Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Chlamydia trachomatis и вызываемая ими патология (обзор литературы) 12
1.1. Таксономия и биология Chlamydia trachomatis 12
1.2. Заболевания урогенитального тракта, вызываемые хламидиями 17
1.3. Современные методы микробиологической диагностики урогени тального хламидиоза 27
1.4. Лечение хламидийной инфекции и контроль излеченности 40
1.5. Антибиотикорезистентность Chlamydia trachomatis и факторы, ее вызывающие 45
Глава 2. Материалы и методы исследования 49
2.1. Дизайн исследования 49
2.2. Характеристика антибактериальных препаратов (джозамицин, докси-циклин) 52
2.3. Клинические материалы для исследования 53
2.4. Микробиологическая диагностика хламидийной инфекции 54
2.4.1. Оценка воспалительной реакции и выявление сопутствующих микроорганизмов *
2.4.1.1. Прямая (bed side) микроскопия 54
2.4.1.2. Микроскопия окрашенных мазков 55
2.4.2. Культуральный метод 56
2.4.2.1. Определение чувствительности хламидий к антибиотикам 57
2.4.3. Полимеразная цепная реакция 58
2.4.4. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени
2.4.5. NASBA в реальном времени 59
2.5. Оценка диагностических характеристик метода NASBA в реальном времени
2.6.Статистические методы 61
Результаты собственных исследований
Глава 3. Оценка диагностической эффективности'метода nasba в реальном времени
Глава 4. Эффективность использования антибактериальных препаратов в лечении урогенитальной хламидийной инфекции 72
4.1. Характеристика обследованных групп 72
4.2. Динамика элиминации хламидий в ходе лечения урогенитальной хла-мидийной инфекции доксициклином и джозамицином 86
4.3. Анализ неудач терапии урогенитальной хламидийной инфекции 100
Глава 5. Обсуждение результатов исследования. 109
Выводы 120
Практические рекомендации 122
Список литературы
- Современные методы микробиологической диагностики урогени тального хламидиоза
- Клинические материалы для исследования
- Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени
- Динамика элиминации хламидий в ходе лечения урогенитальной хла-мидийной инфекции доксициклином и джозамицином
Введение к работе
Важной проблемой является качественная лабораторная диагностика урогенитального хламидиоза, так как от нее зависит успех терапии этого заболевания. Микробиологическая диагностика урогенитального хламидиоза основывается на культуральных методах, т.е. выделении возбудителя (Chlamydia trachomatis) в культуре клеток, обнаружении антигенов или хламидийной ДНК в клинической пробе. Возможно также выявление в сыворотке крови специфических антител к антигенам возбудителя. «Золотым стандартом» диагностики урогенитального хламидиоза на сегодняшний день является сочетание культурального и молекулярно-биологического (ГЩР) методов. Актуальной проблемой является разработка новых методов диагностики урогенитальной хламидийной инфекции, способных выявить репродуктивную фазу возбудителя (Лобзин Ю.В., 2003).
В настоящее время обсуждается проблема персистенц'ии данного возбудителя. Так как не исключена возможность реинфицирования и рецидива инфекции, поэтому необходимо проводить мониторинг терапии пациентов с установленным диагнозом хламидиоза в течение нескольких месяцев после лечения (Шипицына Е.В., 2003).
Для лечения урогенитального хламидиоза традиционно используются тетрациклины, макролиды, азалиды и фторхинолоны (Кубанова А.А., 2002). До сих пор не отработаны сроки контрольных исследований после проведенной антибактериальной терапии Не доказана эффективность применения определенных методов диагностики или их сочетаний при проведении контроля излеченности. Известно, что ДНК возбудителя, определяемая методом ПЦР, в течение длительного времени может находиться в организме после гибели хламидий. Культуральный метод, являющийся высоко специфичным, имеет пределы чувствительности (40-60%) и 'іспользуется далеко не во всех лабораториях (Шалепо К.В., 2003).
Поэтому поиск новых методов, позволяющих выявить только жизнеспособные возбудители после лечения на основании обнаружения рибосомной или матричной РНК, представляется высоко актуальным.
К числу таких методов относится основанная на транскрипции амплификация нуклеиновых кислот - NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification). В основе метода NASBA лежит обнаружение специфического фрагмента нуклеиновой кислоты с помощью двух специфических'праймеров и трех ферментов: обратной транскриптазы вируса миелобластоза птиц, РНКазы Н Escherichia coli и РНК-полимеразы фага Т7. Метод NASBA обладает уникальной способностью избирательно амплифицировать специфическую РНК в присутствии идентичной последовательности ДНК, что определяет основные области его применения: диагностика инфекций, вызванных РНК-содержащими вирусами, изучение экспрессии бактериальных и вирусных генов, диагностика бактериальных инфекций, основанная на выявлении рибосомной РНК. В качестве метода для контроля излеченности метод NASBA еще не применялся.
Цель работы. Оценка динамики элиминации хламидий на фоне и после проведения специфической антибактериальной терапии урогенитальной хламидийной инфекции.
Задачи исследования. *
-
Определить диагностическую чувствительность, специфичность, прогностическую значимость положительного и отрицательного результатов метода NASBA в реальном времени для диагностики урогенитальной хламидийной инфекции в сравнении с культуральным методом и методом ПЦР.
-
Оценить скорость элиминации хламидий на фоне лечения урогенитальной хламидийной инфекции (2, 5, 7 и 10 дни) с применением джозамицина и доксициклина и провести мониторинг контроля излеченности после антибактериальной терапии урогенитального хламидиоза (7, 14, 21 дни, 1, 3 и б месяцы) с использованием культурального метода, метода ПЦР и NASBA.
-
Определить целесообразность использования метода NASBA в режиме реального времени для контроля излеченности урогенитальной хламидийной инфекции.
-
Изучить связь клинических проявлений урогенитальной хламидийной инфекции со временем и полнотой элиминации Chlamydia trachomatis.
-
Выявить связь между количеством возбудителя и выраженностью клинической картины урогенитального хламидиоза, а также степенью элиминации возбудителя.
Научная новизна.
Определена диагностическая чувствительность, специфичность, прогностическая значимость положительного и отрицательного результата метода NASBA в реальном времени для выявления хламидий в сравнении с культуральным методом и методом ПЦР.
Проведена оценка скорости элиминации хламидий на фоне лечения урогенитальной хламидийной инфекции и после окончания антибактериальной
терапии с одновременным использованием культурального и молекулярно-биологических (ПЦР и NASBA) методов. Научно обоснована продолжительность назначения антибактериальных препаратов для лечения урогенитального хламидиоза.
Установлено, что скорость элиминации хламидий зависит от клинических проявлений инфекции (наличия цервицита у женщин и уретрита у мужчин) и от концентрации хламидий до лечения.
Научно-практическая значимость.
Обосновано применение метода NASBA в реальном времерч в качестве подтверждающего теста для диагностики урогенитальнои хламидийной инфекции и контроля излеченности.
Проведен сравнительный анализ эффективности действия джозамицина и доксициклина при лечении урогенитального хламидиоза. Элиминация Chlamydia trachomatis из организма на фоне терапии джозамицином происходит к 10-му дню, доксициклином - к 7-му дню лечения. Обусловлена продолжительность назначения антибактериальных препаратов при лечении хламидийной инфекции в течение 10 дней.
Установлены сроки проведения контрольных исследований после терапии урогенитального хламидиоза при использовании культурального метода или ПЦР через 3-4 недели, с применением метода NASBA - через 1- 2 недели.
Личное участие автора в получении результатов.
Автором самостоятельно проводился отбор пациентов для лечения, назначались антибактериальные препараты, проводился мониторинг терапии хламидийной инфекции, брались материалы для лабораторного исследования, осуществлялось участие в микробиологических исследованиях. Метод NASBA в реальном времени и анализ его диагностических параметров выполнялнен автором лично. Автором самостоятельно проведен анализ полученных данных и их статистическая обработка.
Положения, выносимые на защиту.
-
Аналитическая чувствительность, специфичность, прогностическая значимость положительного и отрицательного результатов метода NASBA в реальном времени для диагностики урогенитальнои хламидийной инфекции составляет 100%. При этом чувствительность, специфичность, прогностическая значимость метода ПЦР равна также 100%, культурального метода, соответственно, 72,4%, 100%, 95,3%.
-
Элиминация хламидий на фоне терапии урогенитальнои хламидийной инфекции при использовании доксициклина и джозамицина, определяемая культуральным методом, происходит на 5 день терапии обоими антибиотиками у всех пациентов. ДНК хламидий элиминируется постепенно, исчезая к 10 дню лечения; в 3,6% случаев сохраняется до 3 недель после лечения. РНК хламидий исчезает на 7 терапии доксициклином и 10 день терапии джозамицином у всех леченых пациентов.
-
Клинические проявления урогенитальнои хламидийной инфекции в виде цервицита у женщин и уретрита у мужчин в сочетании с высокой
концентрацией хламидий в" клиническом материале до лечения требуют назначения более высоких доз антибактериальных препаратов, чем при бессимптомном течении инфекции, когда концентрация возбудителя наименьшая.
Реализация и внедрение результатов работы.
Основные положения, разработанные в процессе исследования, внедрены в учебную, научно-исследовательскую и практическую работу ГУ НИИАГ им. Д.О. Отга РАМН, кафедры дерматовенерологии с клиникой СП6ТМУ им. акад. И.П. Павлова, медицинского центра «Ювента».
Апробация результатов исследования.
Результаты работы доложены на 18 Международном конгрессе по
инфекциям, передаваемым половым путем, «IUSTI Europe»' (Будапешт,
Венгрия, 2002 г), Первом Евро-Ачиатском конгрессе «Событие года в
акушерстве и гинекологии» (Санкт-Петербург, 2004 г), 5 Международном
конгрессе по хламидийным инфекциям (Будапешт, Венгрия, 2004 г), 11
Международном симпозиуме по хламидийным инфекциям человека (Онтарио,
Канада, 2006 г), Международной конференции «Репродуктивно значимые
инфекции: Европейские стандарты диагностики, терапии и профилактики»
(Санкт-Петербург, 2006 г), Первом Сибирском конгрессе акушеров-
гинекологов и дерматовенерологов «Актуальные вопросы акушерства и
гинекологии и дерматовенерологию) (Новосибирск, 2006 г), Всероссийском
форуме «Мать и дитя» (Казань, 2007 г), XXXVTI, XXXVIII научно-
практических конференциях дерматовенерологов и врачей смежных
специальностей Санкт-Петербурга «Актуальные проблемы
дерматовенерологии» (Санкт-Петербург, 2002, 2003 гг), Российской научно-практической конференции дерматовенерологов «Санкт-Петербургские дерматологические чтения» (Санкт-Петербург, 2005 г).
По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах («Журнал акушерства и женских болезней» и «Вестник дерматологии и венерологии»).
Структура и объем диссертации.
Современные методы микробиологической диагностики урогени тального хламидиоза
Хламидий - неподвижные, грамотрицательные микроорганизмы прокариот-ной природы, размером от 0,2 до 0,4 мкм, характеризующиеся облигатным внутриклеточным паразитизмом (Barbour A.G., 1982). Облигатность паразитизма обусловлена зависимостью репродукции хламидий от клетки хозяина. Обладая собственной метаболической системой, хламидий, тем не менее, не могут синтезировать АТФ, и поэтому они энергетически зависимы от клетки хозяина. Это и определяет их биологическое положение в системе микроорганизмов.
Развитие цитоплазматических включений, синтез ДНК, РНК и белков, изменение антигенных и инфекционных свойств были выявлены в процессе исследований, включая электронную микроскопию. Жизненный цикл хламидий может быть разделен на две фазы.
Хламидий растут и размножаются в виде микроколоний в ьщтоплазматиче-ском включении - пузырьке, оболочка которого возникает путем впячивания клеточной мембраны клетки хозяина. Клетка может захватывать не одно, а несколько элементарных телец, в результате чего в ее цитоплазме может оказаться несколько микроколоний хламидий. В зрелых цитоплазматических включениях одновременно наблюдаются все формы микроорганизма.
Основными морфологическими формами хламидий являются элементарные (ЭТ) и ретикулярные (РТ) тельца (Wandy L., 1994). Инфекционные формы хламидий представлены элементарными тельцами. Это зрелые формы возбудителя, обладающие низкой биохимической активностью - отнощение РНК/ДНК меньше 1. ЭТ имеют вид сферических микроорганизмов диаметром 300-400 нм, покрытых двумя трехслойными (унитарными) мембранами толщиной 8 нм. Эти мембраны морфологически идентичны мембранам клеточной стенки грамотрица 14 тельных бактерий. Белковыми компонентами наружной мембраны хламидий являются белки: ompl, omp2 и отрЗ (отp - outer membrane protein - белок наружной мембраны). Эти богатые цистеином белки обеспечивают ригидность клеточной стенки хламидий благодаря наличию множественных дисульфидных поперечных связей между этими белками. Белок ompl или МОМР (главный белок наружной мембраны) составляет около 60% молекулярной массы всех мембранных белков. В зависимости от принадлежности к серотипу его молекулярный вес колеблется в пределах от 38 до 42 Ша (Моггё SA., 1999). Кроме того, показано, что МОМР может функционировать как адгезии (Su Н., Watkins N.G, 1990). Ретикулярные тельца являются неинфекционными (вегетативными) формами хламидий и образуются в процессе размножения микроорганизмов в клетке хозяина. Это предшественники нового поколения элементарных телец, РТ обладают выраженной метаболической активностью (отношение РНК/ДНК - 3/4), и представляют собой овальные или округлые образования размером 400-600x800-1000 нм. Ретикулярные тельца окружены двумя трехслойными мембранами, морфологически соответствующими мембране клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Толщина каждой мембраны равна 8 нм. Ригидный слой клеточной стенки у ретикулярных телец отсутствует, поэтому на этой стадии развития хламидий проявляют чувствительность к воздействию физико-химических факторов и антибиотиков. Цитоплазма ретикулярных телец отличается от элементарных телец меньшей плотностью. Полный цикл развития занимает 48-72 часа (Попов В.Л., 1982).
Инфекционные ЭТ взаимодействуют с рецепторами гепарин-сульфата на поверхности эпителиальных клеток хозяина и, провоцируя эндоцитоз, проникают в них с образованием фагосомы (Thomas В J, 1984). В мембрану фагосомы встраиваются секретированные микроорганизмом белки IncA, IncD, IncE, IncF, IncG, которые, по предположению, препятствуют слиянию фагосом с лизосомами (Наск-stadt Т,4). В течение первой фазы, длящейся от 7 до 10 часов после инфицирования, ЭТ проникают в цитоплазму клетки недалеко от аппарата Гольджи и начина 15 ЮТ формировать мелкие цитоплазматические включения. ЭТ в течение 2-8 часов превращаются в РТ: ослабляются дисульфидные связи между МОМР и другими внешними белками мембраны, что приводит к повышению проницаемости мембраны клетки микроорганизма, увеличению транспорта питательных веществ и возрастанию метаболической активности (Beatty WL, 1994). Кроме изменения клеточной поверхности происходит деконденсация хроматина хламидий, необходимая для активации процессов транскрипции и трансляции. Через 2 часа после внедрения в клетку начинается экспрессия некоторых генов (гесА, rpoB rpoD, groEL и др.). При окраске акридиновым оранжевым (АО) ЭТ окрашиваются в красный цвет, что указывает на присутствие в них РІЖ. Синтез хламидийных антигенов начинается тогда, когда подавляется синтез ДНК клетки-хозяина.
В течение второй фазы (14-22 часа) в клетке наблюдаются в основном крупные РТ. Хламидийные РНК и белки синтезируются в этот период непрерывно. Синтез хламидийной ДНК, как показывает зеленовато-оранжевое свечение при окрашивании АО, начинается через 14 часов. РТ начинают трансформироваться в ЭТ: конденсируется хроматин, в оболочке появляются цистеин-богатые белки, обеспечивающие ее жесткость за счет дисульфидных связей (Moulder JW.,1991). После 20-22 часов вновь образовавшиеся ЭТ способны к заражению новых клеток хозяина. В течение третьей фазы (после 24-30 часов) в цитоплазматических включениях присутствуют в основном ЭТ. Синтез РНК и белков выражен в меньшей степени. Цитоплазматические включения окрашиваются в зеленый цвет при использовании АО что указывает на присутствие ДНК (Domeika М 1993).
Клинические материалы для исследования
Для оценки диагностической эффективности метода NASBA в реальном времени проводили скрининговое исследование клинических материалов, полученных от пациентов. Всего было обследовано 193 пациента - 156 женщин и 37 мужчин - в возрасте от 16 до 42 лет (средний возраст 22,8 года). Большинство па-циентов (145, или 75%) обратились к врачу с жалобами на зуд, выделения из половых органов, дизурию, вошли в первую группу исследования. Вторую группу составили остальные 48 человек, которые не имели жалоб: причинами их обращения к врачу служили выявление ИППП у партнера или желание обследоваться после перенесенной в прошлом урогенитальной инфекции. В первой группе была выделена подгруппа из 94 человек с диагнозом цервицита у женщин и уретрита у мужчин (65%). Диагноз цервицита ставили на основании клинических проявлений заболевания (слизисто-гнойные выделения из цервикального канала) и данных микроскопического исследования (более 10 полиморфноядерных лейкоцитов в поле зрения при просмотре более 5 полей и увеличении светового микроскопа ХІ00О). Женщин с цервицитом было 83 человека (53,1%). Диагноз уретрита у мужчин устанавливали на основании жалоб на выделения из уретры и/или данным микроскопического исследования (более 4 полиморфноядерных лейкоцитов в поле зрения при исследовании более 5 полей зрения светового микроскопа при увеличении ХІ000). Мужчин с уретритом было 11 (29,7%) человек. Соскобы эпителия цервикального канала у женщин и уретры у мужчин исследовали методами КК, ГЩР и NASBA: образец считали положительным в случае выделения хламидий в культуре клеток и/или выявления ДНК/РНК С. trachomatis обоими молекулярными методами. Урогенитальная хламидийная инфекция была диагностирована у 29 из 193 пациентов (15%): у 21 из них хламидии были обнаружены всеми тремя методами, тогда как 8 проб были отрицательными в культуре и положительными при проведении методо ПНР и NASBA (табл. 6).
Таким образом, чувствительность обоих молекулярных методов равнялась 100%, культурального - 72,4%. Прогностическая значимость отрицательных ре 67 зультатов для ПЦР и NASBA составила 100%, для ЮС - 95,3%. Специфичность, а также прогностическая значимость положительных результатов всех трех методов равнялась 100% (табл. 10). Прогностическая значимость отрицательного результата при использовании метода ПЦР и NASBA равна 100%, а КК - 95,3%.
Для оценки параметров эффективности метда NASBA для диагностики уро-генитальной хламидийной инфекции мы вычислили чувствительность, специфичность и прогностическую значимость в разных группах пациентов с разной распространенностью С. trachomatis.
Результаты тестирования в разных группах пациентов представлены в табл.11. Хламидии были обнаружены у 27 из 145 пациентов (18,6%) с симптомами урогенитальной инфекции. Из 94 пациентов с диагнозом цервицита/уретрита 25 (26,6%) были инфицированы хламидиями, тогда как среди пациентов с симптомами урогенитальной инфекции, но без цервицита/уретрита (п=51), хламидии были выявлены у двух пациентов (3,9%). У двух из 48 пациентов (4,2%), не имевших симптомов урогенитальной инфекции, также были обнаружены хламидии: оба пациента указали в анкете, что перенесли хламидийную инфекцию в прошлом и получали лечение азитромицином. Полученные результаты еще раз подчеркивают роль хламидийной инфекции в этиологии цервицита и уретрита. При наличии цервицита частота выявления хламидии составила 21 из 83 (25,3%), при наличии уретрита у мужчин - 4 из 11 (36,4%). Показатель распространенности хламидийной инфекции в целом среди пациентов с диагнозом цервицита/уретрита составил 26,6% (25 из 94), что в несколько раз выше частоты выявления хламидии у пациентов с симптомами урогенитальной инфекции, но без цервицита/уретрита (3,9%), а также у бессимптомных пациентов (4,2%). Таблица 11 Выявление Chlamydia trachomatis в разных группах пациентов
Сцервицитом/уретритом (п=94) Безцервицита/уретрита (п=51) КК 19(20,2%) 0 2 (4,2%) ПЦР/NASBA 25 (26,6%) 2 (3,9%) 2 (4,2%) Таблица 12 Чувствительность и специфичность методов NASBA и ПЦР в группе пациентов с наличием симптомов урогенитальной инфекции в сравнении с культуральным методом
В табл. 12 представлены параметры чувствительности, специфичности и прогностической значимости методов ПЦР и NASBA в сравнении с культуральным методом в группе пациентов с наличием симптомов урогенитальной инфекции. Параметры чувствительности и специфичности при сравнении NASBA и ПЦР с культуральным методом в группе пациентов с симптомами урогенитальн-гой инфекции следующие: Чувствительность = (27/27+0)х 100= 100% Специфичность = (145/145+0)х100=100%
Прогностическая значимость положительного результата = (27/27+0)х100=100% Прогностическая значимость отрицательного результата = (145/145+0)х100=100%
Таким образом, методы ПЦР и NASBA в группе пациентов с наличием симптомов урогенитальной инфекции все параметры оценки эффективности молекулярных методов были равны 100%. Напротив, при сравнении чувствительности и специфичности культурального метода по сравнению с молекулярными методами в этой группе пациентов оказалось, что чувствительность КК равна (19/19+8)х100=70,3%, специфичность - (145/145+0)х100=100%, прогностическая значимость положительного результата - (19/19+0)х 100=100%, прогностическая значимость отрицательного результата - (145/145+8)х100=94,8%.
Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени
Для иллюстрации случаев неудачи терапии приводим описание клинических случаев лечения вильпрафеном пациентов с урогенитальной хламидийной инфекцией.
Пациент П., 34 лет обратился в медицинский центр «Ювента» в апреле 2006 года по поводу выделений из половых путей у полового партнера. Известно, что пациент имеет высшее образование, без вредных привычек, не женат, в качестве контрацепции применяет прерванный половой акт. Половых партнеров имел за жизнь - 6, за последний год - одну. При объективном осмотре обнаружены слизи-сто-гнойные выделения из мочеиспускательного канала. При проведении прямой микроскопии, выполненной автором на приеме, обнаружены лейкоциты в мазках из мочеиспускательного канапа в количестве более 4 в поле зрения при просмотре более 5 полей зрения при увеличении светового микроскопа хЮОО. Диагноз урогенитального хламидиоза был поставлен 5.04.04г. после обнаружения хламидий в эпителии слизистой уретры методами культуральным и ПЦР. Был назначен вильпрафен в дозе 500 мг 2 раза в день 10 дней. Половому партнеру был также назначен джозамицин в той же дозе. На 2 день лечения хламидии обнаруживались в культуре клеток, далее на протяжении всего лечения и 2 недель после оканчания терапии хламидии методом посева не определялись. Однако, молекулярно-биологическими методами - ПЦР и NASBA, присутствие возбудителя фиксировалось до 7-го дня лечения включительно. На 10 день лечения и спустя 2 недели после терапии C.trahcomatis не идентифицировалась ни одним методом. Спустя 3 недели терапии вильпрафеном (13.05.04г.) при очередном контрольном исследовании материалов, полученных из уретры, хламидии были выявлены всеми тремя методами: культуральным, ПЦР и NASBA. Возможность реинфекции пациент отрицает. Был проведен курс лечения юнидоксом, при контрольном исследовании после окончания лечения хламидии у пациента не обнаруживались.
В этом случае возможность реинфекции не установлена. Возможно, имел место рецидив заболевания или персистенция хламидии.
Пациентка X., 22 лет обратилась в медицинский центр «Ювента» с жалобами на кровянистые выделения из половых путей. Пациентка не замужем, имеет среднее специальное образование, без вредных привычек, начало половой жизни -17 лет, в качестве контрацепции использует презерватив. Со слов пациентки, она имеет регулярный менструальный цикл, в анамнезе 2 искусственных аборта. За последние 6 месяцев у нее было 2 половых партнера. При осмотре в зеркалах обнаружены признаки цервицита (гиперемия наружного зева, слизисто-гнойные выделения из цервикального канала), подтвержденные при микроскопическом исследовании. Хламидии были выделены со слизистой цервикального канала 7.04.03г. культуральным методом и выявлены методом ПЦР. Пациентке был назначен вильпрафен в дозе 500 мг 2 раза в день 10 дней. Половому партнеру было рекомендовано аналогичное лечение. На протяжении всего периода лечения и 3-х недель после терапии хламидии методом посева не определялись. На 2 день лечения методы ПЦР и NASBA были положительными а далее оставались негатив 104 ными на протяжении всего лечения и спустя 3 недели после него. Через 1 месяц после лечения (22.05.03 г.) при посещении гинеколога для проведения контрольного анализа были взяты соскобы с эпителия цервикального канала, где были вновь обнаружена C.trahcomatis культуральным методом, методом ПЦР и NASBA. Со слов пациентки ее сексуальный партнер специфического противохламидийно-го лечения не получил. Пациентке был назначен доксициклин, половой партнер приглашен на осмотр и ему также назначена специфическая антибактериальная терапия.
Пациентка Б., 18 лет. Обратилась в НПО института им. Д.О. Отга РАМН с целью профилактического осмотра. Пациентка не замужем, имеет среднее образование, без вредных привычек. Начало половой жизни с 16 лет, беременностей не было, количество половых партнеров за последний год - 3, в настоящее время имеет одного полового партнера. Партнер на ИППП не обследован. При осмотре в зеркалах: эктопия шейки матки. При бимануальном исследовании: хронический левосторонний сальпингоофорит. 07.03.02 выделены хламидии из цервикального канала. С 26.03.02 по 04.04,02 принимала джозамицин по 500 мг 2 раза в день. Через 2 недели (19.04.02) после окончания лечения ПЦР и исследования на КК со-скоба эпителия цервикального канала дали положительные результаты. На вопрос о возможности реинфекции пациентка ответила утвердительно. Назначено лечение доксициклином и офлоксацином. Через 1 месяц после окончания лечения пациентка явилась на контрольное исследование. Методами ПЦР и культуры клеток хламидии не быни обнаружены. Последующие исследования, проведенные через 3 5 и 6 месяцев дали отрицательные результаты
Пациент В., 25 лет. Обратился в НПО института Отта с жалобами на выделения из мочеиспускательного канала, беспокоящие пациента в течение последних 10 дней. Из анамнеза известно, что пациент имеет высшее образование, без вредных привычек, в качестве контрацепции использует презерватив, начало половой жизни с 17 лет. За всю жизнь имел порядка 10 половых партнеров, послед 105 ние 6 месяцев у пациента один постоянный половой партнер. Партнер, со слов пациента, никогда не обследовался на ИППП. При осмотре на приеме у врача видимой патологии со стороны урогенитального тракта не выявлено. 17.06.02 выделены хламидии из уретры. С 26.06.02 по 05.07.02 принимал джозамицин по 500 мг 2 раза в день. Через 1, 2 и 3 недели после окончания лечения хламидии не выявлялись ни методом ПЦР, ни в культуре клеток. Через 1 месяц после окончания лечения (09.08.02) хламидии вновь были выделены из уретры (изолят 2232U). На вопрос о вероятности реинфекции ответил отрицательно. Назначен курс лечения доксициклином, через 3 недели после окончания лечения ПЦР и исследования на КК мочи и соскоба эпителия уретры дали отрицательные результаты.
Пациент О., 39 лет. Обратился на прием к врачу-дерматовенерологу с жалобами на выделения из мочеиспускательного канала, зуд в области половых органов и неприятный запах. Пациент имеет высшее образование, не женат, в настоящее время является лицом БОМЖ и 3, со слов, за жизнь сменил более 100 половых партнеров, в том числе и проституток, в качестве контрацепции использует презерватив, ежедневно употребляет спирные напитки. Настоящая партнерша имела урогенитальную хламидийную инфекцию 12 месяцев назад, информации о лечении нет. При физикальном осмотре: гиперемия кожи головки полового члена, мутные выделения из мочеиспускательного канала. 16.06.02 хламидии выделены из уретры (изолят 2994U). С 01.07.02 по 10.07.02 принимал джозамицин по 500 мг 2 раза в день. Через 1 2 недели и 3 месяца после окончания лечения тесты ПЦР и КК дали отрицательные результаты.
Динамика элиминации хламидий в ходе лечения урогенитальной хла-мидийной инфекции доксициклином и джозамицином
По существу, модификации возникают как адаптивные реакции отдельных микроорганизмов или всей популяции в целом в ответ на стресс и проявляются в изменении морфологических, биохимических, антигенных и других признаков, что позволяет им выживать и поддерживать на должном уровне численность своей популяции (Шипицына Е.В., 2003). После устранения факторов, вызвавших образование модификации, микроорганизмы возвращаются к исходному фенотипу. Биохимической основой модификации является контролируемая регуляторными генами индукция или репрессия соответствующих структурных генов. Примером модификации может служить способность некоторых микроорганизмов образовывать под действием пенициллина L-формы, лишенные клеточной стенки, а вместе с ней и мишени действия некоторых антибиотиков, а также структур, распознаваемых защитными факторами макроорганизма. L-формы сохраняют свою жизнеспособность и даже способность размножаться, а затем вновь возвращаться к исходной форме после прекращения действия пенициллина.
Под термином «персистенция хламидии» принято понимать длительное существование хламидии внутри клетки-хозяина в живом, но некультивируемом виде. Персистенция хламидии - это отклонение их жизненного цикла от нормального, которое может быть вызвано целым рядом факторов самой разной природы, включая антибактериальную терапию.
На многочисленных клеточных моделях было показано, что персистенцию хламидии могут вызывать цитокины (интерферон у), антибиотики (пенициллин, хлортетрациклин, эритромицин, сульфонамиды, рифампин, азитромицин, ци-профлоксацин и др.), а также истощение культуры по некоторым аминокислотам (триптофану и др.). Персистенция хламидии in vitro проявляется отсутствием выраженного роста, ограниченной метаболической активностью, неспособностью к репродукции и инфицированию других клеток. При иммунофлюоресцентном анализе персистирующих хламидий наблюдаются аберрантные - нетипичного размера и морфологии - внутриклеточные включения, которые, по данным электронной микроскопии, характеризуются наличием увеличенных РТ и практически полным отсутствием ЭТ. Авторы отмечают, что изменения в развитии хламидий, индуцированные перечисленными выше факторами, являются обратимыми: после удаления из инкубационной среды медиатора персистенции деление хламидий возобновляется, продукцируются ЭТ, способные инфицировать свежие клетки.
В какой мере персистенция хламидий, описанная в экспериментах in vitro, отражает ситуацию in vivo, на сегодняшний день неизвестно. Очевидно, что клеточные модели имеют целый ряд ограничений, и самым существенным из них является отсутствие ряда факторов макроорганизма, в том числе и иммунных, которые могут быть задействованы в установлении персистенции и последующей реактивации хламидий. По образному выражению G.L, Byrne (2001), хламидий, по-видимому, обладают способностью при любом негативном воздействии включать «тормоз репликации» и замедлять, таким образом, клеточное деление. Это событие сопровождается изменениями, которые, возможно, имеют отношение к патогенному потенциалу хламидий и позволяют им устанавливать длительное взаимодействие с клеткой-хозяином. Косвенными доказательствами персистенции хламидий in vivo может служить обнаружение хламидийной ДНК в биопсийных материалах эндометрия и фаллопиевых труб, взятых у женщин с бесплодием; при этом выделить хламидий в культуре клеток не удавалось. В наших случаях неудачи лечения вряд ли можно объяснить персистенцией хламидий, т.к. после лечения в разные сроки (2. 3 недели 1 месяце) хламидий выявлялись одновременно тремя методами а в культуре клеток выявлялись типичные МИКРОКОЛОНИИ хламидий Даже обнаружение одних и тех же генотипов в первом и ВТОРОМ случаях выявления хламидий у трех пациентов не может ГОВОРИТЬ о ПЄРСИСТЄНІІИИ этих микроорганизмов. По данным исследований проведенных в ГУ НИИАГ им. Д.О.Отта РА ДП генотип Е является наиболее часто выявляемым генотипом в натттем ре 118 гионе (25%), тем более что в одном случае хламидий именно этого генотипа выявлялись у пациентв через полгода после окончания лечения.Возможно, что в 3 из 7 случаев неудач терапии имеет место рецидив заболевания, а не персистенция (или реинфекция, несмотря на то, что, со слов пациентов, половой партнер получал лечение, а хламидий стали выявляться через 2, 3 недели и через 1 месяц). В 4 случаях из 7 (57%) доказана реинфекция в связи с тем, что в у 3 пациентов не лечился половой партнер, у 2 пациентов заболевание развилось через 6 месяцев полсе окончания терапии.
В литературе описаны единичные случаи появления мутантных клинических изолятов С. trachomatis, устойчивых к антибактериальными препаратам, при длительном наблюдении пациентов (от 3-х недель до 4-х месяцев) и показано, что после проведенной терапии количество клинических рецидивов с повторным обнаружением возбудителя и не связанных с реинфекцией может достигать 8%. В наших исследованиях все изоляты хламидий были чувствительны к исследуемому антибиотку.
Поэтому мы попытались рассмотреть еще один вопрос, касающийся возможного повторного выявления хламидий после проведенной терапии, с точки зрения массивности инфицирования. Нам на сегодняшний день известна всего одна работа, касающаяся количества выявляемых хламидий.
Выдвигается точка зрения о том, что у пациентов с большим количеством С. trachomatis существующие стандартные схемы терапии могут быть недостаточно эффективны для полной эрадикации возбудителя. Следовательно, проведение лабораторного исследования, позволяющего не только выявлять возбудителяь, но и определять его количество в клиническом образце, может иметь большое значение в выборе тактики этиотропной терапии.
