Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 9
Предисловие 9
1.1. Пузырчатка как парадигма специфического аутоиммунного заболевания органов 9
1.1.1. Роль аутоантител при развитии аутоиммунной пузырчатки 10
1.1.1.1. Субклассы иммуноглобулина G при аутоиммунной пузырчатке 11
1.1.2. Антигены-мишени при аутоиммунной пузырчатке 17
1.2. Эпидемиологические и клинические особенности течения пузырчатки в различных странах мира 20
1.3. Патогенетические факторы и аутоиммунная пузырчатка 21
1.3.1. Роль генетической предрасположенности в развитии аутоиммунной пузырчатки 22
1.3.2. Роль экзогенных и эндогенных факторов в развитии аутоиммунной пузырчатки 25
1.3.2.1. Лекарственные препараты и аутоиммунная пузырчатка 25
1.3.2.2. Продукты питания и аутоиммунная пузырчатка 26
1.3.2.3. Пестициды и аутоиммунная пузырчатка 29
1.3.2.4. Ультрафиолетовое излучение и аутоиммунная пузырчатка 30
1.3.2.5. Вирусные инфекции и аутоиммунная пузырчатка 32
1.3.2.6. Традиционная косметика Тунисских женщин и аутоиммунная пузырчатка 35
Заключение 36
Глава II. Материалы и методы исследования 39
2.1. Материалы исследования 39
2.2. Первичная обработка биопсийного материала 42
2.3. Метод выявления фиксированных антител (иммуноглобулинов) и полных иммунных комплексов 42
2.3.1. Модифицированный прямой метод иммунофлюоресценции 43
2.4. Метод выявления циркулирующих аутоантител 44
2.5. Микрофотографирование 45
2.6. Статистическая обработка 45
Глава III. Клинико-морфологическая картина аутоиммунной пузырчатки в разные периоды ее развития и факторы, способствующие развитию процесса 46
3.1. Клинико-морфологическая характеристика больных с активным иммунопатологическим процессом 46
3.1.1. Клинико-морфологическая картина впервые диагностируемой аутоиммунной пузырчатки 46
3.1.2. Клинико-морфологическая картина аутоиммунной пузырчатки в стадии обострения иммунопатологического процесса 62
3.2. Факторы, провоцирующие развитие аутоиммунной пузырчатки 74
3.3. Клинико-морфологическая картина больных с аутоиммунной пузырчаткой в стадии клинической ремиссии 80
3.4. Обсуждение 90
Глава IV. Иммунологические и иммуноморфологические особенности аутоиммунной пузырчатки по отношению к субклассам иммуноглобулина G и СЗ компоненту комплемента 104
4.1. Циркулирующие IgG-аутоантитела и их гетерогенность в разные периоды развития аутоиммунной пузырчатки 105
4.1.1. Субклассовая характеристика циркулирующих IgG-аутоантител 116
4.1.1.1. Циркулирующие IgGl-аутоантитела 117
4.1.1.2. Циркулирующие IgG2-aymoaHmumena 119
4.1.1.3. Циркулирующие lgGS-аутоантитела 120
4.1.1.4. Циркулирующие С4-аутоантитела 123
4.1.1.5. Сравнительная субклассовая характеристика циркулирующих IgG-аутоантител 125
4.1.2. Система комплемента в гуморальном ответе 134
4.1.2.1. СЗ компонент комплемента в гуморальном ответе при аутоиммунной пузырчатке 135
4.2. Иммуноморфологическая картина фиксированных иммунных комплексов (иммуноглобулин класса G с субклассовой характеристикой и СЗ компонент комплемента) при аутоиммунной пузырчатке в разные периоды ее развития 141
4.2.1. Фиксированный иммуноглобулин класса G в биоптатах кожи больных аутоиммунной пузырчаткой 142
4.2.1.1. Особенности иммуноморфологической картины фиксированного иммуноглобулина класса G в биоптатах кожи больных аутоиммунной пузырчаткой 147
4.2.2. Субклассовая характеристика фиксированного IgG в биоптатах кожи больных аутоиммунной пузырчаткой 160
4.2.2.1. Фиксированный IgGl в биоптатах кожи больных аутоиммунной пузырчаткой 160
4.2.2.2. Фиксированный IgG2 в биоптатах кожи больных аутоиммунной пузырчаткой 164
4.2.2.3. Фиксированный IgG3 в биоптатах кожи больных аутоиммунной пузырчаткой 167
4.2.2.4. Фиксированный IgG4 в биоптатах кожи больных аутоиммунной пузырчаткой 168
4.2.3. СЗ компонент комплемента в клинически интактных участках кожи больных с разными формами аутоиммунной пузырчатки 178
4.3. Обсуждение данных, полученных с помощью методов иммунофлюоресценции 183
Заключение 207
Выводы 218
Список литературы 220
- Субклассы иммуноглобулина G при аутоиммунной пузырчатке
- Клинико-морфологическая картина аутоиммунной пузырчатки в стадии обострения иммунопатологического процесса
- Сравнительная субклассовая характеристика циркулирующих IgG-аутоантител
- Обсуждение данных, полученных с помощью методов иммунофлюоресценции
Субклассы иммуноглобулина G при аутоиммунной пузырчатке
Определение субклассов IgG при пузырчатке является интересным и важным моментом при изучении заболевания. Известно, что IgG составляет около 75% антител сыворотки крови, имеет 4 субкласса - IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4, которые определяются различиями аминокислотных последовательностей цепей IgG. При этом IgGl является наиболее часто встречаемым субклассом - 67% от общего уровня IgG, IgG2 - 22%, IgG3 - 7%, а наиболее редким субклассом является IgG4 - 4%. Известны определенные различия биологических свойств различных субклассов IgG. Так, например, IgGl, IgG2, IgG3 способны связывать комплемент, в отличие от IgG4, который комплемент не связывает. Все субклассы IgG проходят через плацентарный барьер и участвуют во вторичном иммунном ответе. Но IgGl и IgG3 вовлекаются в иммунный ответ против белковых антигенов, тогда как IgG2 и IgG4 - против гликопротеиновых антигенов [186, 187].
Многие авторы при исследовании пациентов с пузырчаткой обнаружили, что в сыворотке у большинства пациентов были выявлены все 4 субкласса IgG-антител. Было предположено, что IgG-антитела пузырчатки содержат 4 вида субклассов [120]. При дальнейшем изучении этого вопроса было отмечено, что в образцах сыворотки пациентов с пузырчаткой распределение субклассов IgG все-таки различно [62, 146]. Так, при эндемической листовидной пузырчатке выявлено преобладающее влияние на развитие патологии 04-аутоантител [171]. В ряде случаев показано, что в сыворотке больных пузырчаткой преобладающим субклассом является IgGl, a IgG4 был самым редко встречаемым субклассом, он встречался даже реже, чем IgG2 и IgG3 [61]. Напротив, в исследованиях того же времени непрямым методом имму-нофлюоресценции во всех случаях было продемонстрировано наличие IgG4 специфичных аутоантител, тогда как IgGl-антитела были обнаружены лишь в части сывороток при более низком разведении, IgG2 не определялся, а IgG3-антитела встречались крайне редко [118]. Этим пытались объяснить различные клинические состояния исследуемых больных.
Во многих исследованиях было показано, что у пациентов в активной стадии вульгарной пузырчатки выявляются высокие титры IgGl и IgG4, что свидетельствует об их патогенетической роли при данном заболевании [61, 171, 213]. Другие авторы свидетельствуют о том, что гуморальный ответ в активной стадии вульгарной пузырчатки обусловлен чаще субклассом IgG4, а в стадии ее ремиссии - IgGl [61, 146].
При листовидной пузырчатке распределение субклассов IgG сходно с таковым при вульгарной пузырчатке: в стадии активного процесса преобладают С4-аутоантитела, а в доклинической стадии и стадии ремиссии болезни - IgGl [99, 134, 171, 213]. Пациенты с длительной ремиссией, их здоровые родственники и здоровая группа контроля имеют низкие титры IgGl аутоантител к эпидермальным белкам [61]. Наличие низких титров субкласса IgGl в контрольной группе у здоровых лиц можно объяснить тем, что этот субкласс, как отмечено вьппе, является наиболее распространенным среди всех субклассов IgG [186].
При исследовании сывороток больных с эндемической листовидной пузырчаткой в активной стадии заболевания, до его начала и здоровой группы контроля в Бразилии методом ELISA [57, 213] и сывороток больных с вульгарной пузырчатки методом иммуноблота [61, 65, 118, 129] был определен высокий уровень IgG4 как в стадии активного патологического процесса, так и в стадии ремиссии. Крайне редко IgG4 выявлялся у здоровых родственников и не обнаруживался в группе контроля. Эта взаимосвязь не прослеживалась по отношению к IgGl, который выявлялся в сыворотке больных в активной стадии пузырчатки, но редко - у пациентов в стадии ремиссии и у здоровых родственников. Существовала также значительная разница между ремиссией и активной стадией для IgG2. Лишь у некоторых больных с активной формой патологического процесса был выявлен IgG2. В активной форме болезни также часто определялся IgG3 и редко он обнаруживался в стадии ремиссии. Кроме того выявлен интересный факт. Если IgGl определялся только на ранних стадиях клинических проявлений аутоиммунной пузырчатки, то IgG4 обнаруживался на протяжении всего периода болезни [82]. Эти результаты позволяют предположить, что переход от доклинической стадии в клиническую стадию заболевания, а также переход заболевания от стадии ремиссии к активному процессу, тесно связаны с переходом субклассов от IgGl к IgG4. Кроме того, полученные результаты показывают, что IgGl-антитела сами по себе не в состоянии вызвать болезнь. Так, Lin M.S. и соавторы (2001) установили, что IgGl-антитела здорового человека, имеющего только IgGl-ответ, не способны вызвать симптоматику болезни в экспериментальной модели на животных (мыши) при пассивной их передаче в дозе 15 мг/кг. Наоборот, С4-антитела больных пузырчаткой способны спровоцировать развитие болезни при введении животным малых доз IgG4 антител (1,5 мг/кг), концентрация которых была в 10 раз меньше, чем при введении IgGl-антител [135].
Исследования по изучению патогенности аутоантител к эпитопам дес-моглеина 1 (Dsgl, аутоантиген листовидной пузырчатки) показали, что внутримолекулярное распространение эпитопа может быть ответственным за переключение субклассов IgG. Так, в доклинической фазе и в стадии ремиссии болезни синтезируются IgG 1-аутоантитела, направленные против ЕС-5 карбоксильной части десмоглеина 1 [134]. Это состояние меняется, когда болезнь переходит в активную стадию и происходит С4-ориентированный ответ, направленный на другие части молекулы (ЕС 1-2), которые располагаются на амино-концах Dsgl [135]. Ранее было обнаружено, что IgG4-аутоантитела против Dsgl распознают только согласованные эпитопы, тогда как IgG 1-аутоантитела распознают как согласованные, так и линейные эпитопы, но не проявляют патогенность при пассивной их передаче на модели животных [100]. Факторы, которые могут привести к переключению IgG, включают генетические и экологические аспекты, которые могут сыграть решающую роль при развитии пузырчатки [53, 137].
Ряд исследователей при анализе субклассов IgG у пациентов в эндемических районах Бразилии обнаружили, что у части пациентов выявлялись IgG4-aHTm a к Dsgl за несколько лет до начала клинических проявлений пузырчатки [57]. В некоторых работах было показано, что переход из доклинической стадии в клиническую стадию заболевания связан с повышением уровня титров С4-аутоантител к Dsgl [57, 213]. При помощи метода ELISA при обследовании сывороток здоровых людей и пациентов, живущих в эндемичных районах Бразилии, на наличие субклассов IgG к Dsgl, было отмечено, что практически все клинически здоровые люди имеют антитела к Dsgl. В течение нескольких лет наблюдения исследователи отметили, что у нескольких людей был отмечен переход эндемической листовидной пузырчатки из доклинической стадии в клиническую. При этом в сыворотке этих пациентов титр С4-антител к Dsgl в самом начале кожного проявления болезни стал выше. Важно отметить, что аутоантитела во время доклинической стадии были связаны с ЕС5 цепью Dsgl, тогда как во время клинической стадии патогенные аутоантитела распознавали эпитопы, локализующиеся только на ЕС2 цепи молекулы [57, 62].
При исследовании сывороток больных паранеопластической пузырчаткой методами иммуноэлектронной микроскопии с использованием антител, меченных пероксидазой к IgG и СЗ компоненту комплементу, были выявлены отложения этих компонентов только в базальном и шиповатом слоях эпидермиса. Они были тонкие и локализовались только на части мембран кера-тиноцитов, связанных с десмосомами. Некоторые кератиноциты имели признаки клеточной дегенерации и глубокого клеточного некроза. Пероксидаз-ные метки отложений были видны на десмосомах и полудесмосомах дермо-эпидермального соединения. Эта картина не наблюдается при изучении кожи пациентов с вульгарной пузырчаткой и с листовидной пузырчаткой. Во всех исследуемых случаях паранеопластической пузырчатки была обнаружена фиксация IgG и СЗ компонента комплемента в дермо-эпидермальном соединении. Однако фиксации антител в зоне базальной мембраны эпидермиса (lamina lucida) отмечено не было [36, 116, 160]. IgG 1-аутоантитела паранеопластической пузырчатки связывались с десмосомальными пластинками кератиноцитов и не распознавали внеклеточные части десмосом. IgG4-аутоантитела паранеопластической пузырчатки распознавали десмоглею слабым распределением пероксидазных отложений вдоль мембраны кератиноцитов между десмосом, но никогда не связывались с полудесмосомами или десмосомальными пластинками. Эта картина схожа с картиной присутствия С4-аутоантител при вульгарной пузырчатке [90, 116, 117, 118]. Но при паранеопластической пузырчатке аутоантитела против десмоглеина 3 принадлежат преимущественно субклассам IgGl и IgG2 [116, 117].
Клинико-морфологическая картина аутоиммунной пузырчатки в стадии обострения иммунопатологического процесса
Было обследовано 13 больных с различными формами аутоиммунной пузырчатки в стадии обострения, из них 6 (46,2%) мужчин и 7 (53,8%) женщин. Среди больных мужского пола 4 (66,7%) человека страдали вульгарной пузырчаткой, по одному больному страдали вегетирующей (16,65%) и себо-рейной (16,65%) формами пузырчатки. Среди больных женского пола 5 (71,4%) человек страдали вульгарной пузырчаткой, 2 (28,6%) - себорейной пузырчаткой. Ранее всем больным диагноз был подтвержден иммуногисто-химическим методом на основании иммуноморфологической картины, характерной для аутоиммунной пузырчатки: фиксация IgG в МСС многослойного плоского эпителия.
Средний возраст больных с обострением основного патологического процесса (аутоиммунная пузырчатка) у мужчин составил 56,33 ±13 лет, у женщин - 68,57 ± 10,4 лет. Продолжительность ремиссии отмечалась от 2 месяцев до 18 лет, средняя продолжительность ремиссии - 3,15 ± 2,65 года. Данные по продолжительности клиники заболевания представлены на рис. 3.16.
У 2 больных обострение аутоиммунной пузырчатки возникло на дозе преднизолона 5 мг/сут; у 2 других больных - 10 мг/сут; у 3 больных - 15 мг/сут; у 2 больных - 17,5 мг/сут и по 1 больному - на дозе 6,25 мг/сут, 25 мг/сут и 47 мг/сут соответственно. Один больной самостоятельно отменил прием поддерживающей дозы преднизолона (10 мг/сут per os) с продолжительностью клинической ремиссии в течение одного года.
Как и при первичном возникновении, обострению аутоиммунной пузырчатки чаще всего способствуют различные провоцирующие экзогенные и эндогенные факторы.
В анамнезе всех (100%) больных с обострением аутоиммунной пузырчатки указывается на предшествующее сильное психоэмоциональное перенапряжение. Кроме того, нами были выявлены другие факторы эндогенного и экзогенного характера, способные спровоцировать обострение аутоиммунной пузырчатки (рис. 3.17). На прием гипотензивных препаратов группы ингибиторов АПФ в течение от 5 до 10 лет и на солнечное воздействие указывали по 46,1% больных. При этом 66,7% больных начали принимать гипотензивные препараты за 2-5 лет до начала аутоиммунной пузырчатки и продолжали их прием до обследования при обострении заболевания, а 33,3% больных начали прием гипотензивных препаратов через 1-2 года после назначения глюкокортикостероидной терапии. Из 46,1% больного с обострением аутоиммунной пузырчатки все больные длительно и часто подвергались воздействию ультрафиолета до начала заболевания, при этом из этих больных 83,3% продолжали злоупотреблять воздействием ультрафиолета после развития пузырчатки, несмотря на рекомендации избегать воздействия ультрафиолетового излучения. В 38,5% случаев нами было отмечено нерационально быстрое снижение дозы глюкокортикостероидов до поддерживающей, со 100 мг в сутки до 10 мг в сутки в течение от 4 до 6 месяцев, а один больной самостоятельно полностью отменил прием глюкокортикостероидов. 23,1% больных указывали в анамнезе на длительный контакт с различными химическими веществами. У 15,4% больных присутствовали гормональные нарушения. На употребление алкоголя и длительный, более 20 лет, прием психотропных препаратов по поводу сопутствующего психического заболевания (смешанное тревожно-депрессивное расстройство, циклотимия) указывали по 7,7% больных.
Учитывая, что аутоиммунные заболевания, как правило, протекают на фоне сопутствующей соматической патологии, а также могут протекать на фоне паранеопластического процесса [28, 166], всем больным проведено комплексное обследование. Также существуют данные, свидетельствующие о том, что используемая в лечении аутоиммунной пузырчатки иммуносу-прессивная терапия (глюкокортикостероиды, цитостатики) способствует появлению неопластического процесса [18, 200].
Выявлено, что наиболее частыми сопутствующими заболеваниями у больных с обострением аутоиммунной пузырчатки были болезни сердечнососудистой системы, такие как ишемическая болезнь сердца (ИБС), атеросклероз аорты, гипертоническая болезнь (ГБ), стенокардия, недостаточность кровообращения (рис. 3.18). Они встречались у 11 (84,6%) больных. Заболевания желудочно-кишечного тракта (хронический гастрит, гастродуоденит, холецистит, панкреатит) наблюдались у 9 (69,2%) больных. Сахарный диабет, индуцированный приемом глюкокортикостероидов, диагностирован у 6 (46,1%) больных, при этом осложнения сахарного диабета, такие как диабетическая непролиферативная ретинопатия, диабетическая ангиопатия сетчатки, катаракта глаз - у 2 (33,3%) из 6 больных. Неврологические заболевания -дисциркуляторная энцефалопатия, остеохондроз, атактический синдром наблюдались у 3 (23%) больных.
На рис. 3.19 представлены сравнительные данные о локализации и характере патологического процесса в случае впервые диагностируемом заболевании и его обострении у одного и того же больного. Так, при впервые выявленном заболевании высыпания локализовались на коже у 3 (23,1%) больных, на слизистых оболочках - у 2 (15,4%) больных и у 8 (61,5%) больных высыпания локализовались одновременно и на коже, и на слизистых оболочках. Патологический процесс преимущественно был представлен вторичными морфологическими элементами. Это эрозии, которые наблюдались у всех обследованных 13 (100%) больных; геморрагические или серозные корки - у 5 (38,5%) больных и пятна - у 2 (15,4%) больных. Первичный морфологический элемент (пузырь) был представлен только у 7 (53,8%) больных.
При обострении патологического процесса у этих же больных высыпания локализовались на коже у 3 (23,1%) больных, слизистых оболочках - у 3 (23,1%) больных, одновременно и на коже, и слизистых оболочках - у 7 (53,8%) больных. Так же как и при впервые диагностируемой пузырчатке патологический процесс преимущественно был представлен вторичными морфологическими элементами: эрозиями, которые наблюдались у всех обследованных 13 (100%) больных; геморрагическими или серозными корками - у 6 (46,1%) больных и пятнами - у 4 (30,8%) больных. Первичный морфологический элемент (пузырь) был представлен только у 3 (23,07%) больных. При впервые диагностируемой пузырчатке симптом Никольского был положительным в 5 (38,4%) случаях из 13, а в случаях обострения болезни -у 8 (61,5%) больных.
При обострении патологического процесса цитологическое исследование мазков-отпечатков было проведено 3 больным, у одного (33,3%) из которых обнаружены акантолитические клетки.
Патоморфологическое исследование кожи с очага поражения было проведено 2 больным. У обоих больных были выявлены гистологические признаки, характерные для аутоиммунной пузырчатки (внутриэпидермаль-ные пузыри с явлением акантолиза).
В сыворотке крови обнаружены специфические IgG-аутоантитела к антигенам МСС многослойного плоского эпителия у 7 (77,8%) из 9 обследованных больных. При этом титр антител составлял от 1:10 до 1:1280.
Исследование клинически интактной кожи прямым методом иммуноф-люоресценции проводилось 11 больным. Фиксированный IgG в МСС эпидермиса клинически интактных участков кожи больных был выявлен у всех 11 обследованных больных.
Таким образом, при обострении основного аутоиммунного процесса только в 7 (53,8%) случаях из 13 одновременно были обнаружены и сывороточные антитела, и связанный в тканях иммуноглобулин. В остальных случаях мы обнаруживали либо циркулирующие IgG-аутоантитела IgG в сыворотке, либо фиксированный IgG к МСС эпидермиса в клинически интактных участках кожи больных.
Сравнительная субклассовая характеристика циркулирующих IgG-аутоантител
При исследовании субклассовой характеристики IgG в сыворотке крови пациентов нами было выявлено, что у всех 29 (100%) больных независимо от клинической формы и стадии развития пузырчатки присутствовал субкласс IgG2. Субкласс IgG4 был обнаружен у 25 (86,2%) больных, IgGl - у 18 (60,1%) больных, IgG3 - только у 12 (41,4%) больных.
При впервые выявленном заболевании циркулирующие IgG2-аутоантитела были обнаружены у всех 15 (100%) больных, IgG4-аутоантитела - у 14 (93,3%) больных, IgGl-аутоантитела - у 12 (75%) больных, IgG3-аутоантитела - у 6 (40%) больных.
В стадии обострения патологического процесса у всех 7 (100%) обследованных больных были обнаружены IgG2- и С4-аутоантитела; IgGl-аутоантитела - у 4 (57,1%) больных, IgG3-аутоантитела - у 4 (57,1%) больных.
В стадии клинической ремиссии аутоиммунной пузырчатки мы наблюдали следующее распределение субклассов: С2-аутоантитела - у всех 7 (100%) больных, С4-аутоантитела - у 5 (71,4%) больных, IgGl-аутоантитела - у 2 (28,6%) больных, ОЗ-аутоантитела - у 2 (28,6%) больных. У одной больной в стадии клинической ремиссии в сыворотке крови обнаруживались IgGl-, IgG2- и ОЗ-аутоантитела, направленные против антигенов-мишеней межклеточной связывающей субстанции только зернистого слоя. С4-аутоантитела у этой больной отсутствовали (клинический пример 14).
На рис. 4.16 представлена более подробная картина распределения и сравнительной характеристики циркулирующих IgG-аутоантител и его субклассов в сыворотке крови больных аутоиммунной пузырчаткой в разные периоды развития болезни.
Необходимо отметить, что независимо от клинических форм пузырчатки и стадии ее развития наиболее выраженная иммунофлюоресцентная реакция отмечалась с IgGl- и С4-аутоантителами. При этом отмечено, что антигеном-мишенью для субклассов IgG-аутоантител (IgGl - 94,5%, IgG3 -91,7%, IgG4 - 100%), кроме 02-аутоантител, независимо от клинической формы и стадии аутоиммунной пузырчатки наиболее часто являлись антигены межклеточной связывающей субстанции базального и шиповатого слоев эпидермиса. При этом IgGl- и С4-аутоантитела были дополнительно направлены к антигенам межклеточной связывающей субстанции зернистого слоя эпидермиса в 11,8% и 20% случаев соответственно.
В ряде случаев IgGl- и ОЗ-аутоантитела имели в качестве мишени только межклеточную связывающую субстанцию зернистого слоя.
Для циркулирующих С2-аутоантител у всех (100%) больных антигеном-мишенью служила межклеточная связывающая субстанция зернистого слоя эпидермиса. При этом у части больных С2-аутоантитела были дополнительно направлены к другим антигенам-мишеням. Так, у 27,7% больных антигеном-мишенью служили компоненты базальной мембраны эпидермиса; у 10,3% - межклеточной связывающей субстанции базального и шиповатого слоев эпидермиса; у 17,2% - межклеточной связывающей субстанции базального и шиповатого слоев с вовлечением в процесс базальной мембраны эпидермиса.
Интересен тот факт, что два субкласса IgG-аутоантител, IgG2- и IgG4-аутоантитела, имеют более широкий спектр антигенов-мишеней. Так, при обследовании одной больной с вульгарной пузырчаткой в стадии клинической ремиссии выявлены циркулирующие IgG2-ayroaHTm a к антигенам межклеточной связывающей субстанции всех слоев эпидермиса с наиболее выраженной иммунологической реакцией в зернистом слое эпидермиса при последующем обострении болезни - вовлечение в патологический процесс компонентов межклеточной связывающей субстанции только зернистого слоя.
При обследовании другой больной с впервые выявленной вульгарной пузырчаткой 102-аутоантитела были направлены к антигенам десмосомального аппарата зернистого слоя и базальной мембраны эпидермиса, a IgG4-аутоантитела - к межклеточной связывающей субстанции базального и шиповатого слоев эпидермиса. При повторном обследовании этой больной с длительно незаживающими эрозиями на слизистой оболочке полости рта (торпидное течение заболевания) 1С2-аутоантитела были направлены к антигенам межклеточной связывающей субстанции только зернистого слоя, а 1С4-аутоантитела - только к антигенам межклеточной связывающей субстанции базального слоя эпидермиса.
При обследовании третьей больной с впервые выявленной вульгарной пузырчаткой было выявлено, что С2-аутоантитела направлены к антигенам десмосомального аппарата всех слоев эпидермиса и базальной мембраны, а 104-аутоантитела - к антигенам десмосомального аппарата всех слоев эпидермиса с более выраженной реакцией в базальном и шиповатом слоях. При повторном обследовании этой больной с постоянно появляющимися эрозиями на коже туловища (торпидное течение) 1С2-аутоантитела были направлены к антигенам межклеточной связывающей субстанции зернистого слоя и базальной мембраны эпидермиса, а 1С4-аутоантитела - к антигенам межклеточной связывающей субстанции базального и шиповатого слоев эпидермиса.
Клинические примеры больных аутоиммунной пузырчаткой, демонстрирующие участие в развитии и течении болезни антител разных субклассов иммуноглоублина G
Пример 14. Обследована больная С, 31 год. Больна около 5 лет. В 2007 году на фоне психоэмоционального перенапряжения впервые появились высыпания в виде корочек на слизистой оболочке носа и пузырей на коже туловища, которые самостоятельно разрешались. Из анамнеза: в 2004 году резус-конфликтная беременность. В сентябре 2009 года после инсоляции и перенесенной ангины, по поводу которой больная получала последовательно цефотаксим 1 г 2 раза/сутки внутримышечно №10 и ампициллин 2 г в сутки per os №10, появились болезненные эрозии на слизистой оболочке полости рта. Стоматологом по месту жительства диагностирован: Афтозный стоматит. Местное лечение (полоскание полости рта отварами трав, метрогил-гель) без эффекта. Спустя 3 месяца появились пузыри с вялой покрышкой и эрозии на коже туловища. Цитологически обнаружены акантолитические клетки, краевой симптом Никольского положительный. Диагностирована: Вульгарная пузырчатка. С 16.10. 2009 года больная проходила стационарное лечение по месту жительства в городе Пенза (и/б № 1611). Получала комбинированную глюкокортикоидную (преднизолон 40 мг/сутки per os с в/м введением дипроспана 1,0 1 раз в 10 дней №3, с последующим снижением дозы преднизолона до 30 мг/сутки) и сопутствующую терапию. С целью уменьшения побочных явлений от терапии преднизоло-ном (развился синдром Иценко-Кушинга, стероидные угри) с середины декабря 2009 года по рекомендации дерматолога по месту жительства преднизолон был заменен на метипред per os. Больная получала метипред 30 мг/сутки с постепенным снижением дозы до 22 мг/сутки (30 мг №8, 28 мг №7, 26 мг №3, 24 мг №10, 22 мг №5). Лечение с положительным эффектом: на коже эрозии практически полностью эпителизировались, эрозии на слизистой оболочке полости рта уменьшились в размере.
На дозе метипреда 22 мг/сутки больная была госпитализирована в Федеральном Государственном Учреждении «Государственный Научный Центр Дерматовенерологии» (ФГУ ГНЦД) (и/б № 09-21676/10-1), где было проведено гистологическое и иммуноморфо-логическое исследование. Гистологически был обнаружен слабый ортокератоз с отшелушиванием, вакуольная дистрофия отдельных кератиноцитов в шиповатом слое эпидермиса. Данные гистологического исследования не позволяют поставить диагноз аутоиммунная пузырчатка. При исследовании клинически интактного участка кожи прямым методом иммунофлюоресценции была обнаружена фиксация IgG в межклеточной связывающей субстанции всех слоев эпидермиса, СЗ компонент комплемента в зоне базаль-ной мембраны эпидермиса. На основании клинической картины, данных анамнеза, результатов цитологического и иммуноморфологического исследований, диагноз вульгарная пузырчатка был подтвержден.
Обсуждение данных, полученных с помощью методов иммунофлюоресценции
За последние пять десятилетий сделано немало открытий в изучении патогенеза и диагностики аутоиммунной пузырчатки. С помощью методов иммунофлюоресценции доказана основная роль циркулирующих IgG-аутоантител в развитии столь угрожающего для жизни дерматоза [6, 20, 109]. Включение методов иммунофлюоресценции в клиническую практику дерматологов позволяет в более короткие сроки установить правильный диагноз, провести дифференциальную диагностику как с другими аутоиммунными буллезными дерматозами, так и с дерматозами не аутоиммунной природы. Кроме того, применение методов иммунофлюоресценции способствует более глубокому изучению патогенеза аутоиммунной пузырчатки, выявлению основных антигенов-мишеней при этом заболевании [3].
1) Общая характеристика циркулирующих специфических IgG-аутоантител и фиксированного IgG в межклеточной связывающей субстанции эпидермиса.
При сравнении полученных данных с помощью методов иммунофлюоресценции было отмечено, что процент выявления циркулирующих IgG-аутоантител к антигенам межклеточной связывающей субстанции в сыворотке больных аутоиммунной пузырчаткой в непрямом методе иммунофлюоресценции с использованием кожи теленка (в качестве субстрата) составил 80,5%. Выявление фиксированного IgG в серийных криостатных срезах клинически интактных участков кожи больных прямым методом иммунофлюоресценции составило 94,4%. При этом в 47,4% исследуемых случаев одновременно были выявлены как циркулирующие аутоантитела к межклеточной связывающей субстанции многослойного плоского эпителия, так и фиксированный IgG в срезах тканей в межклеточных пространствах эпидермиса, т.е. в той же локализации.
Анализ частоты выявления циркулирующих аутоантител к антигенам межклеточной связывающей субстанции многослойного плоского эпителия показал их вариабельность в зависимости от периода развития аутоиммунной пузырчатки. Так, наиболее часто циркулирующие IgG-аутоантитела обнаруживаются в активный период аутоиммунного процесса - в 83,3% случаях впервые выявленного заболевания и в 87,5% - в стадии его обострения. Наличие циркулирующих аутоантител в сыворотке больных с аутоиммунной пузырчаткой в стадии клинической ремиссии определяется в 70% случаях. Наиболее высокие титры (до 1:2560) аутоантител обнаруживались в период обострения заболевания при среднем их значении 1:657. При впервые выявленном заболевании максимальный титр аутоантител составлял 1:1280, средний уровень - 1:390. В стадии клинической ремиссии максимальный уровень специфических аутоантител составлял 1:320, средний уровень - 1:150.
Отмечено, что титры циркулирующих аутоантител не всегда коррелировали с тяжестью поражения кожных покровов и слизистых оболочек. Так, при обширных поражениях с захватом целых анатомических областей циркулирующие аутоантитела не всегда обнаруживаются или обнаруживаются в невысоких титрах, а при локальных поражениях кожи или слизистых оболочек титры аутоантител могут достигать высоких цифр (до 1:1280).
При обследовании больных с торпидным течением вульгарной пузырчатки выявлены различия в титрах циркулирующих аутоантител. Так, в одном случае наблюдалось увеличение титра от 1:320 до 1:1280, в другом - наоборот, наблюдалось снижение титра от 1:80 до 1:5. Повышение титра циркулирующих аутоантител в первом случае с торпидным течением пузырчатки, возможно, связано с антигенной стимуляцией из-за постоянно присутствующего неизвестного для данного случая раздражающего фактора, приводящего к хроническому течению патологического процесса. Снижение титра аутоантител во втором случае, возможно, связано со способностью кожи активно сорбировать циркулирующие аутоантитела из кровотока, тем самым создавая условия постоянного повреждения структурных элементов эпидермиса (антигенов-мишеней) и способствуя торпидному течению болезни.
Анализ частоты выявления фиксированного IgG показал идентичную картину вариабельности фиксированного IgG в зависимости от периодов развития болезни. Так, в стадии активного процесса (впервые диагностируемая аутоиммунная пузырчатки и период ее обострения) фиксированный IgG выявлялся в 100% случаях, в период клинической ремиссии - в 66,7% случаях.
Кроме того, при анализе данных, полученных с помощью прямого метода иммунофлюоресценции, было отмечено, что иммуноморфологическая картина фиксированного IgG в межклеточной связывающей субстанции эпидермиса у разных больных индивидуальна. Независимо от формы и стадии аутоиммунной пузырчатки фиксация IgG может иметь вид «сеточки» (тонкая или толстая), вид «пунктира», вид «гранул». Но, как правило, имеется сочетание (комбинации) различных выше указанных видов. Наиболее часто (66,7%) выявлялась иммуноморфологическая картина фиксированного IgG в межклеточной связывающей субстанции эпидермиса в виде тонкой «сеточки». Картина фиксированного IgG в виде сочетания тонкой «сеточки» и «гранул» наблюдалась в 8,8% случаях, в виде сочетания тонкой «сеточки» и «пунктира» - в 10,5% случаях, в виде «пунктира» - в 5,3% случаях, по 3,5% случая - в виде только «гранул», в виде сочетания «пунктира» и «гранул», а в 1,7% случае - в виде толстой «сеточки».
Характер фиксации IgG связан с участием различных антигенов-мишеней для аутоантител и их особым расположением в десмосоме. Под действием различных патогенетических факторов мишенью для аутоантител могут быть одна или несколько молекул адгезии и гликопротеины, входящие в состав десмосомы. Вовлечение в патологический процесс нескольких мишеней приводит не только к отличным друг от друга иммуноморфологиче-ским картинам характера фиксации IgG, но и к особенностям течения болезни. Так, при сопоставлении иммуноморфологической картины фиксации IgG в межклеточных пространствах эпидермиса с особенностями течения пузырчатки, было выявлено, что благоприятное течение заболевания, при котором достигается положительный клинический эффект только препаратами глюкокортикостероидного ряда, сопровождается фиксацией IgG в виде тонкой «сеточки» в 76,1% случаев, «пунктира» - 6,5%, сочетания тонкой «сеточки» и «гранул» - 4,3%, сочетания тонкой «сеточки» и «пунктира» - 8,7%, одинаково по частоте - по 2,2% случаев встречается фиксация иммунных комплексов в виде только толстой «сеточки» и в виде сочетания «гранул» и «пунктира». Торпидное течение заболевания сопровождается фиксацией IgG сочетанием тонкой «сеточки» и «гранул» в 33,3%, с одинаковой частотой в виде только грубых «гранул» и сочетания тонкой «сеточки» и «пунктира» - в 22,2% случаев, реже в виде сочетания «гранул» и «пунктира», а в виде только тонкой «сеточки» - в 11,1% случаев. Обнаружена взаимосвязь характера тор-пидного течения с гранулярной фиксацией IgG в межклеточной связывающей субстанции эпидермиса на высоком уровне статистической значимости (X-squared = 21.3333 при р-0,001499).
2) Субклассовая характеристика циркулирующих специфических IgG-аутоантител и фиксированного IgG в межклеточной связывающей субстанции эпидермиса.
При сравнении полученных данных с помощью методов иммунофлюо-ресценции было отмечено, что в сыворотке крови IgGl-аутоантитела обнаруживались в 60,1% случаев. При этом при впервые выявленном заболевании циркулирующие IgGl-аутоантитела против антигенов межклеточной связывающей субстанции эпидермиса выявлялись в 75% случаев, в стадии обострения - в 57,1% случаев, в стадии клинической ремиссии - в 28,6% случаев. Выявление фиксированного IgGl в серийных криостатных срезах клинически интактных участков кожи больных прямым методом иммунофлюорес-ценции составило 64,7%. При этом при впервые выявленном заболевании фиксированный IgG данного субкласса был обнаружен в 92,8% случаях, при обострении патологического процесса - в 50% случаях, в стадии клинической ремиссии - в 12,5% случаев. В 26,3%) исследуемых случаев одновременно были выявлены как циркулирующие IgGl-аутоантитела к межклеточной связывающей субстанции многослойного плоского эпителия, так и фиксированный IgGl в срезах тканей в межклеточных пространствах эпидермиса, т.е. в той же локализации.
Специфические IgG2-ayToaHTHTefla были обнаружены у всех (100%) обследованных больных независимо от стадии патологического процесса. Фиксированный IgG2 в межклеточной связывающей субстанции эпидермиса был обнаружен в 19,6% случаев. При этом при впервые выявленном заболевании фиксированный IgG данного субкласса был выявлен в 27,6% случаях, при обострении патологического процесса - в 20% случаях, в стадии клинической ремиссии - ни у одного обследуемого пациента. В 14% исследуемых случаев одновременно были выявлены как циркулирующие IgG2-аутоантитела к межклеточной связывающей субстанции многослойного плоского эпителия, так и фиксированный IgG2 в срезах тканей в межклеточных пространствах эпидермиса.
