Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 6
1.1 Структура аквапоринов, механизм функционирования и разнообразие 6
1.2 Функциональная активность аквапоринов 18
1.3 Регуляция функциональной активности аквапоринов растений 25
1.4 Роль аквапоринов в ответе растения на водный стресс 30
Глава 2. Материалы и методы исследования 35
Глава 3. Результаты и обсуждение 41
3.1. Осмотическая водная проницаемость мембран, изолированных из этиолированных проростков кукурузы 41
3.2. Ингибирование водной проницаемости мембран соединениями ртути 50
3.3. Содержание аквапоринов в плазматических мембранах с различной водной проницаемостью 57
3.4. Функциональная роль аквапоринов в регуляции осмотической водной проницаемости клеточных мембран Mesembfyanthemum crystallinum при переходе с Сз-типа фотосинтеза на САМ 63
Заключение 77
Выводы,,, 79
Список литературы 80
- Функциональная активность аквапоринов
- Роль аквапоринов в ответе растения на водный стресс
- Ингибирование водной проницаемости мембран соединениями ртути
- Функциональная роль аквапоринов в регуляции осмотической водной проницаемости клеточных мембран Mesembfyanthemum crystallinum при переходе с Сз-типа фотосинтеза на САМ
Введение к работе
Выяснение факторов, контролирующих перенос воды через клеточные мембраны растений, представляет собой важное направление исследований в рамках общей проблемы, касающейся механизмов транспорта воды в клетках и тканях высших растений и их водного обмена в целом. Хотя в физиологии растений это направление исследований давно стало классическим, оно в сильной степени было стимулировано в последние годы после обнаружения в мембранах животных и растительных клеток аквапоринов - интегральных белков, облегчающих пассивный трансмембранный перенос молекул воды. Водная проницаемость мембран может изменяться либо в результате изменения активности таких белков, то есть вероятности нахождения их водной поры в открытом состоянии, либо за счет вариации количества аквапоринов на единицу площади мембраны, Имеющиеся в настоящее время данные показывают, что исследования, связанные с идентификацией, выяснением особенностей функционирования и способов регуляции активности аквапоринов, весьма актуальны для понимания механизмов, определяющих динамику транспорта воды в растениях в нормальных и стрессовых условиях их окружения. Вместе с тем, несмотря на интенсивно ведущиеся в настоящее время работы по идентификации аквапоринов в растениях, мало известно о функциональной активности этих белков в их нативном окружении в растительных мембранах. Основные доказательства в пользу постулируемой функции аквапоринов как водных каналов получены с использованием модельной системы, представленной ооцитами Xenopus, обладающими низкой водной проницаемостью их плазматической мембраны, способными к экспрессии растительных аквапоринов и обнаруживающими в этом случае гораздо более высокие скорости осмотического набухания. Однако, несмотря на широкое применение этого подхода, его использование далеко не всегда позволяет выявить функциональную активность этих белков, причем в особенности это касается аквапоринов плазматических мембран растений. В то же время, имеющиеся в литературе данные показывают, что функциональная идентификация растительных аквапоринов в их нативном окружении в растительных мембранах сильно осложняется явной ограниченностью традиционных методических подходов для изучения их водной проницаемости in vivo, необходимостью использования в этой связи изолированных мембранных везикул и методов быстрой кинетики для регистрации осмотических изменений их объема, а также тем фактом, что далекими от ясности остаются механизмы эндогенной регуляции функциональной активности таких белков.
Функциональная активность аквапоринов
Транспорт воды по водным каналам в биологических мембранах имеет низкую энергию активации Аррениуса (Ед). Оценка этого параметра в мембранах растений показала, что его значение находится в диапазоне от 17 до 25 кДж моль 1. Величина, характерная для липидного бислоя, выше и лежит в области от 46 до 63 кДж моль"1 (Tyerman et al. 1999). Однако оценка активности аквапоринов как водных каналов в мембране сопряжена с целым рядом сложностей. Водная проницаемость для липидного бислоя высока, и, следовательно, создает значительный фон при измерениях водной проницаемости биологических мембран. Водный транспорт через водные каналы определяется по отношению Р0(/Рд, когда оно больше 1. Эта особенность может быть использована при анализе активности аквапорина. Коэффициент осмотической водной проницаемости (Рос) отражает проницаемость, когда в качестве движущей силы служит градиент Гидростатического или осмотического давления. Коэффициент диффузионной проницаемости (Рд) - это измерение диффузии через мембрану при отсутствии градиента водного потенциала. Для биологических мембран отношение Р0 /Рд обычно выше 1 благодаря присутствию аквапоринов или других белковых каналов, Коэффициент ОСМОТИЧеСКОЙ ВОДНОЙ ПрОНИЦаеМОСТИ (Рос) литадньгх бислойных мембран составляет приблизительно 10 мкм с"1. Он в значительной степени определяется качественным составом липидов (Lande et al. 1995). С увеличением степени ненасыщенности входящих в состав липидов жирных кислот, увеличивается водная проницаемость мембран (Olbrich et al. 2000). Превышение величины на один или два порядка сверх этого значения в биологических мембранах связывают с присутствием дополнительных транспортных путей для воды белковой природы. Так для мембраны эритроцитов значение этого коэффициента - 200 мкм с 1 (Масеу 1984), 86 мкм с 1 для тонопласта пшеницы (Niemietz and Tyerman 1997), 690 мкм с"1 для то но пласта культивируемых клеток табака (Maurel et al. 1997) и т.д. Коэффициент осмотической проницаемости Рос (4.6-5.4)х10 20 м3 с"1 на одну субъединицу AQP1 был определен независимо в двух работах (Walz et al. 1994; Zeidel et al. 1994), в которых очищенный AQP1 встраивали в липосомы. Tyerman с соавт., используя рассчитанное значение этого коэффициента, провели оценку величины потока и нашли, что она эквивалента 10 молекул воды в секунду через один мономер при физиологически реальном осмотическом градиенте в 0.1 МПа (Tyerman et al. 1999).
Таким образом, характеристики трансмембранного переноса молекул воды сопоставимы с таковыми для ионных каналов. Однако методы, разработанные для регистрации токов, не пригодны в случае электронейтральной молекулы воды. Основные методы исследования транспорта воды, так или иначе, связаны с необходимостью регистрации изменений объема везикул, протопластов, клеток в осмотических процессах (Maurel 1997). Оценка функциональной активности аквапоринов Изменения гидростатического давления, присущие водному потоку на границах растительных клеток, можно измерить, используя зонд давления («pressure probe»). Этот методический прием, разработанный и введенный в экспериментальный арсенал физиологов растений Steudle, успешно используется в последнее время (Steudle 2001). Однако с его помощью можно оценить так называемую клеточную проницаемость для воды, которая включает в себя параметры плазмалеммы и тонопласта одновременно. В мембранных везикулах или протопластах изменения объема при диссипации трансмембранного осмотического градиента могут быть измерены с использованием спектральных методов или техники видеоизображения (Maurel et al. 1997; Ramahaleo et al. 1999). Экспрессия мРНК исследуемых белков в крупных ооцитах Xenopus позволяет исследовать активность аквапоринов, регистрируя изменения объема этих клеток в осмотических процессах. Такие изменения объема в большинстве исследований обычно служат критерием активности аквапоринов. Однако, зачастую, гетерологичная экспрессия лишает исследуемый аквапорин его естественного белкового окружения и, как следствие, сказывается на его функционировании. Водная проницаемость отдельных растительных белков была исследована в таких гетерологичных системах экспрессии, как Saccharomyces cerevisiae и Dictyostelium discoideum (Laize et al. 1995; Chauraont et al. 1997; Maurel 1997). Активность некоторых аквапоринов клеток животных была также успешно определена путем встраивания очищенных белков в липосомы (Zeidel et al. 1994). NOD26 - единственный белок растений, который был очищен и проанализирован в составе протеолипосом (Weaver et al. 1994; Dean et al. 1999). Дополнительное доказательство того, что представители семейства МІР растений функционируют как аквапорины, было получено при помощи методов генной инженерии с использованием трансформированного A. thaliana, в который был встроен нокаутированный ген аквапорина AtPIPlb (Kaldenhoff et al. 1998). В протопластах из листьев трансгенньгх растений (antisense- AtPIPlb) экспрессировался более низкий уровень PIP1-белков, чем в контрольных. Для плазмалеммы таких протопластов была характерна более низкая водная проницаемость. Кроме того, сами растения отличались от контроля в несколько раз более развитой корневой системой.
Некоторые аквапорины обнаруживают чувствительность к соединениям ртути. Эти соединения могут обратимо блокировать трансмембранный водный поток путем связывания с сульфгидрильными группами цистеиновых остатков, расположенных в районе водной поры (Yamaguchi-Shinozaki ct al. 1992; Daniels et al. 1994), Однако не все аквапорины содержат такой цистеин, расположенный вблизи домена, образующего пору. Связывание ртути может вызывать конформационные перестройки в молекулах аквапоринов. Это было продемонстрировано для аквапоринов плазмалеммы корнеплода свеклы. В экспериментах изменялся характер протеолиза этих белков после обработки мембран ртутью (Barone et al. 1997). Активность многих аквапоринов растений чувствительна к присутствию соединений ртути, однако известны и случаи, когда ртуть не влияет на активность аквапоринов (Biela et al. 1999). Недавно появились данные о том, что соединения серебра и золота вызывают необратимое ингибирование водной проницаемости аквапоринов (Niemietz and Tyerman 2002). Тремя независимыми исследовательскими группами было обнаружено, что активность водных каналов в изолированных везикулах плазмалеммы имеет очень
Роль аквапоринов в ответе растения на водный стресс
Регуляция активности аквапоринов может быть как результатом экспрессии генов, так и транслокации аквапоринов или контроля их активности (Luu and Maurel 2005). Помимо исследований функций аквпоринов самих по себе, об их физиологической роли в росте растений при благоприятных условиях или в процессе адаптации к солевому стрессу или засухе известно очень мало (Javot and Maurel 2002; Hill et al. 2004). Основными неразрешенными остаются два вопроса: является ли движение воды через аквапорины лимитирующим фактором развития растения при благоприятных условиях роста и как аквапорины участвуют в ответе растения на засуху и солевой стресс. Ответ на первый вопрос неоднократно пытались получить при помощи методов генной инженерии. Так было установлено, что редукция уровня экспрессии PIP lb в мутантном Arabidopsis thaliana приводила к значительному изменению морфологии корней и пятикратному увеличению их массы (Kaldenhoff et al. 1998). Редукция экспрессии PIP lb не отражалась ни на водном потенциале, ни на массе растения. Наблюдавшийся эффект можно объяснить компенсаторным увеличением всасывающей поверхности корней. Сверхэкспрессия PIPlb в табаке при благоприятных условиях роста значительно увеличивала скорость роста растений, уровень транспирации, плотность устьиц и эффективность фотосинтеза. Напротив, сверхэкспрессия PIPlb при солевом стрессе не давала преимуществ растениям, а при засухе вызывала негативный эффект, заключающийся в быстром завядании (Aharon et al. 2003). В связи с этим можно предположить, что трансмембранный водный транспорт через аквапорины плазмалеммы является лимитирующим фактором роста растений при благоприятных условиях и что даже полное орошение растения ограничивается переносом воды. Напротив, увеличение симпластного водного транспорта через аквапорины плазмалеммы может не иметь благоприятного эффекта при солевом стрессе и иметь негативный эффект при засухе. Исследования редукции уровня экспрессии гомолога PIP1 табака (NtAQPl) в трансгенном табаке с той же самойантисмысловой последовательностью показали, что растения проявляли повышенную чувствительность к полиэтиленгликолю, низкую водную проводимость корней и низкий уровень транспирации по сравнению с контрольными растениями при солевом стрессе (Siefritz et al. 2002).
Остается не ясной связь между ролью аквапоринов в регуляции водного статуса растения и регуляцией экспрессии генов аквапоринов. За последние более чем 10 лет были накоплены данные, указывающие на то, что водный стресс может изменять экспрессию генов МІР. Экспрессия некоторых генов, кодирующих плазматические аквапорины, таких как RD28 A. thaliana и гены NeMip2 и NeMip3 Nicotiana excelsior, стимулируется при засухе (Yamaguchi-Shinozaki et al. 1992; Yamada et al. 1997). Guerro с соавторами обнаружили повышенную экспрессию генов аквапоринов PIP в увядающих стеблях и листьях Pisum sativum (Guerro et al. 1990; Guerro and Crossland 1993). Подобное увеличение экспрессии РІР-генов было показано для белка TRAMP томата (Fray et al. 1994), mipA Brassica oleracea (Ruiter et al. 1997), СрРІРаб, CpPIPa2 растений Craterostigma plantagineum (Mariaux et al. 1998), двух аквапоринов риса OsPIPla и OsPIP2a (Malz and Sauter 1999).
В то время как экспрессия гена Р1Р1 A. thaliana в условиях стресса существенно не менялась (Grote et al. 1998), при водном стрессе наблюдалось уменьшение экспрессии некоторых генов аквапоринов в других растениях. Так, Yamada с соавторами (1995) обнаружили в М. crystallinum L. семейство транскриптов PIP (МІР А), экспрессия которых уменьшалась у растений, подвергнутых солевому стрессу. Подобное уменьшение экспрессии одного из генов аквапоринов (rwcl) было обнаружено у риса при засухе (Li et al. 2000).Некоторые представители семейства TIP также обнаруживали изменение экспрессии, когда растения подвергались водному стрессу. Экспрессия гТІР риса (Liu et al. 1994), SunTIP7 подсолнечника (Sarda et al. 1997), BobTIP26 цветной капусты Brassica oleracea var. Bortilis L. (Barrieu et al. 1999), увеличивалась. Наоборот, для CpTIP в растениях Craterostigma plantagineum (Mariaux et al. 1998) и McMIP FBM crystallinum L. (Kirch et al. 2000) на фоне недостатка воды экспрессия была подавлена.
Исследования показали различную чувствительность МІР к АБК. Mariaux с соавт. (1998) обнаружили, что хотя экспрессия СрР1Ра2 была чувствительна как к обезвоживанию, так и к обработке АБК, экспрессия родственного СрРІРаб, реагирующая на засуху, не зависела от АБК. Rd28 в A. thaliana (Yamaguch-Shinozaki et al. 1992) и TRAMP из томата (Fray et al. 1994) были нечувствительны к АБК.Изменение экспрессии генов аквапоринов в ответ на засуху может происходить локально, например, в замыкающих клетках устьиц (Sarda et al 1997) или пыльниках (Ruiter et al, 1997). В M. crystallinum L. (Yamada et al. 1995) гены аквапоринов специфически экспрессируются в клетках, окружающих проводящие ткани корня. Иногда в отдельных клетках или тканях наблюдалось увеличение экспрессии аквапоринов (Kirch et al 2000).
Интерпретация данных, показывающих, что гены аквапоринов вовлечены в ответ растения на водный стресс, осложняется тем, что библиотека кДНК, используемая для идентификации генов, дифференциально экспрессирующихся в условиях засухи, часто бывает получена из клеточных экстрактов целого растения, где невозможно локализовать экспрессию генов, отвечающих на засуху в специфических тканях. Кроме того, субклеточная локализация транскриптов часто неизвестна, а уровень экспрессии генов при водном стрессе может не отражать количество аквапоринов в ткани (Kirch et al. 2000; Suga et al. 2001). Другие сложности возникают из-за того, что активность водных каналов кодируемых белков часто неизвестна. Основные доказательства функции исследуемых аквапоринов как водных каналов были получены с использованием модельной системы, представленной ооцитами Xenopus (Daniels et al. 1994; Yamada et al. 1995; Sarda et al. 1997; 1999; Barrieu et al. 1999; Li et al. 2000). Однако, несмотря на широкое применение этого подхода, его использование далеко не всегда позволяет выявить функциональную активность этих белков. При этом функциональная идентификация растительных аквапоринов в их нативном окружении в растительных мембранах сильно осложняется явной ограниченностью традиционных методических подходов для изучения их водной проницаемости in vivo, а также тем фактом, что далекими от ясности остаются механизмы эндогенной регуляции функциональной активности таких белков. Водный стресс может действовать не только на экспрессию генов аквапоринов, но и на процессы активации/дезактиваци каналов путем обратимого фосфорилирования (Johansson et al. 1998; Guenter et al. 2003), непосредственного действия осмотического или гидростатического градиентов (Ye et al. 2004; Wan et al. 2004), и на везикулярный транспорт (Vera-Estrella et al. 2004). Вероятнее всего перечисленные процессы работают согласованно, а не включаются при стрессе в индивидуальном порядке, однако как растение осуществляет координацию их работы остается не ясным (Tyerman et al 2002; Luu and Maurel 2005).
Ингибирование водной проницаемости мембран соединениями ртути
Выявление активности аквапоринов в их нативном окружении в клеточных мембранах in vitro может базироваться на чувствительности трансмембранных потоков воды к ртутьсодержащим соединениям. Соединения ртути могут обратимо блокировать трансмембранный водный поток путем связывания с сульфгидрильной группой цистеина, расположенного в районе водной поры (Maurel 1997). Связывание ртути может также вызывать конформационные перестройки в молекулах аквапоринов (Baroneetal. 1997). Кинетика изменения светорассеяния везикул внутриклеточных мембран в ходе их осмотического сжатия в гипертонической среде в присутствии и отсутствие ртутьсодержащих соединений хлорида ртути (HgCb) и п сульфофенилмеркуриохлорида (ПХМБС) представлена на рисунке 11. Можно видеть, что скорость процесса существенно снижалась после добавления к препаратам внутриклеточных мембран как HgCh (кривая 2), так и ПХМБС (кривая 3). Скорость осмотического сжатия везикул плазмалеммы не изменялась в присутствии ПХМБС (данные не представлены), но возрастала после предварительного инкубирования мембран с HgCb (рис. 12, кривая 2).
Данные, приведенные на рисунках 13 и 14, показывают, что коэффициент осмотической водной проницаемости (РосХ рассчитанный на основе аппроксимации кинетических кривых экспоненциальными зависимостями для внутриклеточных мембран, значительно уменьшался с ростом концентрации в среде как одного, так и другого ингибитора. Вместе с тем, из сравнения полученных концентрационных зависимостей следует, что ингибирующее действие ПХМБС (рис. 13, кривая 1) проявлялось в диапазоне концентраций на порядок превышающих таковые для HgCb (рис.14, кривая 1). Значительное замедление в присутствии как HgCb, так и ПХМБС кинетики осмотического сжатия везикул внутриклеточных мембран, свидетельствующее о снижении их водной проницаемости, проще всего объясняется закрыванием в них водных каналов аквапоринов из-за связывания ионов ртути с SH-группами их цистеиновых остатков, локализованных в районе водной поры. Эти изменения вполне могут быть следствием и конформационных перестроек, происходящих в молекулах аквапоринов в результате блокирования SH-групп цистеинов, контролирующих проводимость их водного канала. Таким образом, выявленное действие ртути на измеренные параметры водного транспорта через внутриклеточные мембраны свидетельствует в пользу участия в нём аквапоринов. Отсутствие влияния выбранных реагентов на кинетику осмотического сжатия везикул плазмалеммы и даже ускорение этого процесса относительно высокими концентрациями ингибитора HgCh являются неожиданными (рис. 12, кривая 2 и рис. 14, кривая 2). Эти наблюдения трудно объяснить в рамках традиционных представлений о природе ингибирующего действия ртути на трансмембранные потоки воды в клеточных мембранах. Следует обратить внимание, что величина осмотической водной проницаемости плазмалеммы гораздо меньше, чем соответствующая величина для внутриклеточных мембран. Эти особенности, скорее всего, обусловлены низким содержанием в плазмалемме аквапоринов и/или инактивацией их в условиях in vitro.
Кроме того, аквапорины, локализованные в этой мембране, могут быть не чувствительны к действию ртути. Некоторые примеры устойчивости таких белков клеточных мембран к ртутьсодержащим соединениям уже описаны в литературе (Biela et al. 1999; Daniels et al. 1994). Вместе с тем, аномальный эффект высоких концентраций ртути на водную проницаемость плазмалеммы может быть также следствием особого действия ингибитора, как это недавно продемонстрировано в случае аквапорина AQP-6 в эпителиальных клетках крысы (Yasui et al. 1999; Hasama et al. 2002), где при высоких концентрациях HgCb в среде наблюдалась активация водного транспорта. Таким образом, неэффективность ингибирующего действия ртути на трансмембранный поток воды еще не может служить индикатором отсутствия в мембранах аквапоринов. Если ограничиться полученными результатами, то вряд ли можно заключить, что аквапорины не включаются в транспорт воды через плазмалемму корней кукурузы. С другой стороны, альтернативное объяснение рассматриваемого феномена, сводимое к увеличению под влиянием ртути неспецифической водной проницаемости плазмалеммы, представляется маловероятным, поскольку эффекты ингибитора обращались в присутствии меркаптоэтанола (данные не представлены). Тем не менее, независимо от природы наблюдаемого стимулирующего эффекта действия ионов ртути, устойчивость потока воды через плазмалемму к умеренно низким концентрациям ингибитора в целом позволяет говорить о низкой активности аквапоринов в этой мембране по отношению к соответствующей активности их во внутриклеточных мембранах. Из сказанного выше следует вывод о том, что плазмалемма и внутриклеточные мембраны из корней кукурузы заметно различаются по вкладу аквапоринов в их осмотическую водную проницаемость, если судить об этом по чувствительности трансмембранного движения воды к выбранным ртутьсодержащим реагентам.
Функциональная роль аквапоринов в регуляции осмотической водной проницаемости клеточных мембран Mesembfyanthemum crystallinum при переходе с Сз-типа фотосинтеза на САМ
По мнению ряда авторов (MaureL 1997; Chrispeels et al. 1999; Tyerman et al. 1999; Johansson et al. 2000), мембраны являются одним из важнейших пунктов в иерархии систем, регулирующих формирование ответной реакции растения на водный дефицит, в силу присущей им способности регулировать свою водную проницаемость. Такую способность связывают с наличием в их составе интегральных белков-аквапоринов, функционирующих как водные каналы и облегчающих пассивный перенос молекул воды через мембраны (Verkman and Mitra 2000). На основании полученных ранее данных полагают, что факторы, контролирующие гидравлическую проницаемость клеточных мембран, играют важнейшую роль в осморегуляторных процессах, связанных с адаптацией к осмотическому стрессу (Yamada et al. 1995; Barkla et al. 1999; Kirch et al. 2000). Тем не менее, предположение о важной роли регуляции водной проницаемости мембран при адаптации растений к стрессорным условиям пока не имеет достаточных экспериментальных доказательств. Относительное содержание аквапоринов в мембранах, удельная водная проводимость индивидуальных изоформ, а также вероятность нахождения водной поры в открытом или закрытом состоянии, могут быть ключевыми факторами, определяющими интенсивность трансмембранного переноса воды в растениях. Для проверки гипотезы об участии аквапоринов в регуляции трансмембранного транспорта воды была оценена осмотическая водная проницаемость и обогащенность аквапоринами мембран Mesembryanthemum crystallinum L. (сем. Aizocacea). Этот вид проявляет генетически детерминированный переход с Сз-типа фотосинтеза на САМ, который реализуется в условиях стресса, а также на поздних стадиях генеративного развития. Для растений засушливых местообитаний переход на САМ является адаптивным механизмом, позволяющим не только эффективно ассимилировать СОг, но и регулировать водный обмен в целом, снижая интенсивность транспирации.
Поэтому САМ часто определяют как водосберегающую стратегию адаптации, позволяющую минимизировать общие потери воды (Luttge 1993). На уровне целого растения регулируемым оказывается перераспределение интенсивностей водных потоков, которые, согласно композитной модели водного транспорта, осуществляются внеклеточно (по апопласту) или трансклеточно (через мембраны и плазмодесмы) (Steudle 2000а). Водный поток по трансмембранному пути встречает значительное гидравлическое сопротивление, которое благодаря присутствию аквапоринов в мембранах может существенно снижаться (Chrispeels et al. 1999; Tyerman et al, 1999; Johansson et al. 2000; Steudle 2000b). Для исследований были выделены две возрастные группы растений, различающихся по способности к индукции САМ и интенсивности протекания этого процесса. Согласно измерениям суточной разности титруемой кислотности клеточного сока для растений 4-5-недельного возраста она не превышала 1 мкэкв Н+/г сырой массы, что характеризует их как растения с Сз-типом фотосинтеза. Для 8-9-недельных растений разница между значениями этого параметра, определенного утром и вечером, достигала примерно 50 мкэкв Н+/г сырой массы, что характерно для сформированного САМ (Adams et al. 1998; Winter and Gademan 1991). В другой серии экспериментов 4-5-недельные растения подвергали 2-недельному солевому воздействию (400 мМ NaCl). На рис. 19 (В) можно видеть, что длительный солевой стресс приводил к задержке роста и увеличению ксероморфности листьев растения по сравнению с контролем. змерения титруемой кислотности клеточного сока в конце этого периода показали, что суточная разница титруемой кислотности составляла для контрольных растений около 20, а для засоленных - около 100 мкэкв Н"7г сырой массы. Таким образом, стресс-индуцируемый переход на САМ был более выраженным по сравнению с онтогенетически регулируемым. Из всех групп растений, протестированных на развитие САМ, были получены клеточные мембраны, представленные микросомальными мембранами из корней, плазмалеммой и смесью внутриклеточных мембран из листьев. Анализ активности маркерных ферментов, указывающих на присутствие во фракциях плазмалеммы (КазУСи-ингибируемая Н+-АТФаза), тонопласта (К Юз-чувствительная Н+-АТФаза), эндоплазматического ретикулума (антимицин А-нечувствительная НАДН-редуктаза) и митохондриальных мембран (цитохром с-оксндаза) показал, что после разделения микросомальных мембран в двухфазной полимерной системе верхняя фаза содержит высокоочищенную плазмалемму (таблица). Нижняя фаза значительно обогащена тонопластом, но содержит также мембраны эндоплазматического ретикулума и небольшую примесь плазмалеммы. и внутриклеточных (Б) мембран листьев и микросомальных (В) мембран корней растений М. crystallinum разного возраста. Величина осмотического градиента ЮОмМ сахарозы. 1 -контроль, 2 - засоление (24 ч, 400 мМ NaCl). везикул регистрировалось как кинетика изменений светорассеяния в ответ на создание осмотического градиента, величина которого определяла амплитуду процесса. Кривые, отражающие сжатие везикул микросомольных мембран, изолированных из корней М. crystallinum, хорошо аппроксимировались суммой двух экспонент. Значение средневзвешенной константы скорости осмотического сжатия для этих мембран уменьшалось примерно в 3 раза при переходе растений на САМ (рис. 20 В). ЬСинетика изменения светорассеяния при осмотическом сжатии везикул плазмалеммы и эндомембран, изолированных из листьев (рис. 20 А и Б), хорошо апроксимировались одноэкспоненциальными зависимостями с близкими значениями константы скорости процесса.
Из этого следует, что величины водной проницаемости этих мембран сопоставимы. С переходом растений на САМ этот параметр уменьшался как в листьях, так и в корнях М. crystallinum. Засоление (24 ч, 400 мМ NaCl) также снижало водную проницаемость мембран (кривые 2). Представленные данные позволяют заключить, что с возрастом растений, при переходе их на САМ и при засолении увеличивается сопротивление мембран водному потоку. Это означает, что дневное подавление транспирации при формировании САМ сопровождается снижением интенсивности трансмембранного транспорта воды. Полученные данные достаточно хорошо согласуются с результатами Rygol et at. (1989), которые использовали зонд давления для изучения осмотической водной проницаемости мембран клеток мезофилла у растений с NaCl-индуцированным САМ. Вместе с тем, для Сз-растения Arabidopsis thaliana, как было показано Morillon и Chrispeels (2001), в условиях подавленной транспирации активность трансмембранного переноса воды, напротив, возрастала. По-видимому, регуляция водной проницаемости мембран может носить не только компенсаторный характер, но и указывать на изменение водного статуса растения в целом. Полученные мембранные препараты были проанализированы методом ДДС-ПААГ электрофореза. На рис. 21 явно видны различия в белковых спектрах плазматических (нечетные дорожки) и внутриклеточных (четные дорожки) мембран как корней, так и листьев. Вместе с тем, различия в белковых спектрах мембран из растений разновозрастных групп практически отсутствовали. Обогащенность исследуемых мембран аквапоринами оценивали на основе интенсивности окраски при иммунологической идентификации изоформ МІР А, МІР В и МІР С (рис. 22).
