Содержание к диссертации
Введение- 5
Глава I. Обзор литературы 13
1.1. Общие проблемы этиологии и патогенеза аутоиммунных заболеваний 13
Аутоиммунитет и естественные аутоантитела 13
Аутоиммунные заболевания I . 19
1.1.2.1. Этиология аутоиммунных заболеваний 19
Генетические факторы риска 19
Окружающая и внутренняя среда как фактор риска 21
1.1.2.2. Патогенез аутоиммунных заболеваний 23
Т-клетки и клеточный иммунный ответ 24
В-клеткй и гуморальный иммунный ответ 26
1.2. Аутоиммунные буллезные дерматозы в свете современных представлений 28
Классификация аутоиммунных буллезных дерматозов 29
Аутоиммунная пузырчатка 30
1.2.2.1. Эпидемиология, этиология аутоиммунной пузырчатки и ее ассоциация
с другими заболеваниями 31
1.2.2.2. Иммунопатология аутоиммунной пузырчатки 33
Аутоантитела при аутоиммунной пузырчатке 33
Система комплемента и его роль в акантолизе 36
Антигены-мишени для аутоантител при аутоиммунной пузырчатке 37
1.2.2.2.3.1. Ассоциация антигенов-мишеней (десмоглеинов) с клиническими вариантами
аутоиммунной пузырчатки и десмоглеин-компенсирующая теория 41
1.2.3. Буллезный пемфигоид 44
1.2.3.1. Эпидемиология, этиология буллезного пемфигоида и его ассоциация -
с другими системными заболеваниями 44
1.2.3.2. Иммунопатология буллезного пемфигоида 46
Аутоантитела при буллезном пемфигоиде .....46
Антигены-мишени при буллезном пемфигоиде 47
Линейный lgA-зависимый буллезный дерматоз 49
Эпидемиология, этиология линейного ІдА-зависимого буллезного дерматоза
и его ассоциация с другими системными заболеваниями 50
1.2.5.1. Иммунопатология линейного ІдА-зависимого буллезного дерматоза 52
Аутоантитела при линейном ІдА-зависимом буллезном дерматозе 52
Антигены-мишени при линейном ІдА-зависимом буллезном дерматозе 53
12.6. Приобретенный буллезный эпидермолиз 55
1.2.6.1. Эпидемиология, этиология приобретенного буллезного эпидермолиза
и его ассоциация с другими системными заболеваниями 57
1.2.6.2. Иммунопатология приобретенного буллезного эпидермолиза 59
1.2.6.2:1. Аутоантитела при приобретенном буллезном эпидермолизе 59
1.2.6.2.2. Антигены-мишени при приобретенном буллезном эпидермолизе 60
Заключение 63
Глава II. Материалы и методы исследования 65
2.1. Материалы исследования: 65
2.1.1. Первичная обработка биопсийного материала 66
2.2. Методы исследования 66
Метод определения симптома Никольского и оценка его чувствительности, специфичности и прогностической ценности для постановки клинического диагноза 70
Метод выявления фиксированных антител (иммуноглобулинов)
и полных иммунных комплексов .' 71
Метод выявления циркулирующих аутоантител 72
Выявление кадгеринового комплекса
(Е-кадгерин, N-кадгерин, V-кадгерин, R-кадгерин и Т-кадгерин) 73
Выявление десмосомального протеина десмоплакина изоформы 1 74
Выявление белка цитоскелета - цитокератина 5 75
Выявление коллагена IV типа базальной мембраны эпителия и сосудов кожи...- 75
Выявление белкового комплекса lamina densa базальной мембраны эпидермиса 76
Выявление экспрессии антигенов главного комплекса гистосовместимости
(HLA) I и II классов 77
Микрофотографирование 78
Статистическая обработка 78
Глава III. Общая клинико-морфологическая характеристика
аутоиммунных буллезных дерматозов 80
Аутоиммунная пузырчатка : 86
Буллезный пемфигоид 104
Линейный lgA-зависимый буллезный дерматоз 117
3.4. Приобретенный буллезный эпидермолиз 122
3.5. Симптом Никольского и его диагностическое значение
в клинике аутоиммунных буллезных дерматозов 133
Глава IV. Особенности иммунологических и иммуноморфологических
признаков аутоиммунных буллезных дерматозов в связи с наличием
циркулирующих аутоантител и фиксированных иммунных комплексов: 138
4.1. Циркулирующие аутоантитела при аутоиммунных буллезных дерматозах 139
Циркулирующие аутоантитела при аутоиммунной пузырчатке 140
Циркулирующие аутоантитела при буллезном пемфигоиде 142
Циркулирующие аутоантитела при линейном ІдА-зависимом буллезном дерматозе 143
Циркулирующие аутоантитела при приобретенном буллезном эпидермолизе 143
4.2. Фиксированные иммуноглобулины в биоптатах кожи больных
аутоиммунными буллезными дерматозами: 150
Фиксированные иммуноглобулины в биоптатах кожи больных аутоиммунной пузырчаткой. 151
Фиксированные иммуноглобулины в биоптатах кожи больных булпезным пемфигоидом...156
Фиксированные иммуноглобулины в биоптатах кожи больных
линейным lgA-зависимым булпезным дерматозом ! 159
4.2.4. Фиксированные иммуноглобулины в биоптатах кожи больных
приобретенным булпезным эпидермолизом.:. 160
4.3. Ранние компоненты комплемента в структурах эпидермиса
при аутоиммунных буллезных дерматозах 169
С4 компонент комплемента 170
C4d компонент комплемента '. ' 173
СЗ компонент комплемента : 175
4.4. Фибрин как маркер цитотоксического действия иммунных комплексов
при аутоиммунных буллезных дерматозах 184
4.5. Обсуждение 187
Глава V. Мониторинг экспрессии некоторых белков кожи
при аутоиммунных буллезных дерматозах 193
5.1. Антигены системы межклеточного соединения (десмосом)
ицитоскелета кератиноцитов 193
5.1.1. Определение экспрессии молекул клеточной адгезии кадгеринового
комплекса (Е-кадгерин, N-кадгерин, V-кадгерин, R-кадгерин, Т-кадгерин) 194
Определение экспрессии десмосомального протеина, десмоплакина 1 209
Определение характера синтеза и экспрессии цитокератина 5 в клетках
базального слоя эпидермиса .....222
5.2. Некоторые антигены базальной мембраны эпидермиса 231
Выявление коллагена IV типа базальной мембраны эпидермиса и сосудов кожи 231
Выявление белкового комплекса основного вещества lamina densa
базальной мембраны эпидермиса 240
5.3. Главный комплекс гистосовместимости и иммунная система кожи 247
Определение экспрессии антигенов главного комплекса гистосовместимости класса 1 247
Клетки Лангерганса и определение экспрессии антигенов
главного комплекса гистосовместимости класса II (HLA-DR) 256
5.4. Белки кожи при аутоиммунных буллезных дерматозах и их использование
в создании базы для молекулярно-биологических методов исследования в дерматологии 270
Заключение 272
Выводы 288
Список литературы 291
Приложение 323
4 Перечень сокращений, используемых в работе
ДКМП - дилатационная кардиомиопатия
МкАТ - моноклональные антитела
ВР180 - антиген буллезного пемфигоида молекулярной массой 180 кД
(коллаген XVII типа) ВР230 — антиген буллезного пемфигоида молекулярной массой 230 кД
С4, C4d, СЗ - ранние компоненты комплемента
DAB - 3,3 - диаминобензидин
LABD97 - антиген линейного lgA-за виси мого буллезного дерматоза
молекулярной массой 97 кД LAD-1 - антиген линейного ІдА-зависимого буллезного дерматоза
молекулярной массой 120 кД HLA - главный комплекс гистосовместимости
lg - иммуноглобулины
IgA, IgM, IgG - основные классы иммуноглобулинов
PBS - физиологический раствор с фосфатным буфером
Th1 - Т-хелперы 1 типа
Тп2 - Т-хелперы 2 типа
Введение к работе
Актуальность проблемы. За последние три-четыре десятилетия накоплены фундаментальные знания в области клиники и иммунопатологии аутоиммунных буллезных дерматозов. Несмотря на достигнутые успехи, изучение патогенеза этих дерматозов на уровне молекулярно-биологических исследований остается одной из важных проблем в дерматологии и в настоящее время. Это связано с необходимостью преодоления* развития таких тяжких, порой угрожающих жизни, заболеваний как аутоиммунная пузырчатка, буллезный пемфигоид, линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз и приобретенный буллезный эпидермолиз.
Современная медицина обладает целым рядом* эффективных средств, позволяющих успешно подавлять развитие иммунопатологического-процесса при аутоиммунных состояниях [22, 71, 114, 248, 249, 456, 547]. Однакове же средства обладают нередко побочным действием, нарушающим функцию ряда физиологических систем организма. К ним, в частности, относятся- корти-костероиды, азатиоприн, метотрексат, циклоспорин. Принцип лечения'аутоиммунных заболеваний, при которых одним из основных патогенетических факторов являются аутоантитела, направленные к антигенам тканевых структур, сходен для многих аутоиммунных заболеваний. Однако разные формы патологии, включая аутоиммунные буллезные дерматозы, требуют различные схемы лечения, в частности разные дозировки, назначаемых препаратов. Учитывая возможные осложнения, необходимо подбирать оптимальные дозы, позволяющие достигать терапевтического эффекта, не нанося вред организму больного. Оптимальные дозы препаратов при таких заболеваниях как истинная пузырчатка, буллезный пемфигоид, приобретенный буллезный эпидермолиз и линейный IgA-зависимый буллезный- дерматоз, также как и схемы их лечения, значительно отличаются друг от друга, в связи с чем необходима тщательная дифференциальная диагностика [69, 71, 96, 111, 247, 300, 456].
Нередко клиническое сходство буллезных дерматозов, а порой и атипичные их проявления на ранних этапах развития патологического процесса с сомнительными результатами феномена Никольского не позволяют клиницисту у постели больного поставить с уверенностью клинический диагноз. Существующие данные свидетельствуют о том, что применение гистологических и ряда иммунологических методов, в том числе метода с использованием меченых антител, в дополнение к клиническому обследованию, во многих случаях позволяет уточнить диагноз [15, 19, 118, 119, 641, 866]. Полученные нами результаты подтверждают эти наблюдения [13]. Однако и эти методы имеют свои ограничения. Так, гистологическое исследование на основании определения уровня образования пузыря способствует диагностике и дифференциальной диагностике аутоиммунных t буллезных дерматозов только между различными их группами, такими как группа пузырчатки и группа буллезных дерматозов с поражением дермо-эпидермального соединения. Но затрудняет провести дифференциальную диагностику среди буллезных дерматозов одной группы, таких как буллезный пемфигоид, линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз и приобретенный буллезный эпидермо-лиз [355]. Сложности могут возникнуть и при использовании методов прямой и непрямой иммунофлюоресценции [45, 52, 53, 63, 302, 643]. Это требует дополнительных методов для диагностики.
Разнообразие клинических проявлений аутоиммунных буллезных дерматозов и поиск новых методов терапии заставляет специалистов продолжать исследования по изучению механизмов и факторов, способствующих как проявлению в латентной форме заболевания, так и развитию этих буллезных дерматозов de novo. Исследования по изучению молекулярно-биологической структуры кожи (система межклеточного и дермо-эпидермального соединений, белки поверхности кератиноцитов и десмосом) позволяют более полно выяснить состояние различных белковых структур и клеточных элементов кожи при различных аутоиммунных буллезных дерматозах. Например, известно, что молекулы адгезии вовлечены во все физиологические процессы,
обеспечивая функциональную целостность кожи. В кожной патологии некоторые молекулы адгезии выступают в качестве мишеней для аутоиммунных антител, например, при пузырчатке, другие страдают опосредованно - как при буллезном пемфигоиде [405; 532]. До сих пор дискутируется роль системы комплемента в патогенезе аутоиммунных буллезных дерматозов^ [584, 688,931].
Принимая во внимание возможность участия самых различных молеку-лярно-биологических механизмов в развитии аутоиммунных буллезных дерматозов, эта проблема нуждается в дальнейшем; изучении и развитии;. При этом целесообразно изучение клинико-морфологических особенностей' аутоиммунных буллезных дерматозов конкретно больных дерматозами в Московской области; В* процессе исследования? клинико-патогенетических особенностей буллезных дерматозов следует изучить: влияние величины, титров циркулирующих» аутоантител и степени интенсивности фиксациий иммунных комплексові на течение. аутоиммунных буллезных дерматозов; участие ран--них компонентов*комплемента в;патогенезе: аутоиммунных буллезных дерматозов; степень экспрессии некоторых антигенов десмосом и цитоскелета цитокератинов как показателя характера поражения эпидермиса. Поскольку предметом исследований является патология, связанная с нарушениями в иммунной системе (аутоиммунные процессы) необходима оценка экспрессии антигенов главного комплекса гистосовместимости (HLA I и П классов) на клетках тканей кожи, как одного из показателей участия антигенов гистосовместимости в развитии изучаемой патологии. Использование иммуногисто-химических методов с целью изучения некоторых сторон патогенеза аутоиммунных буллезных дерматозов и антигенной структуры эпидермиса в норме и при патологии будет способствовать разработке дополнительных методов их диагностики и тактике ведения больных.
Цель настоящей работы: изучение клинико-морфологических и имт мунологическйх особенностей аутоиммунных буллезных дерматозов на приг
8 мере больных Московской области и совершенствование способа их ранней диагностики и лечения.*
В соответствии с указанной целью были поставлены следующие задачи исследования:
Изучить клинико-морфологические особенности аутоиммунных бул-лезньтх дерматозов, включая аутоиммунную пузырчатку, буллезный пемфи-гоид, линейный IgA-зависимый^ буллезный дерматоз и приобретенный буллезный эпидермолиз на современном этапе.
Научно обосновать, сущность возникновения симптома Никольского с точки зрения иммунопатологии и оценить его прогностическую ценность при дифференциальной диагностике аутоиммунных буллезных дерматозов.*
Изучить роль и влияние циркулирующих аутоантител И'фиксированных иммунных комплексов на течение аутоиммунных буллезных дерматозов.
Исследовать участие ранних компонентов комплемента (С4, C4d, СЗ) в патогенезе аутоиммунных буллезных дерматозов.
Определить степень экспрессии некоторых антигенов десмосом (дес-мосомальный протеин, кадгериновый комплекс) и цитоскелета (цитокера-тин 5) в биоптатах кожи больных аутоиммунными буллезными дерматозами.
Изучить экспрессию некоторых антигенов базальной мембраны эпидермиса (коллаген IV типа, белковый комплекс основного вещества lamina densa) в биоптатах кожи больных аутоиммунными буллезными дерматозами.
Провести оценку экспрессии антигенов главного комплекса гистосов-местимости (HLA I и П классов) в биоптатах кожи больных аутоиммунными буллезными дерматозами.
Разработать на основе полученной молекулярно-биологической характеристики состояния различных структур тканей кожи схему детального иммуноморфологического анализа биопсии кожи больных аутоиммунными буллезными* дерматозами с использованием моноклональных и поликло-нальных антител к белкам тканевых структур (кадгерины, десмосомальный
...''.''.. 9
протеин десмоплакиц, цитокератин 5, коллаген IV типа, протеиновый комплекс основного вещества базальной мембраны lamina densa, антигенов HLA I класса) и клеточным элементам (HLA-DR антигены).
9. Разработать алгоритм ранней диагностики, и контроля эффективности лечения аутоиммунных буллезных дерматозов:
Научная новизна исследования:
Разработан алгоритм включения методов для дифференциальной диагностики: клинические проявления с определением симптома Никольского; цитологический метод с выявлением акантолитических клеток (клетки Тцан-ка); гистологическийшетод с определением уровня образования пузыря; иммунологический и иммуногистохимический. методы исследования: с опреде- ;. лением наличия:в сыворотке крови- больных аутоантител различной?специфичности и фиксированных иммунных комплексов в тканях; определение состояния ряда белковых компонентов Вїтканях.
Для дополнительной характеристики; иммунопатологического процесса1 при аутоиммунных булл езных дерматозах использован молекулярнр-биологический подход с применением набора антител к антигенам тканевых структур кожи.
Впервые детально изучена значимость вовлечения циркулирующих аутоантител, фиксированных иммунных комплексов и ранних компонентов комплемента и их взаимосвязь с особенностями клинического течения ряда-аутоиммунных буллезных дерматозов:
Впервые проведена оценка клинической специфичности и патогенеза симптома Никольского у больных, страдающих различными аутоиммунными буллезными дерматозами, включая аутоиммунную пузырчатку, буллезный пемфигоид, линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз^ приобретенный буллезный эпидермолиз.
Научно-практическая значимость:
Предлагаемый комплекс иммунологических и иммуноморфологических исследований для получения дополнительных сведений о патологических
10 процессах, происходящих при аутоиммунных буллезных дерматозах, с целью установления и/или уточнения диагноза будет способствовать назначению адекватной терапии (с учетом патогенетических механизмов) и оценки, степени ее эффективности.
Положения, выносимые на защиту:
На современном этапе в регионе Московской области выявлена следующая закономерность распространения аутоиммунных буллезных дерматозов. Среди 267-больных аутоиммунными буллезными дерматозами 61,4% составили больные, страдающие аутоиммунной пузырчаткой, 33,3% - бул-лезным пемфигоидом, 3,4% - приобретенным буллезным эпидермолизом и 1,9% - линейным IgA-зависимым буллезным дерматозом* При этом у 6% больных из 267 выявлен аутоиммунный буллезный дерматоз, протекающий на фоне неоплазии (паранеопластическая пузырчатка - 62,5%, буллезный пемфигоид - 25% и приобретенный'буллезный эгшдермолиз - 12,5%).
При аутоиммунных буллезных дерматозах патогенетическую роль могут играть аутоантитела, относящиеся ^иммуноглобулинам, классов G и/или А, и иммунные комплексы в растворимой и нерастворимой формах. При этом мишенями могут быть не только специфические антигены, характерные для определенной группы буллезного дерматоза, но и антигены ряда других структур органов и тканей. Наличие такого широкого спектра антител к различным антигенам-мишеням объясняет тяжесть и разнообразие клинических проявлений буллезного дерматоза, в частности при паранеопластической пузырчатке.
Установлен факт участия ранних компонентов комплемента как в местах локализации антител, так и вне зоны обнаружения антигенов-мишеней. При этом выявление C4d (наиболее стойкого компонента комплемента) может служить дополнительным маркером развития гуморального ответа при оценке патологического процесса.
Наличие симптома Никольского (механическая отслойка эпидермиса) как одного из первых «инструментов» в диагностике (при аутоиммунной пу-
зырчатке в 71,9% случаев, буллезном пемфигоиде в 3,4%, приобретенном буллезном эпидермолизе в 66,7%) обусловлено вовлечением в патологический процесс системы десмосомального аппарата.
5. Получена дополнительная молекулярно-биологическая характеристика изменений в коже при аутоиммунных буллезных дерматозах с помощью иммуногистохимических методов с использованием моноклональных и по-ликлональных антител к ряду антигенов кожи (кадгериновый комплекс, дес-мосомальный протеин, цитокератин 5, коллаген IV типа, белковый комплекс основного вещества lamina densa, антигены главного комплекса гистосовме-стимости). Полученные сведения позволяют оценивать глубину происходящих иммунопатологических процессов, эффективность проводимой терапии, а в ряде случаев получить дополнительный способ дифференциальной диагностики аутоиммунных буллезных дерматозов.
Апробация работы: материалы диссертации доложены на VII Российском съезде дерматовенерологов (Россия, Казань, 1996 г.), VIII, IX и X Всероссийском съезде дерматовенерологов (Россия, Москва, 2001, 2005-и 2008 г.г.), научно-практической конференции, посвященной 75-летию ЦНИКВИ (Россия, Москва, 1996 г.), научно-практической конференции «Актуальные проблемы дерматоонкологии. Новые лекарственные препараты в практике дерматовенерологии» (Россия, Москва, 2002 г.), IV международной конференции «Экспериментальная и клиническая медицина» (Грузия, Тбилиси, 2002 г.), Первом Российском конгрессе дерматовенерологов (Россия, Санкт-Петербург, 2003 г.), конференции, посвященной памяти Машкиллейсона Асафа Львовича (Россия, Москва, 2004 и 2008 г.г.), научно-практической конференции «Пролиферативные заболевания кожи» (Россия, Москва, 2006 г.), VI-VII-VIII научно-практической конференции «Социально-значимые заболевания* в дерматовенерологии. Диагностика, терапия, профилактика» (Россия, Москва, 2006, 2007 и 2008 г.г.), ХШ-XIV-XV Российском нациаль-ном конгрессе «Человека и лекарство» (Россия, Москва, 2006, 2007 и 2008 г.г.), научно-практических конференциях «Актуальные вопросы дерматове-
12 нерологии и дерматоонкологии» (Россия, Москва, 2007 и 2008 г.г.), П Форуме Национального Альянса дерматологов и косметологов (Россия, Ростов-на-Дону, 2008 г.).
Объем и структура диссертации.
Диссертация изложена на 357 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы и приложения. Работа иллюстрирована 11 таблицами и 85 рисунками, заключающими в себе 231 микрофотографию. Библиографический указатель включает 125 отечественных и 831 иностранных источников.
![Современные аспекты клиники, диагностики и лечения бактериального вагиноза у женщин репродуктивного возраста [Электронный ресурс]](/i/i/4469/182026.png "Современные аспекты клиники, диагностики и лечения бактериального вагиноза у женщин репродуктивного возраста [Электронный ресурс] Аксенова Ольга Александровна")
