Содержание к диссертации
Введение
ВВЕДЕНИЕ 3
Глава I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1.1. Влияние солей на активность ферментов in vitro у растений галофитов и гликофитов 7
1.2. Концентрации Na+ и К+ в протоплазме растительных клеток 12
1.3. Транспорт катионов через плазмалемму растительной клетки 21
Глава II. ОБЪЕКТЫ-И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 30
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава III. ДЕЙСТВИЕ FaCl НА ФОТОСИНТЕТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ВОДОРОСЛЕЙ DUMLIELLA Ilf VIVO И IN VITRO . . . 40
Глава ІV. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ На+И К+ МЕЖДУ КЛЕТКАМИ И ВНЕШНЕЙ СРЕДОЙ 54
Глава V. ТРАНСПОРТ КАТИОНОВ (К+, Na+, Н+) ЧЕРЕЗ ПЛАЗМАЛЕММУ ВОДОРОСЛЕЙ DMALIELLA 62
5.1. Поглощение ионов калия и эффект валиномицина 62
5.2. Выведение Na+ из протоплазмы и транспорт 74
5.3. Влияние ингибиторов мембранных АТФаз(уабаин, ДЦКД, п-ХМБ), протонофора КЦХФ
и рН на транспорт катионов 79
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 91
ВЫВОДЫ 101
Литература 103
- Влияние солей на активность ферментов in vitro у растений галофитов и гликофитов
- ДЕЙСТВИЕ FaCl НА ФОТОСИНТЕТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ВОДОРОСЛЕЙ DUMLIELLA Ilf VIVO И IN VITRO
- РАСПРЕДЕЛЕНИЕ На+И К+ МЕЖДУ КЛЕТКАМИ И ВНЕШНЕЙ СРЕДОЙ
- Поглощение ионов калия и эффект валиномицина
Введение к работе
Проблема устойчивости растений к высокому содержанию солей в среде является одной из актуальных проблем современной фитофизиологии; Малопригодные для возделывания культурных растений засоленные почвы занимают значительную часть нашей планеты. (Строгонов,1962,1973). Современные гидромелиоративные методы далеко не всегда позволяют в достаточной степени снизить засоленность почвы. Вследствие этого особое значение приобретает изучение механизмов солеустойчивости. Знание этих механизмов позволит разработать эффективные агротехнические приемы, и применять, их для повышения урожайности в условиях засоления, а также целенаправленно проводить селекцию для выведения новых солеустойчивых сортов;
Первые систематические исследования в области солеустойчивости были проведены-Баталиным (1875), который исследовал анатомонуюрфологические изменения, возникающие в растениях при засолении.
Измерения содержания ионов в тканях показали, что различные растения по-разному реагируют на увеличение концентрации соли в среде. Растения одной группы при засолении поглощают значительные количества ионов. Другие поддерживают низкий уровень засоляющих ионов в тканях. И, наконец, существуют растения, способные выделять избыток солей, поступающих из-почвы, при помощи специальных желез, выводить их через корни или сбрасывать листья, нагруженные солями (Рихтер, 1927 ; Келлер,1951 ; Генкель,1954 ; Строгонов,1962 и. др.). Строгоновым (1962,1973) было установлено, что соли оказывают не только осмотическое, по ж токсическое действие на растения. Поступление « 4 -ионов из почвы- и ;наколление их в тканях до высоких концентраций может привести, к нарушению метаболизма и гибели, растений. Это явилось важным этапом в. исследованиях по физжологии соле-устойчивости и дало начало новому направлению. — изучению нарушений метаболизма, а также выяснению биохимических механизмов солеустойчивости (Строганов,1962,1973 ; Строгонов и др.,1970 ; Flowers et al., 1977 ; Шевякова,1979 ; Greenway, Munns, 1980; Jefferies, I98I)v Наряду с токсическим эффектом была дрка-зана специфичность действия различных ионов на растения (Стро-гонов,1962,1973 ; Строганов ж др;, 1970); Вопросы же, связанные со способностью растений выводить избыток солей во внешнюю среду (то есть с ионным транспортом) ж поддерживать содержание засоляющих ионов в тканях на низком уровне, стали привлекать внимание исследователей лишь в самое последнее время; Работы, выг полненные в. этой области, свидетельствуют о важной роли ионно-транспортных процессов в защите растений от действия засоляющих ионов (Воробьев, и др. ,1974; Захарин, 1980,1985);
Большое число работ, же связанных непосредственно с изучением солеустойчивости, но касающихся мембранных жонно-транс-портных процессов, служит убедительным свидетельством в пользу необходимости исследования функций клеточных мембран при засолении; Данные,, полученные в. основном на гликофильных растениях, покааалж, что жонный состав протоплазмы, контролируется, плазма-лемма является в высшей степени чувствительной к внешним воздействиям ж создает регулируемый барьер для поступления в протоплазму различных веществ; Мембраны, контролируют постоянный обмен энергией и веществом и осуществляют генерирование жоннык градиентов за счет энергиж метаболизма (Нобел,
1973 ; Вахмистров,Мазель, 1973 ; КларксонД978 ; Дюттге, Хитинбо-* тамД984);
Особяй интерес представляют механизмы, ионного транспорта у галофильных растений; Работ в этой области выполнено немного. Согласно имеющимся сообщениям, параметры активного транспорта ионов у гликофитов и галофитов различаются (Karlson, Kylin, 1974; Hull, Epstein, 1978 ; Мшаустина и др. Д979), давая возможность предположить более высокую эффективность поддержания ионного гомеостаза в клетках последних.-
Уникальным объектом для изучения механизмов устойчивости к высокому содержанию солей, в среде являются одноклеточные зеленые водоросли рода Dunaiieiia v В число видов, этого рода входят морские водоросли, и крайние галофилы. Отсутствие у них клеточной стенки, и центральной вакуоли значительно облегчает измерение ионных потоков через плазмалемму и концентраций ионов в. протоплазме.
В связж о вышеизложенным в работе были поставленії следующие задачи; а) сравнительное изучение метаболической активности in vivo и. in vitro у различающихся по солеустойчивости видов Dunaiieiia salina и D.maritima при различных концентрациях пасі в. среде (в качестве показателя метаболической ак~ тивности in vivo использовали интенсивность фотосинтеза, in vitro - скорость реакции Хидла) % б) исследование зависимости концентраций ионов. На+ и Kj" в протоплазме у этих же водорослей от концентрации NaCl во внешней среде; в) изучение ионно-транспортных функций плазматической мемб раны Dunaiieiia (измерение потоков їїа+ , К* и Б* и ие~ следование действия различных факторов, и ингибиторов на транспорт этих ионов)1.
В результате проведенной работы показано, что солеустой-чивость галофильных водорослей в значительной степени определяется свойствами плазмалеммы. Регуляторная роль этой мембраны- состоит в поддержании концентрации ионов Жа+ в протоплазме на относительно низком уровне. Это осуществляется путем виведення т из протоплазмы: во внешнюю среду против градиента электрохимического потенциала при функционировании протонного насоса; ІҐ"-насос генерирует градиент электрохимического потенциала протонов, на плазмалемме С A/cEf) и Na+ выводится из протоплазмы через плазмалемму путем,ионно-обменной диффузии (Ef-їїа антипортер) за счет энергии л ДНІ". Эффективность поддержания ионного гомеостазе у растений, отличающихся по солеустойчивости, различна.
Влияние солей на активность ферментов in vitro у растений галофитов и гликофитов
Хорошо известно, что многие галофиты. при увеличении содержания соли в среде накапливают значительные количества ионов в тканях. При этом реакции обмена веществ и физиологические функции поддерживаются на высоком уровне. Не наблюдается также снижение роста и развития. Более того, у некоторых из них присутствие солей во внешней среде стимулирует эти процессы. (Рихтер, 1927 ; ГенкельД954 ; Строгонов, 1962,1973).
Такого рода исследования стали отправным пунктом для поиска биохимических адаптации в клетках галофитов. Ожидалось, что макромолекулы, (белки, нуклеиновые кислота и прочие), осуществляющие процессы, метаболизма и являющиеся его участниками, должны быть специфическим образом модифицированы и приспособлены, к высокому содержанию ионов в протоплазме» которое предполагалось для клеток галофитов; Это означало, что соле-устойчивость галофитов определялась бы биохимическими адапта-циями, то есть способностью модифицированных макромолекул эффективно осуществлять, функции в условиях окружения с высоким содержанием ионов. Ярким примером таких адаптации являются белки: галобактерий, характеризующиеся высоким содержанием глкь таминовой и аспарагиновой аминокислот и вследствие этого несу- щие отрицательный заряд. Эти белки могут нормально функционировать только в присутствии высоких концентраций солей (Brown, 1964 ; Larsen, 1967 ; Хочачка,Самеро,І977 ; КашнерД98І);
Одним из подходов к исследованию биохимических механизмов устойчивости является сравнительное изучение влияния солей на активность ферментов in vitro , выделенных из различающихся по солеустоичивости растений. Для многих ферментов галофи-тов показано, что in vitro они обладают такой же чувствительностью, к ионам, как и аналогичные ферменты гликофильных растений, ішшвности малат дегидрогеназы, аспарат трансамина-эк, глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы: и изоцитрат дегидрогеназы, выделенных из галофитов. Atriplex spongiosa и Salicomia australis , а также из гликофита Phaseolus vulgaris , в одинаковой степени снижались при концентрациях NaCl в реакционной среде свыше 100 мМ ( Greenway, Osmond, 1972).. В дальнейшем подобные результаты, были получены- для многих других ферментов, выделенных- иа различающихся по солеустоичивости растений С Flowers, 1972а,Ъ ; Flowers, Hall, 1973;Flowers et al., 1976,1977).
В. некоторых случаях чувствительность ферментов, выделенных из гликофитов, была более высокой, чем у аналогичных ферментов галофитов. Так, активность in vitro пероксисомной гликолат оксидазы. из солеустойчивого растения Salicomia europeau снижалась в несколько меньшей степени в присутствии NaCl , чем ИЗ неустойчивого Pisum sativum (Austerfeld, 1976) ; активность малат дегидрогеназы. из более солеустойчивого Spartina aiterniflora слабее подавлялась под влиянием UaCl , чем ИЗ менее солеустойчивого Spartina patens ( Getys et al., 1980). Однако, следует отметить, что эти различия не были существенными.
Действие facl на фотосинтетическую активность водорослей Dumliella ilf vivo и in vitro
Солеустойчивость растений может определяться биохимическими адаптациями- метаболизма к высокому содержанию соли в среде обитания (см.Введение и Г.І). Эффективное осуществление функций обмена веществ, при высоких концентрациях соли в клетке за счет биохимических адаптации будет компенсировать низкий уровень регуляции, внутреннего ионного состава- Это может достигаться несколькими путями: устойчивостью структуры макромолекул, участвующих в обмене, веществ, включением альтернативных путей в целях метаболических реакций, синтезом защитных соединений. В противном случае в клетках галофильных растений следует ожидать, наличие мембранных, механизмов, поддерживающих ионный гомеостаз;
Идеальной моделью для исследования биохимических механизмов, устойчивости к Пасі могут являться клетки с интактной протоплазмой, но с модифицированными или повревденными клеточными мембранами, в результате чего ионы па внешней среды относительно свободно проникали бы во внутриклеточные компартменты. Сравнение действия солей на такие клетки из различающихся по содеустойчивости растении дало бы ответ на вопрос о наличии адаптации на биохимическом уровне. В настоящее время проведение таких экспериментов не представляется возможным;
Некоторым приближением к идеальной модели являются выделенные из клеток органеллы, действие НаСІ на функцию которых in vitro сравнивается с действием соли, на аналогичную функцию in vivo .
В качестве такой модели в наших-.экспериментах были использованы хлоропласти, как. органеллы, осуществляющие важнейшую функцию зеленого растения фотосинтез. При этом имеется возможность, сравнить, действие NaGl не только на реакцию Хилла хлорошіастов. из различающихся по солеустойчивости растений, но и сопоставить, влияние соли на фотосинтетическую активность интактных клеток, и выделенных хлоропластов.
class2 ТРАНСПОРТ КАТИОНОВ (К+, Na+, Н+) ЧЕРЕЗ ПЛАЗМАЛЕММУ ВОДОРОСЛЕЙ DMALIELLA class2 62
Распределение На+И К+ между клетками и внешней средой
В предыдущей главе было показано, что мембраны галофиль— ных водорослей защищают внутриклеточные системы, осуществляющие обмен веществ от действия высоких концентрации UaOl в среде. Эта функция может выполняться плазмалеммой основным линофильным барьером между протоплазмой и внешней средой, Воз-можноттакже, что реакции метаболизма, "чувствительные KNaCl " протекают в изолированных компартментах. Защитная роль в таком случае может принадлежать мембранам этих компартментов, например мембранам хлорошіастов. Для выяснения, роли плазмалем-мы. в солеустойчивости клеток галофильных водорослей исследовали зависимость концентраций ионов в протоплазме от концентрации NaCl в среде.
Для этого водоросли Dunaliella переносили, со среды культивирования на среды, отличающиеся от культуральной только колцентрациями NaCl . После 3-часовои инкубации в средах с различным содержанием тої (завершение второй фазы изменения объема в осморегуляторном процессе) определяли средние концентрации на іґ" в клетках, в расчете на клеточный объем.
Полученные зависимости! представлены- на рис.5 и 6. Водо росли D.maritima поддерживали внутриклеточное содержание їїа+ на уровне 0,15-0,20 М при концентрациях їїаСІ в среде от 0,35 до 1,3 М (рис.5); При более высоких концентрациях HaCl , чем 1,3 М, наблюдалось накопление ионов иа+ в клетках этого вида:. При наружной концентрации Пасі 2,5 М внутриклеточная концентрация 1Та+ достигала 1,0 М. Более солеустой-чивыж вид, D.salina способен поддерживать содержание На в протоплазме на таком же низком уровне, как и D.maritima » но в более широком интервале, внешних концентраций Had (1,0-3,0 M)v Накопление ионов Жа+ в клетках этой водоросли наблюдалось только при концентрациях Пасі в среде, превЕшающих 3,0 М. Внутриклеточная концентрация На+ у D.salina составляла 1,0 М, когда содержание NaCl в среде увеличивалось до 4,0 М. При концентрациях та ниже 1,0 М у D.salina и 0,35 М у D.maritima измерении внутриклеточного- содержания ионов провести не удалось, так как значительная часть клеток разрушалась вследствие гипоосмо,тического шока при разбавлении внешней среды. Указанные концентрации, по-видимому, являются нижними границами концентрационных интервалов у соответствующих культур, в которых может осуществляться осморегуляторный процесс.
Внутриклеточное содержание ионов К поддерживалось на уровне 0,10-0,15 М у обоих видов водорослей при всех значениях концентраций Naci , которые создавали в- среде (рис; б);
При измерении внутриклеточных- концентраций па+ у гало-фильных. объектов необходимо преодолеть затруднения, связанные с высоким содержанием ИаСІ в среде. Загрязнение клеток ионами внешней среды, может стать источником погрешности измерений. При определении содержания ионов в клетках водоросли могут быть предварительно подвергнуты, эффективной процедуре отмывания. При многократной отмывке водорослей Dunaliella растворами глицина были получены значения внутриклеточных концентрапий , значительно более низкие, чем в наших экспериментах ( Ehrenfeia, Cousin, 1982); Это, вероятно, обусловлено потерей части ионов На клетками, при многократных отмывках.
В основе другого метода, применяемого некоторыми авторами, лежит определение общего содержания ионов в концентрированной суспензии клеток (в среде -ь в клетках). Определив объем общей и межклеточной воды- в. суспензии и зная концентрацию, ионов в среде, рассчитывают содержание ионов в объеме внутриклеточной водд С Gimmler, Schirling, 1978; Ehrenfeld, Cousin, 1982). Этот метод включает этап центрифугирования клеток через слой силиконового масла или подобного вещества для отделения клеток от среды, в которой они первоначально находились. При попытках воспроизвести этот метод нами было обнаружено, что при центрифугировании водорослей Dunaliella через слой гидрофобной жидкости происходит концентрирование клеток на границе раздела гидрофобной и. гидрофильной фаз, после чего клеточный агрегат, проходя через гидрофобный слой, оседает на дно пробирки. Наши наблюдения показали, что процесс концентрирования клеток на границе раздела фаз сопровождается разрушением значительной части клеток. Разрушение клеток при использовании этого метода наблюдали и другие исследователи ( Ehrenfeld, Cousin, 1982) . При использовании данного метода были получены более высокие значения внутриклеточных концентраций На у Dunaliella (Gimmler, Schirling, 1978 ; Ehrenfeld, Cousin, 1982)", чем в наших- экспериментах-. Содержание а+ в. клетках возрастало пропорционально увеличению концентрации НаСі в среде. Этот результат мог быть обусловлен адсорбцией а+ из раствора разрушенными клетками, тем больший, чем выше была наружная концентрация HaCl .
Поглощение ионов калия и эффект валиномицина
Одна из функции плазмалеммы в обеспечении солеустойчиво-сти растений может состоять в выведении избытка засоляющих ионов из протоплазма во внешнюю среду. Этот процесс осуществляется за счет энергии, выделяемой в реакциях метаболизма, то есть имеет место активны! транспорт. Энергозависимое выделение ионов наружу необходим для поддержания ионного гомеоста-за а протоплазме. Для того чтобы установить, является ли перенос ионов активным,, можно использовать критерий Нернста. Для определения значения градиента электрохимического потенциала ионов помимо концентраций: этих ионов по разные стороны мембраны необходимо знать величину электрического мембранного потенциала .
В связи с тем, что размеры клеток Dunaliella малы, применение микроэлектродной, техники для определения электри ческого потенциала на плазмалемме встречает серьезные затруд нения. Величину i можно оценить по отношению концентраций К в среде и протоплазме при условии равновесного распределения этого иона. Такой, подход был использован для оценки Б у Anacystia nidulans ( Dewar, Barber, 1973) И у бактерий Escherishia ooli (Padan et ai.f 1976) Заключение о распределении Kt на плазмалемме Dunaliella близком к равновесному было сделано на основании данных о влиянии ионофора валиномицина на транспорт этого иона;
В первой сериж опытов для изучения влияния валиномицина на транспорт Kt использовали к1"-де$ицитные водоросли. Чтобы получить, клетки с низким содержанием калия их подвергали ряду воздействий. Водоросли прочно удерживали внутриклеточный калий даже при экстремальных воздействиях; выдерживание клеток на среде без К наряду с резким изменением рК как в кислую, так и. в щелочную, стороны.; длительной инкубацией в растворах с различным осмотическим давлением; переносом на бессолевые среды; чередующимися гипо- и гипертоническими шоками. Kt-де-фицитные клетки могли быть получены только при. выращивании культура на среде без калия, В среднем содержание калия в полученных таким путем клетках D.maritima составляло 2Ї%\ D.saiina - 33$ от нормы (такое содержание Kj близко к нижней границе внутриклеточных концентраций этого иона, при кото рых поддерживается жизнедеятельность (Воробьев, 1980); Существенно; что концентрация На в протоплазме К -дефвдитных клеток Dunaiieiia сохранялась на уровне нормальных клеток (табл;6).
