мутации в гене рРНК (rrn) приводят к появлению резистентности к МЛ. Впервые эта форма устойчивости была обнаружена у дрожжевых митохондрий, в которых в большой субъединице рибосомы происходила замена позиции А2058 (здесь и далее нумерация нуклеотидов по E.coli) [207]. Вскоре после этого были получены сходные фенотипы E.coli при экспрессии в них мультикопийной плазмиды, несущей мутантный аллель гена rrn [204], а затем мутации в этом гене были найдены в клинических изолятах патогенных бактерий. В основном устойчивость к МЛ, обуловленная мутациями гена rrn, наблюдается у микроорганизмов, имеющих только одну или две копии этого гена - например, Helicobacter spp, Micobacterium spp [131,225]. Устойчивость бактерий, несущих более двух копий гена erm, обычно связана с метилированием аденина в позиции 2058 [225].
Еще одним механизмом, обеспечивающим устойчивость бактерий к МЛ, является активный выброс антибиотика. Ross и др. [194] показали участие активного выброса в формировании устойчивости к Эр.
Среди грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов описаны ферменты, инактивирующие МЛ. Некоторые из них обладают широким субстратным профилем, другие инактивируют только отдельные антибиотики. Кроме того, устойчивость к отдельным макролидам может быть связана с модификацией Эр посредством его фосфорилирования [159], гликозилиро-вания [149], либо при разрушении лактонного кольца эстеразой [84,188]. Распространение и клиническое значение ферментов, инактивирующих макро-лидные антибиотики невелико.
При исследовании устойчивых к Эр мутантов E.coli и Streptococcus pneumoniae было обнаружено изменение структуры рибосомы, связанное с мутациями в генах рибосомальных белков L4 и L22 [110]. Мутации в этих белках приводят к изменению пространственной структуры рибосомы, что препят-
ствует ее взаимодействию с антибиотиком [225]. Исследования в этом направлении в настоящее время продолжаются.
1.9 Механизмы резистентности бактерий к фторхинолонам
Ведущим механизмом устойчивости к фторхинолонам является модификация мишеней - двух бактериальных ферментов ДНК-гиразы и топоизоме-разы IV, которые относятся к топоизомеразам II типа, опосредующих кон-формационные изменения в молекуле бактериальной ДНК, необходимые для ее нормальной репликации и имеют не только высокую гомологию аминокислотной последовательности, но и одинаковое строение фермента [97]. Каждый из ферментов состоит из четырех субъединиц. ДНК-гираза состоит из двух gyrA и двух gyrB субъединиц (соответствующие гены gyrA и gyrB), топоизомераза IV - из субъединиц рагС и рагЕ (соответствующие гены рагС ирагЕ). Гены обоих ферментов локализованы на бактериальной хромосоме.
Поскольку топоизомеразы выполняют несколько различные функции, то для подавления жизнедеятельности микробной клетки достаточно ингибиро-вать активность только одного фермента, активность второго может сохраняться. Эта особенность объясняет тот факт, что для всех хинолонов можно выделить первичную и вторичную мишень действия. Первичной мишенью действия является тот фермент, к которому данный хинолон проявляет наибольшее сродство. Например, у грамотрицательных бактерий наибольшее сродство хинолоны проявляют к ДНК-гиразе, благодаря чему именно этот фермент является первичной мишенью их действия. Считается, что фторхи-нолоны, обладающие приблизительно одинаковым сродством к обеим топоизомеразам, в наименьшей степени способствуют селекции устойчивости. Это связано с тем, что для формирования устойчивого штамма мутации должны произойти одновременно в генах обоих ферментов, вероятность же двойных мутаций существенно ниже, чем одиночных.
Исследования показали, что точечные мутации в генах gyrA и рагС, инак-тивирующие действие ФХ локализуются в одинаковых участках, в области предполагаемых актвных центров. Nakanishi и соавт. очищали А и В субъединицы ДНК-гиразы из резистентного и чувствительного изолятов S.aureus. Исследованная in vitro, активность к сверхспирализации ДНК-гиразы, из устойчивого изолята, по сравнению с активностью фермента из чувствительного, не менялась при увеличении концентрации препаратов в 250-1000 раз, что коррелировало со значениями МИК, полученными для этих изолятов. Комбинации из гетерологических субъедениц показали, что именно А субъединица обеспечивала столь высокий уровень резистентности [180]. Hallet и соавт., используя технику сайтспецифического мутагенеза, получали замены Ser83 на Ala и Gin 106 на Arg в белке GyrA. У очищенных препаратов измененного и нативного ферментов определяли сверхспирализующую активность в присутствии ЦФЛ и других ФХ. Эксперименты показали, что для ин-гибирования мутантного фермента требуется в 10 раз больше препарата, чем для нативного [136].
Исследования gyrA E.coli ФХК мутантов показало наличие точечных нук-леотидных замен, расположеных близко относительно друг друга. Эти мутации приводили к аминокислотным заменам Ser в положении 83 на Leu или Trp, Gin 106 на His, А1а67 на Ser. Участок гена gyrA E.coli с 67 по 106 аминокислоту, рапсоложенный в области активного фермента, предложили называть районом определяющим резистентность к хинолонам (QRDR) [233]. Позднее, когда была установлена роль топоизомеразы IV в резистентности к фторхинолонам, в гене рагС было обнаружено наличие участка высокогомологичного QRDR gyrA Исследования других микроорганизмов, включая клинических изолятов, показали, что практически все нуклеотидные замены в генах, кодирующих А субъеденицы ДНК-гиразы и топоизомеразы IV, связанные с резистентностью к ФХ, локализованы именно в этих участках [106,154,177,181,228,220].
Исследуя ген gyrB, кодирующий В субъединицу ДНК гиразы в хинолон-резистентных мутантных E.coli, исследователями были обнаружены точечные мутации: у 9 из 13 протестированных мутантов - мутация Asp426-Asn, а в остальных 4 случаях - мутация Glu447Ha Lys [233]. Более поздние исследования вклада точечных изменений в генах gyrA и gyrB, в резистентность к хинолоновым препаратам, показали, что высокий уровень резистентности обеспечивается заменами именно в gyrA [143]. Японские исследователи проанализировали QRDR генов ДНК гиразы и топоизомеразы IV 344 клинических изолятов S.aureus. Все изоляты, имеющие замены в указанных генах, демонстрировали повышенный уровень резистентности к ЦФЛ, причем этот уровень был выше у изолятов, имеющих мутации в обоих генах [226]. На основании многочисленных наблюдений был сделан вывод о том, что первичной мишенью действия для фторхинолонов у грамотрицательных бактерий является ДНК-гираза, у грамположительных - топоизомераза IV [146].
В последние годы накапливаются данные о широком распространении среди грамположительных и грамотрицательных микрорганизмов устойчивости, связанной с активным выведением хинолонов. У штаммов с высоким уровнем устойчивости к фторхинолонам этот механизм часто сочетается с модификацией мишеней [60]. ІЛОАнтибактериальная устойчивость микроорганизмов,обусловленная изменениями в клеточной стенке. Одним из самых распространенных механизмов устойчивости явлются: наличие барьера проницаемости и активный обратный транспорт (эффлюкс), что затрудняет доступ антибактериального агента к мишени.
Дополнительная наружная мембрана грамотрицательных является хорошим барьером для антибиотиков. Для того, чтобы обеспечить поступление необходимых клетке веществ из окружающей среды в во внешней мембране имеются специальные белки - порины, образующие специальные водные каналы. Свойства поринов (наличие заряженных аминокислотных остатков,
размеры) способствуют селективному проникновению веществ внутрь клетки [113,148,201]. Возникновение мутаций в генах поринов приводит к снижению проницаемости антимикробных агентов [232].
Активный обратный транспорт обеспечивается так называемым эффлюкс-транспортером, который обычно связан с белком помощником и каналом наружной мембраны. Проникающий через наружную мембрану амфифильный агент (обычно через пориновые каналы), частично встраивается в бислой внутренней мембраны. Транспортер захватывает молекулу этого агента и выбрасывает его наружу через свой канал. Агенты, проникающие в цитоплазму, также захватываются транспортером и выбрасываются наружу. Мутации в генах системы эффлюкса, могут повышать уровень резистентности. Усиление выброса препарата из клетки некоторые японские ученые связывали с точечной мутацией в белок-кодирующей последовательности гена [186]. Мутации в промоторной части гена вызывают увеличение уровня его экспрессии и, как следствие, приводят к усилению выброса антибиотиков [153]. Точечные мутации в белок-кодирующей последовательности гена, также приводят к усилению выброса препарата [186]. Высокий уровень резистентности может быть обеспечен эффлюксом, опосредованным протоновым градиентом.
1.11 Антибиотикорезистентность хламидий Проблема устойчивости хламидий к антибактериальным препаратам привлекла внимание исследователей лишь в последнее время. Известно, что в опытах in vitro хламидий мало подвержены действию даже очень высоких концентраций антибиотиков [156]. При недостатке питательных веществ, действии лекарственных агентов происходит замедление процесса деления и созревания хламидий. Недавно Dreses-Werrigloer и др. [120,121] в опытах in vitro показали, ЦФЛ, ОФЛ и A3 не вызывают гибели хламидий, временно индуцируя их персистенцию.
До недавнего времени единственными антибиотиками, к которым in vitro была зарегистрирована резистентность C.trachomatis, являлись рифампицин
и некоторые фторхинолоны. Селекция рифампицинрезистентных штаммов в лаборатории происходит достаточно легко, однако необходимо отметить, что рифампицин, обладающий высокой эффективностью в отношении С. trachomatis, является в настоящее время практически единственным препаратом, применяемым для лечения лепры и туберкулёза. Поэтому он не рекомендован ВОЗ для лечения урогенитального хламидиоза.
По уровню антихламидийной активности in vitro такие традиционные фторхинолоны, как ципрофлоксацин и офлоксацин близки между собой (МПК 90 составляет соответсвенно 2,0 и 1,0 мкг/мл) и несколько уступают другим антибиотикам. Однако при минимальных различиях в активности in vitro ципрофлоксацин и офлоксацин существенно различаются по клинической эффективности [59].
Возможность формирования устойчивости С. trachomatis к фторхиноло-нам была показана in vitro [115]. В результате селекции с использованием офлоксацина и спарфлоксацина были получены мутантные штаммы (МПК составляла 32-64 мкг/мл). Все мутантные штаммы были устойчивы к спар-флоксацину, офлоксацину и пефлоксацину независимо от того, какой фтор-хинолон был использован для селекции. При изучении механизма устойчивости в ДНК-гиразе была обнаружена замена серина на изолейцин в положении 83 полипептидной цепи. Полученные данные свидетельствуют о том, что первичной мишенью действия фторхинолонов у C.trachomatis является ДНК-гираза, селекция мутаций происходит в локусе, типичном для других грамот-рицательных бактерий.
При исследовании устойчивости к доксициклину штаммов недавно был обнаружен так называемый феномен гетеротипической резистентности - когда после применения антибиотика выживает только небольшая часть культуры. При этом, как правило, не происходит селекции резистентных организмов, то есть при следующем пассаже устойчивой оказывается снова только часть бактерий [150]. Появление данного феномена ограничивается
штаммами, полученными от больных, у которых лечение было неэффективным. Предполагают, что в жизненном цикле выживших бактерий преобладают стадии, в которых они наименее чувствительны к действию антибиотков. Исследование молекулярных маркеров, характеризующих данные формы хламидий, могут дать ключ к пониманию механизмов этого необычного типа резистентности. Позднее, были описаны случаи выделения С. trachomatis демонстрировавших избирательную устойчивость к тетрациклинам [162], в данном случае штамм с МПК препарата более 64 мкг/мл также был выделен от больного после неудачного лечения этим антибиотиком.
Отмечены случаи рецидивирующих заболеваний, обусловленных С.trachomatis, устойчивой к ДОКС, A3 и ОФЛ [206]. Однако молекулярные механизмы, обуславливающие антибиотикоустойчивость С.trachomatis, в данном случае не были рассмотрены.
В заключение следует сказать, что хотя исследования механизмов ан-тибиотикоустойчивости различных патогенных бактерий ведутся уже много лет. В настоящее время опубликовано крайне мало данных относительно хламидий. Исследовалась чувствительность к антибиотикам клинических изолятов хламидий, были обнаружены устойчивые изоляты, однако молекулярные основы данной устойчивости не были изучены. За последние несколько лет, в работах российских исследователей, было показано значение мутаций в гене 23SpPHK, у резистентных к АМП клинических изолятах, но связи между обнаружением данных мутаций и неудачами лечения выявлено не было[49].
В представленной работе выявлено несколько клинических изолятов, устойчивых in vitro к макролидам и фторхинолонам. В клинических изолятах С. trachomatis исследованы молекулярные изменения в генах мишеней антибактериальных агентов.
![Комплексная терапия хронического урогенитального хламидиоза с учетом изменений иммунологической реактивности [Электронный ресурс]](/i/i/4477/204593.png "Комплексная терапия хронического урогенитального хламидиоза с учетом изменений иммунологической реактивности [Электронный ресурс] Корепанов Александр Робертович")
