Введение к работе
Актуальность проблемы. Понимание физиологических и молекулярных основ становления полярности высших растений является одной из фундаментальных проблем биологии растений. Полярность можно определить как асимметрию в организации и физиологических функциях растительного организма (Медведев, 2004). Растения приобретают полярную организацию на самых ранних стадиях развития: точка проникновения спермия определяет ризоидальный полюс зиготы фукуса (Hable, Hart, 2010), а зародыш арабидопси-са уже на стадии 2-х клеток проявляет асимметрию в распределении фитогормо-иа ауксина (Berleth et al., 2004). С этого момента и на протяжении всего онтогенеза растения, находясь на Земле, испытывают воздействие силы тяжести, модуль и вектор которой постоянны. Сила тяжести задаёт ось полярности наземных и подземных органов растения, а ростовая реакция на изменение положения органа в пространстве — гравитропизм - регулируется ауксином при участии системы его транспорта и цитоскелета. Предполагается, что в регуляции гравитропизма также могут принимать участие и другие фитогормоны - цито-кинины, этилен (Карпенко и др., 1993; Aloni et al., 2006). За прошедшие 10 лет достигнут значительный прогресс в изучении роли переносчиков ауксина семейства PIN в регуляции гравитропизма арабидопсиса (Muday, Murphy, 2002; Kleine-Vehn et al, 2006; Robert, Friml, 2009; Viaene et al., 2012). Выяснилось, что локализация переносчиков PIN на цитоплазматической мембране клеток задаёт направление полярного транспорта ауксина в кончике корня, а при грави-стимуляции перемещение PIN3 на нижнюю мембрану клеток колумеллы индуцирует латеральный градиент концентрации ИУК в области апикальной меристемы корня (Friml et al., 2002). Кроме того, с использованием ингибиторов актинового цитоскелета было показано, что микрофиламенты актина необходимы для рециркуляции белков PIN и, таким образом, вовлечены в регуляцию гравитропической реакции (Muday, 2000). Для исследования актинового цитоскелета были созданы трансгенные конструкции, позволяющие визуализировать микрофиламенты in vivo (Sheahan et al., 2004). Было показано, что актиновый цитоскелет важен на самой ранней стадии гравитропической реакции (BaluSka, Hasenstein, 1997; Hou et al., 2003; Morita, 2010; Nakamura et al., 2011), а позднее его организация находится под влиянием ауксина (Nick et al., 2009). Тем не менее, остаётся неясным, какое значение для гравитропической реакции имеет специфическая организация актинового цитоскелета, может ли актиновый цитоскелет определять направление транспорта ИУК при гравистимуляции, и какое участие в регуляции гравитропизма принимает стрессовый гормон этилен.
Цель и задачи работы. Целью настоящей работы было изучение роли фитогормонов и актинового цитоскелета в регуляции гравитропической реакции корней арабидопсиса.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи: 1. Провести сравнительный анализ развития гравитропического изгиба корней арабидопсиса дикого типа и трансгенных растений GFP-/ABD2.
-
Разработать метод количественного анализа ИУК на гистологических препаратах трансгенных растений арабидопсиса DR5::GUS.
-
Охарактеризовать параметры латерального перераспределения ауксина в корнях арабидопсиса при гравистимуляции.
-
Оценить влияние этилена на гравитропическую реакцию корней арабидопсиса.
-
Исследовать изменения организации актинового цитоскелета при гравистимуляции корней арабидопсиса.
Научная новизна диссертационной работы. Впервые с использованием трансгенных растений GFP-/ABD2, позволяющих прижизненно визуализировать микрофиламенты, показано, что гравистимуляция корней Arabidopsis thaliana вызывает реорганизацию актинового цитоскелета в зоне растяжения корня. Продемонстрировано, что при гравистимуляции происходит снижение доли аксиально ориентированных микрофиламентов, а доля актиновых микро-филаментов, ориентация которых сонаправлена вектору силы тяжести, увеличивается в 3—4 раза.
Для оценки морфологии актиновых микрофиламентов, визуализированных с помощью родамин-фаллоидина, предложен индекс искривлённости. Показано, что после 15 мин гравистимуляции индекс искривлённости микрофиламентов актина в стеле корней арабидопсиса возрастает в 2 раза.
Разработан оригинальный метод количественной оценки фитогормона ауксина на гистологических препаратах арабидопсиса DR5::GUS. Впервые проведён количественный анализ латерального перераспределения ауксина в зоне растяжения корня арабидопсиса, и с его помощью установлено, что при гравистимуляции в нижней части корня происходит увеличение концентрации ИУК в 2-3 раза
Впервые показано, что при гравистимуляции этилен не влияет на грави-рецепцию и трансдукцию сигнала в корнях растений дикого типа, а у трансгенных растений GFP-/ABD2 тормозит развитие гравитропической реакции как на этапе рецепции и трансдукции сигнала, так и на этапе ростового ответа.
Научно-практическое значение. Полученные в диссертационной работе данные расширяют представления о клеточных и гормональных механизмах регуляции гравитропической реакции в корне арабидопсиса. В работе предложен метод оценки концентрации ауксина, который может быть использован при определении других фитогормонов, для которых доступны GUS-репортерные генетические конструкции. Оригинальные данные о влиянии этилена на гравитропическую реакцию корней трансгенных растений арабидопсиса GFP-/ABD2 могут быть востребованы при изучении актин-связывающих белков и важны для понимания физиологии трансгенного растения.
Апробация работы. Результаты работы были представлены в виде устных докладов на VI съезде Общества физиологов растений России в Сыктывкаре (18-24.06.2007), конференции молодых учёных „Биология - наука XXI века" в Пушино, Россия (29.10-2.11.2007), III Всероссийском симпозиуме
„Физиология трансгенного растения и фундаментальные основы биобезопасности" в Москве, Россия (18.10-21.10.2010), международной конференции „Физиология растений - фундаментатьная основа экологии и инновационных биотехнологий", VII съезде Общества физиологов растений России в Нижнем Новгороде (4-10.07.2011) и симпозиуме „Plant Biology in Space" в рамках FESPB 2012 во Фрайбурге, Германия (29.07-3.08.2012), а также в виде стендовых докладов на конференциях FESPB 2008 в Тампере, Финляндия (17-22.08.2008), IPGSA 2010 в Таррагоне, Испания (28.06-2.07.2010) и FESPB 2010 в Валенсии, Испания (4-10.07.2010).
Поддержка исследования. Работа была выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ №№ 08-04-00566-а „Взаимодействие Са-потоков и редокс-реакций в клеточных стенках в гормональной регуляции роста растений", 11-04-00701-а „Роль фитогормонов, цитоскелета и активных форм кислорода в регуляции роста клеток растяжением и трансдукции гравитационного сигнала" (руководитель грантов — проф., д.б.н. С.С.Медведев), персональных грантов Правительства Санкт-Петербурга №№ 2.6/22-04/004, 2.6/16-05/219-А и гранта ООО ОПТЭК в 2012 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи, из них одна в рецензируемом журнале из списка ВАК, 8 тезисов, и приняты к публикации 2 статьи в рецензируемых журналах.
Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 128 страницах текста, иллюстрирована 32 рисунками (из них 8 в приложении) и состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы (196 источников, в т.ч. 183 на иностранных языках) и приложения.
