Обоснование технологии фукоидана при комплексной переработке бурых водорослей дальневосточных морей Гурулева Ольга Николаевна

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 11

1.1 Бурые водоросли: распределение, запасы 11

1.2 Химический состав, структура и содержание фукоидана в водорослях

1.3 Физико-химические свойства и биологическая активность фукоидана

1.4. Методы выделения и очистки фукоидана 28

ГЛАВА 2. Объекты и методы исследований 37

2.1 Методический подход к организации исследований 37

2.2 Объекты исследований 3 8

2.3 Методы исследований 40

2.3.1 Методы выделения фукоидана 40

2.3.2 Фракционирование фукоидана методом ионообменной хроматографии

2.3.3 Определение молекулярной массы фукоидана 41

2.2.1 Спектрофотометрическое определение фукозы 42

2.2.2 Определение моносахаридного состава фукоидана 43

2.2.3 Определение содержания сульфатных групп в фукоидане 44

2.2.4 Расчет процента извлечения фукоидана из водорослей 45

2.2.5 Определение антибактериальной активности фукоидана 46

2.2.6 Определение липидкорригирующей активности фукоидана 46

2.3.10 Определение антиоксидантной активности фукоидана 47

2.2.10 Другие методы анализа 48

ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 49

3.1. Исследование химического состава бурых водорослей 49

3.1.1 Исследование содержания фукоидана в бурых водорослях 49

3.1.2 Исследование содержания фукоидана в бурых водорослях в зависимости от места произрастания

3.1.3 Исследование распределения фукоидана по слоевищу в зависимости от возраста водоросли и места сбора

3.1.4 Исследование моносахаридного состава промысловых и потенциально промысловых бурых водорослей

3.2 Разработка технологии фукоидана 65

3.2.1 Разработка технологии фукоидана из ламинарии японской 65

Влияние предобработки водорослей на извлечение фукоидана 65

Влияние экстрагента на извлечение фукоидана 67

Влияние концентрации кислоты и продолжительности экстрагирования на извлечение фукоидана

Влияние температуры и кратности экстрагирования на извлечение фукоидана

Влияние реагента при нейтрализации на извлечение фукоидана 76

3.2.1.1 Влияние условий экстрагирования на моносахаридный состав фукоидана

3.2.1.2 Сравнительный анализ фукоиданов, выделенных разными методами

3.2.1.3 Исследование фракционного состава фукоидана

Исследование фракционного состава фукоидана методом ионно-обменной хроматографии

Исследование молекулярно-массового распределения фукоидана 83

3.2.2 Получение фукоидана из фукусовых водорослей 87

3.2.3 Технологические режимы получения «Фукоидана» из бурых водорослей

3.3 Обоснование комплексной технологии переработки бурых водорослей

3.4 Технико-экономические показатели промышленного производства «Фукоидана»

3.5 Оценка биологической активности «Фукоидана» . 102

3.5.1 Антибактериальная активность 102

3.5.2 Липидкорригирующая и антиоксидантная активность 103

3.5.3 Гепатопротекторная и иммуномодулирующая активность 107

Выводы

Список использованной литературы 112

Приложения 134

• Химический состав, структура и содержание фукоидана в водорослях
• Фракционирование фукоидана методом ионообменной хроматографии
• Исследование содержания фукоидана в бурых водорослях в зависимости от места произрастания
• Обоснование комплексной технологии переработки бурых водорослей

Введение к работе

Актуальность темы.

В настоящее время на основании исследований отдельных групп населения выявлены ранее мало известные факторы питания, способствующие улучшению здоровья населения и снижению риска многих заболеваний. Было определено, что биологически активные добавки к пище, как дополнительные источники макро- и микронутриентов, приобретают все большую значимость (Корзун, 2002; Пилат и др., 2002; Абрамова, 2002; Корзун 2003; 2005). Среди большого разнообразия этой продукции, присутствующей на российском рынке, в последнее время постоянно увеличивается ассортимент БАД, содержащих бурые морские водоросли, которые богаты самыми разнообразными биологически активными веществами (Гаппаров и др., 2002; Тутельян, 2003; Шендеров, 2003; Зилова, 2005).

Полисахариды водорослей - одни из наиболее популярных биологически активных веществ, обладающих многофункциональностью воздействия на организм человека. Механизм их действия недостаточно изучен, но все они в большей или меньшей степени влияют на обмен липидов, глюкозы, минеральных элементов, обладают антиоксидантной активностью, иммуномодулирующем эффектом.

В настоящее время внимание ученых привлекли сульфатированные гетерополисахариды бурых водорослей - фукоиданы. При участии в молекулярном межклеточном взаимодействии они могут являться блокаторами широкого диапазона биологических процессов. Фукоиданы обладают противоопухолевым, противовирусным, антикоагулянтным, противовоспалительным, контрацептивным и иммуномодулирующем действием, а также антипролиферативным эффектом. Следовательно, производство лечебно-профилактических продуктов, содержащих фукоидан, может значительно расширить арсенал немедикаментозных средств профилактики многих заболеваний.

Фукоидан находит широкое применение в пище, напитках, приправах, косметике и медикаментах, за счет его биологической активности (Пат. ЕР 1327448; Запорожец и др, 1991; Пат. JP 2002265370). Так, было разработано антибактериальное ранозаживляющее средство «Фумагол», где в качестве активного агента был использован фукоидан из бурой водоросли Fucus vesiculosus (Пат. РФ 2003110694). Полисахарид из Laminaria saccharine/ также используют в качестве противовоспалительного и иммуномодулирующего агента в линии Balance испанской профессиональной косметики Belnatur (производитель — компания BCN Cosmetics). Одним из компонентов антицеллюлитного крема «Сплат» и средства для полости рта «Морская звезда» также является фукоидан

В настоящее время только фирма "Sigma" производит фукоидан как..., реактив из бурой водоросли Fucus vesiculosus. Фукоидан является одним из компонентов некоторых БАД (биологически-активных добавок), таких как «Суполан», «Маривид», «Ламиналь», «Ламэкс», а также БАД «Фукусовый», которые являются полисахаридными комплексами. Однако производство фукоидана как отдельного компонента, выделенного из водорослей, в виде БАД з России отсутствует.

В Дальневосточных морях сосредоточены огромные запасы бурых водорослей, представленные не одним десятком видов. В литературе встречаются противоречивые данные по химическому составу и содержанию фукоидана в водорослях (Усов и др., 1985; Zvyagintseva et.al., 1999; Усов и др., 2001; Шевченко и др., 2005). Поэтому выбор сырья для получения этого полисахарида возможен только на основании исследований и систематизации данных по его количеству.

При существующих в России технологиях переработки водорослей основная часть фукоидана, хорошо растворимого в воде и разбавленных кислотах, экстрагируется и теряется в процессе первичной обработки. В связи с этим актуальной является разработка технологии фукоидана из водорослей при их комплексной переработке, что позволяет сочетать его

7 производство с получением альгинатсодержащих и иодсодержащих продуктов.

Цели и задачи исследования

Целью работы является исследование содержания и состава фукоидана в бурых водорослях ДВ морей и разработка технологии его получения как составной части комплексной переработки водорослей.

В соответствии с поставленной целью определены следующие задачи:

— провести исследования содержания и состава фукоидана бурых
водорослей дальневосточных морей и обосновать выбор сырья для получения
полисахарида;

— обосновать выбор экстрагента и условия извлечения фукоидана из бурых
водорослей;

обосновать технологию получения фукоидана из бурых водорослей;

показать возможность получения фукоидана в одном технологическом цикле при получении альгинатсодержащих и других продуктов;

— провести исследования моносахаридного и фракционного состава
фукоидана, определить его молекулярную массу;

— оценить биологическую активность полученного «Фукоидана».

Научная новизна работы.

Впервые систематизированы данные по содержанию фукоидана в 26 видах бурых водорослей из разных районов дальневосточных морей, причем 6 видов водорослей исследованы впервые. Показано, что более 10 видов бурых водорослей ДВ морей могут быть использованы в качестве сырья для получения фукоидана.

Исследована зависимость количества фукоидана в водорослях от места их произрастания, возраста и части слоевища. Установлено, что максимальное количество фукоидана накапливается на второй год развития водоросли в верхней части слоевища. Показано, что его содержание увеличивается с ростом температуры поверхностных вод в месте произрастания водоросли.

8 Впервые из бурых водорослей Cystoseira crassipes (Turn.) Ag. и Sargassum miyabe Yendo выделены фукоиданы и определен их химический состав.

Установлено влияние технологических параметров на моносахаридный состав и степень сульфатирования фукоидана в процессе экстрагирования.

Обоснованы рациональные параметры кислотного экстрагирования, обеспечивающего максимальное извлечение высокомолекулярного фукоидана из ламинарии японской, обладающего разнообразной биологической активностью.

Научно обоснована возможность получения фукоидана при комплексной переработке водорослей, предусматривающей производство и других биологически активных добавок к пище.

Предложены новые показатели, характеризующие процесс экстрагирования фукоидана, - степень извлечения и эффективность экстрагирования.

Практическая значимость работы.

Усовершенствована технологическая схема переработки бурых водорослей, включающая получение в одном технологическом цикле фукоидана, а также йод- и альгинатсодержащих БАД. Данная технология позволяет повысить рентабельность производства, а также расширить перечень продуктов, обладающих биологической активностью, за счет выделения фукоидана из кислотных экстрактов, являющихся отходами производства. Состав БАДов и их технология защищена Патентом РФ № 2233104 «Способ комплексной переработки бурых водорослей с получением йодсодержащих и полисахаридных продуктов».

По результатам медико-биологических испытаний фукоидан рекомендован к использованию в качестве биологически активной добавки к пище.

Разработаны нормативные документы: ТУ 9284-305-00472012-06 -«Фукоидан. Биологически активная добавка к пище»; ТИ № 36-305-06 по изготовлению биологически активной добавки к пище «Фукоидан».

9 Реализация результатов исследования.

На экспериментальном технологическом производстве ФГУП «ТИНРО-Центра» выпущены опытные партии БАД «Фукоидан» и установлена экономическая эффективность производства.

Апробация работы:

Материалы диссертации представлялись на Всероссийской конференции молодых ученых, посвященной 140-летию со дня рождения Н.М. Книповича (Мурманск, 2002 г.); Международной научно-практической конференции «Современные проблемы торговли, расширение ассортимента и контроля качества потребительских товаров и продуктов общественного питания» (Санкт-Петербург, 2002 г.); Всероссийской конференции молодых ученых ТИНРО-Центра «Комплексные исследования и переработка мореких-и пресноводных гидробионтов» (Владивосток, 2003 г.); Международной конференции «Рациональное природопользование и управление морскими биоресурсами: экосистемный подход» (Владивосток, 2003 г.); XVIIIth International seaweed symposium (Norway, 2004 г.); IX Дальневосточной конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, 2005 г.); The Fourth Asia Pacific Phycological Forum (Bangkok, 2005 г.).

Публикации.

Основное содержание диссертационной работы изложено в 16 публикациях, в том числе 3 статьях, 12 материалах конференций, патенте.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения и 3 глав, включает 25 таблиц и 28 рисунков, изложена на 142 стр. Содержит 5 приложений, в которых приведены нормативная документация, патент, акты о выпуске опытных партий. Список литературы состоит из 204 источников (в том числе 121 иностранных).

Основные положения, выносимые на защиту.

Содержание фукоидана в бурых водорослях зависит от вида водоросли, ее возраста и места произрастания.

Концентрация кислоты и гидромодуль, а также продолжительность экстракции влияют на выход фукоидана и его моносахаридный состав. От температуры экстракции зависит содержание фукозы и степень сульфатирования полисахарида.

Разработанные условия экстрагирования фукоидана позволяют получать несколько биологически-активных добавок в одном технологическом цикле.

и ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Бурые водоросли: распределение, запасы

Мировая добыча и использование в коммерческих целях морских водорослей, в первую очередь на производство полисахаридов, постоянно растет. Известно, что мировой сбор макрофитов достигает 11,35 млн.т. в год. Из них 10,13 млн.т. выращивают преимущественно в море на плантациях, а 1,22 млн.т. добывают из естественных зарослей. Мировая добыча бурых водорослей из естественных зарослей составляет около 670 тыс.т. (Шевченко, 2005). В России добыча бурых водорослей в основном ведется из естественных зарослей на Дальнем Востоке и Севере и составляет около 30 тыс.т., в то время как в Китае добывается около 2,2 млн.т бурых водорослей; основная доля которых приходится на марикультуру (Промысловые и перспективные..., 1998).

Бурые водоросли, как правило, типичные обитатели холодных и умеренных климатических зон. В бассейнах с океанической или близкой к ней соленостью (Баренцево, Белое, Охотское, Японское моря) флора водорослей значительно богаче, чем в морях с низкой соленостью (Азовское, Каспийское, Балтийское) (Гарибова и др., 1978).

Северные моря - Белое и Баренцево - характеризуются разнообразной флорой. Литоральную зону здесь населяют обычно бурые водоросли из порядка фукусовых (Fucales), которые представлены следующими видами: Fucus vesiculosus, Fucus distichus, Fucus serratus и Ascophyllum nodosum. Общий запас основных видов бурых водорослей Белого моря составляет 19,8 тыс.т. Доминирующим видом является F. vesiculosus, составляя 79 % от общего количества водорослей, остальное приходится на долю A. nodosum (Гарибова и др., 1978; Пронина, 2005). Среди порядка ламинариевых (Laminariales) преобладают виды хорды (Chorda), ламинарии (Laminaria), алярии (Alaria).

12 В Черном море с его относительно малой прозрачностью воды, наличием сероводородной зоны и значительным опреснением ламинариевых водорослей нет совсем, фукусовые представлены Cystoseira barbata и Cystoseira crinita (Гарибова и др., 1978; Шевченко, 2005). По экспертной оценке общий запас данных видов водорослей у Российских берегов составляет около 85 тыс.т. (Вилкова, 2005)

Альгофлора Азовского и Каспийского морей еще беднее черноморской, из крупных бурых водорослей растет лишь С. barbata (Гарибова и др., 1978). В морях Дальнего Востока произрастает более 200 видов бурых водорослей (Гусарова и др., 2000), заросли которых образуют водорослевые пояса вдоль всего дальневосточного побережья, особенно у Курильских островов (о. Кунашир, Шикотан) и островов Малой Курильской гряды, в Охотском море (у Шантарских островов), в Восточно-Камчатской зоне и в Лионском море (Приморье, Западно-Сахалинская зона).

Камчатский промысловый район (Рис. 1) по общим запасам ламинариевых водорослей занимает одно из ведущих мест на Российском-Дальнем Востоке, особенно Каррагинская подзона, где биомасса промысловых видов составляет 180 тыс.т (Прогноз общих допустимых уловов..., 2005). Однако вплоть до последних лет водорослевые ресурсы Камчатки по разным причинам не использовались (Королева и др., 2002). Кроме наиболее массовых видов камчатского региона - Laminaria bongardiana и Laminaria gurjanovae широкое распространение и значительные запасы имеет Fucus evanescens (Клочкова, Березовская, 1997).

Курильские острова (Рис.1) отличаются самыми крупными на Дальнем Востоке запасами промысловых видов водорослей - 289,7 тыс. т (Прогноз общих допустимых уловов..., 2005). Основное количество видов представлено водорослями из семейства ламинариевых, объединенных под общим названием «морская капуста» - Laminaria japonica, Laminaria angustata, Cymatherefibrosa, Cymathere japonica (Евсеева, 2005).

13 Растительные ресурсы северо-охотоморского побережья в прибрежных зонах Магаданской области и Хабаровского края (Рис. 1) содержат огромные запасы Cystoseira crassipes - более 800 тыс.т (Суховеева, 1976; Суховеева, Подкорытова, 2006). Однако промысел водоросли в данных районах не ведется в связи с ее значимостью как нерестового субстрата сельди.

1- Побережье Камчатки; 2-Прибрежье северных Курильских островов; 3-Южные Курильские острова; Охотское море 4- Восточно-Сахалинская подзона; 5-12 мильная прибрежная зона Магаданской области; 6-Западная Камчатка; 7-12 мильная прибрежная зона Хабаровского края; Японское море 8- Западно-С ахал и некая подзона; 9- Татарский пролив (12-мильная прибрежная зона севернее мыса Золотого); 10- - Подзона Приморье (Южнее

_ю . ! ! . ₍ „! ₁ . ! ._._! _г ! _,

120 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180 МЫСЗ ЗОЛОТОГО).

Рис. I Районы распространения бурых водорослей на Дальнем Востоке

В прибрежных водах о. Сахалин (Рис. 1) L. japonica составляет основу зарослей. На сегодняшний день запасы водоросли в традиционных районах промысла и потенциально промысловых насчитывают около 73 тыс.т (Балконская и др., 2005; Прогноз общих допустимых уловов..., 2005).

Массовыми видами побережья Приморья (Рис. 1)-являются бурые водоросли: L. japonica, Costaria costata, С. crassipes. По данным съемки 2004 г. общие запасы фитомассы промысловых и потенциально промысловых растительных ресурсов у побережья Приморья составили 130-150 тыс.т., из них 65 тыс.т. приходится на L. japonica, 14,8 тыс.т. - на С. costata, 1,0 тыс.т. -С crassipes (Кулепанов и др., 2005). В Приморье основные промысловые заросли бурых водорослей сконцентрированы в районе от мыса Поворотного

14 до мыса Бычьего (Кизеветтер и др., 1981; Клочкова, Березовская, 1997; Балконская, 2001; Евсеева, 2001; Тарасюк и др., 2001; Трофимова, Козлов 2001; Аминина, Клочкова, 2001; Болдырев, Солодовников, 2001; Подкорытова, Суховеева, 2002; Прогноз общих допустимых уловов..., 2005)

В целом запасы ламинариевых водорослей, обладающие промысловыми запасами, в Дальневосточном регионе оцениваются в 725 тыс. тонн, их допустимый объем вылова (ОДУ) на 2005 г составил 173,05 тыс.т. (Прогиоз общих допустимых уловов..., 2005). Однако добыча бурых водорослей идет в очень малых масштабах. Так, в 2002 г при прогнозе 150,5 тыс.т добыто 7,2 тыс. т, в 2003 г - соответственно, 169 тыс.т и 6.6. тыс.т, в 2004 г - 160 тыс. т и 8,8 тыс. т (Прогноз общих допустимых уловов..., 2005). Наиболее массовыми промысловым видами на Дальнем Востоке среди ламинариевых являются L. japonica, L. gurjanovae, L. bongardiana, среди фукусовых - С. crassipes и F. evanescens. Несмотря на это, только L. japonica добывается в промышленных масштабах. Эта водоросль имеет двухлетний цикл развития, отмирает на втором году жизни после летнего спороношения и достигает наибольшей массы в июне-июле второго года жизни. Промыслом используется только двулетняя водоросль. Период созревания и оптимальной ценности слоевищ весьма непродолжителен, поэтому при сборе водорослей существует страда, требующая максимальной интенсивности труда при заготовке водорослей (Кизеветтер и др., 1981; Подкорытова, Шмелькова, 1983). Таким образом, Дальневосточный регион обладает значительными запасами бурых водорослей, которые практически не используются. По биомассе, плотности поселения и доступности для промысла практическое значение для промышленной переработки имеют следующие виды: L. japonica, L. gurjanovae, L. bongardiana, С. crassipes и F. evanescens.

15 1.2 Химический состав, структура и содержание фукоидана в водорослях

Химический состав водорослей сложен и разнообразен. Водоросли синтезируют большое количество различных соединений, основное количество которых приходится на полисахариды. Бурые водоросли существенно отличаются по структуре веществ полисахариднои природы от водорослей других отделов и от наземных растений (Painter, 1983). Резервным материалом в них служит маннит и сравнительно низкомолекулярные (3-1,3, 1,6-глюканы - ламинараны. Главными компонентами биомассы бурых водорослей являются альгинаты и сложные сульфатированные полисахариды - фукоиданы.

Впервые фукоидан был выделен Килином (Kylm 1913) из Laminaria-digitata и F. vesiculosus и назван фукоидином по его основному моносахариду - L-фукозе, обнаруженному в гидролизате. Затем в 1950 г. этот полисахарид был получен Персивалем и Россом (Percival, Ross, 1950) из некоторых бурых водорослей. В дальнейшем его стали называть фукоидан (McNeely, Pettitt, 1973).

Фукоиданы представляют собой сульфатированные гетерополисахариды, построенные, главным образом, из остатков a-L-фукозы. Помимо фукозы в их составе обнаруживают другие моносахариды, а именно: D-ксилозу, D-галактозу, D-маннозу, D-глюкозу и D-глюкуроновую кислоту. В некоторых случаях фукоидан может содержать ацетильные группы, а также образовывать ковалентные связи с пептидными фрагментами (Усов и др., 1998).

Как правило, разветвленные молекулы этого полимера лишены элементов регулярности, что сильно затрудняет установление их химического строения. Еще в исследованиях Миана и Персиваля в 1973 г было показано, что фукозосодержащие сульфатированные полисахариды, синтезируемые бурыми водорослями, имеют сложный состав (Main, Percival, 1973).

Чаще всего фукоза в полисахариде является основным компонентом, ее содержание может колебаться от 11,5 до 97 % (Anno et al., 1966; Барашков, 1972; Patankar et al., 1993; Усов и др., 1994). Однако в фукоиданах из

некоторых видах водорослей фукоза была обнаружена лишь в небольших количествах - от 2 до 5 % (Main, Percival, 1973).

Галактоза в фукоидане обычно является минорным компонентом - не более 3-4 % (Mian, 1973; Hussein, 1975). Вместе с тем в фукоидане из L. angustata (Nishino et al., 1994), Ecklonia kurome (Nishino et al., 1991 b)_T Macrocystis pyrifera (Schweiger, 1962) галактоза является вторым моносахаридом. Из A. nodosum и Colpomenia sensuosa были получены фукоиданы с равным количеством фукозы и галактозы (Hussein, 1975; Medcalfetal., 1977).

Отношение фукозы к галактозе в полисахариде, даже в пределах одного вида, также может изменяться. Так, например, в фукоидане из L. japonica это отношение составляет 1 : 1,8 (Liu, Zhang, 1993), по другому источнику - 1 : 4,5 (Xue et al,, 2001).

Отношение галактозы к маннозе в нативном фукоидане из L. japonica составляет 9 : 2 и остается постоянным после слабого кислотного гидролиза, в отличие от фукозы. Поэтому было высказано предположение что, структура полисахарида состоит из галактозы и маннозы, а фукоза находится в боковых цепях, которые отщепляются в результате гидролиза (Xue et al., 2001). Остальные моносахариды в фукоидане находятся, в основном, в незначительных количествах.

Помимо основного моносахарида - фукозы, фукоидан также содержит эфирносвязаннуго серную кислоту. Содержание сульфатных групп в фукоидане составляет 27-38,3 % (Percival, Ross, 1950; Xueetal., 2001).

В фукоидане из L. japonica отношение сульфатных групп к фукозе составляет 1 : 1,5, а в некоторых случаях достигает 1: 3, особенно у растений в весенний период. Было высказано предположение, что сульфатные группы в полисахариде могут располагаться не только на фукозе, но и на других моносахаридах (Honya et al., 1999).

В фукоидане из F. vesiculosus было обнаружено, что только 10 % сульфатных групп являются щелочелабильными (СопсЫе, Percival, 1950), и

17 только сульфат в положении С-4 устойчив к действию щелочи (Doner,

Whistler, 1973).

Исследование пространственной структуры фукоидана началось с середины XX века, когда в 1950 г. Кончи и Персиваль после многократного метилирования в щелочной среде и мягкого гидролиза в щавелевой кислоте фукоидана из F. vesiculosus выделили из гидролизата метил фу козу, 3-метилфукозу и 2,3-ДИметилфукозу в отношении 1: 3: 1. На основании этого фукоидаиу Персиваль приписал формулу сернокислого эфира пшшфукозана с 1-»2 и 1->3 гликозидными связями и 4-О-сульфатированными фукопиранозными остатками (Percival, McDowell, 1967; Percival, 1968; Conchie, Percival, 1950). В 1959 г. Коте в результате слабого ацитолиза фукоидана из F. vesiculosus выделил не только 1-»2, но и 1-»4 - связанные-дисахариды (Cote, 1959).

Большая величина отрицательного значения удельного вращения от -75 до -140 свидетельствует о том, что все связи в фукоидане являются - а (Percival, Ross, 1950). В 1980 г это та.кже было подтверждено на примере фукоидана из Eisenia bicyclis (Usui et al,, 1980).

Водорослевые фукоиданы являются сложными гетерогенными молекулами, практически всегда лишенными регулярности (Pereira et al,, 1999). Лишь однажды из бурой водоросли F. distichus была выделена фракция высокосульфатированного фукоидана, спектр С-ЯМР которой соответствовал полисахариду, построенному из повторяющихся дисахаридных звеньев: -^3)- a-L-Fucp(2,4-di-S03")-(l -^4)- a-L-Fucp(2S0₃~)-(1 -» (Bilan et al._} 2004). Но и в этом случае химическими методами структурного анализа были найдены незначительные отклонения от предложенной регулярной структуры. Фукоиданы близкородственных фукусов, принадлежащих к одному порядку Fucales, имеют в основе молекул линейные цепи из чередующихся 3- и 4- связанных остатков a-L-фукопиранозы, однако их регулярность маскируется случайным характером сульфатирования и ацетилирования (Chevolot et al., 2001; Bilan et al., 2002). С

18 другой стороны, представители порядков Chordariales (Nagaoka, 1999) и Laminariales (Усов и др., 1998; Chizhov et al., 1999) ситензируют линейные полисахариды, построенные из 3- связанных остатков a-L-фукопиранозы. Для нескольких водорослевых фукоиданов были предложены разветвленные структуры (Chizhov et al., 1999; Nagaoka et al., 1999; Marais, Joseleau, 2001), однако присутствие большого количества сульфатных групп зачастую не позволяет точно установить положение и количество точек разветвления в полимере.

Несмотря на многочисленные работы по изучению структуры фукоиданов, она остается до сих пор неясной из-за отсутствия регулярности и наличия многочисленных минорных компонентов (пентоз, гексоз, уроновых кислот, белков). В настоящее время продолжаются работы по-установления структуры фукоидана из разных видов водорослей. При этом в большинстве случаев фукоиданы представляют как полисахариды с 1^3-связанной основой, разветвленные в положении 1->-2 и сульфатированные по С-4 (Рис. 2) (Patankar, 1993; Nishino, 1994; Nagaoka, 1999; Mulloy, 1994; Chizhov, 1999). Тем не менее для каждого вида водоросли определяется своя первичная структура.

л О. О—

-o₃s6 ^л *

—он

Рис. 2 Схема фукоидана с 1->3-связанной основой, разветвленного в положении 1->2 и сульфатированного по С-4

Фукоиданы присутствуют во внутриклеточных структурах, а также межклеточных пространствах водорослей (Black, 1954; Callow, Evans, 1976).

19 Обнаруживают фукоидан \и в капельках, выделяющихся на поверхности слоевищ L. digitata (Doner, Whistler, 1973), A. nodosum (Dillon et a]., 1953), M. pyrifera (Schweiger, 1962). Анализ глубинных слоев талломов Laminaria saccharina с помощью электронного микроскопа показал, что сульфатированные полисахариды локализуются в секреторных каналах, в середине клеточных стенок, в секреторных каналах аппарата Гольджи, а также на поверхности слоевища (Callow, Evans, 1976).

Физиологическая роль фукоидана до сих пор не совсем понятна. Во-первых, они могут включаться в электролитический гомеостазис, т.к. они являются анионитами. Во-вторых, как компоненты клеточной стенки, полидисперсные молекулы фукоидана придают силу и гибкость таллому водоросли (McLellan, Jurd, 1992). Благодаря своим гигроскопичным свойствам фукоидан, удерживая влагу, препятствует сильному осушению незащищенных от воздуха водорослей в нижней точки отлива (Black, 1954).

Разные виды бурых водорослей отличаются по составу и содержанию фукоиданов, а полученные данные часто расходятся друг с другом (Табл. 1}.-Например, количество фукозы, определенное одним методом, при пересчете на фукоидан не совпадают (Табл. 1). Также в некоторых работах (Усов и др., 1985; Zvyagintseva etal., 1999; Шевченко и др., 2005) указывается количество фукозы или фукоидана в водорослях после обработки их спиртом (Табл. 1), при этом не приводится количество удаленных низкомолекулярных веществ, что не позволяет оценить истинное содержание фукоидана в водоросли.

Наиболее богатым источником фукоиданов являются представители порядка Fucales (Усов и др. 1998; Encyclopedia Natural Products, 2000). В настоящее время фирма "Sigma" производит фукоидан только из F. vesiculosus. На нем проводят большую часть работ по изучению структуры и биологической активности. Водоросли порядка Larainariales, добываемые в крупных масштабах, также могут служить эффективным источником фукоиданов (Maruyama et al., 1987; Grauffe] et al., 1989; Kitamura et al., 1991;

20 Усов, Кирьянов, 1994), например, L. saccharina (Усов и др., 1998), L. cichorioides (Усов, Кирьянов, 1994) и I. japonica (Honyaetal., 1999).

Таблица 1

Содержание фукоидана и фукозы в бурых водорослях, %

Продолжение таблицы 1

примечание:

* - в расчете на водоросль после удаления низкомолекулярных веществ и липидов; х¹ - спектрофотометрический метод по реакции фукозы с L-цистеином и серной кислотой (Dische etal., 1948); х² - по выходу фукоидана; х³-ГЖХ анализ.

Были замечены сезонные изменения содержания фукоидана в бурых, водорослях (в родах Laminaria, Fucaceae, Chordaria) от 5 до 20 % (Encyclopedia Natural Products, 2000). Максимальное содержание фукоидана было отмечено в осенне-зимний период (O'Colla et al., 1962). В некоторых работах было отмечено что, количество фукоидана в биомассе фукусовых водорослей не претерпевало значительных изменений в зависимости от времени года. Так у F. vesiculosus содержание фукоидана в августе составляло 14,7 ± 1,7 %, в декабре 10,0 ± 1,8 %, в апреле 12,1 ± 1,1 %. A. nodosum содержал меньше всего фукоидана - 11,5 ± 2 %, при этом изменений в его содержании практически не происходило (Облучинская, 2002).

22 Японскими учеными было установлено, что содержание фукоидана в культивируемой L. japonica увеличивается почти параллельно с ростом водоросли с апреля по август от 2,2 % до 3,3 %, соответственно. К октябрю начинается разрушение слоевищ и созревание спорангиев, при этом содержание фукоидана увеличивается в два раза по сравнению с ювенальными растениями (Honya et al., 1999). Такие изменения в содержании фукоидана являются не столь высокими, как маннита и ламинарана у L. digitata (Haug, Jensen, 1956) и L. japonica (Honya et al., 1993). Вероятно, такие различия связаны с различными физиологическими функциями полисахаридов в водорослях (Honya et al., 1999).

Было отмечено, что различие в географическом положении водоросли в первую очередь сказывается на накопление резервных веществ водоросли, г. маннита и ламинарана, но в гораздо меньшей степени влияет на содержание фукоидана (Усов и др., 1998).

Родственные фукоиданам вещества также были обнаружены у иглокожих (Ribeiro et al., 1994; Muloy et al., 1994; Alves et al., 1997; Регеіґа et al., 1999). В отличие от фукоиданов водорослей, полисахариды иглокожих имеют более простую структуру, которая представляет собой регулярно сульфатированную линейную цепь (Pereira et al., 1999). Отличия наблюдаются лишь в степени сульфатирования и позиции гликозидных связей в зависимости от вида иглокожих.

Таким образом, несмотря на многочисленные работы по исследованию структуры, составу и содержанию фукоидана бурых водорослей, необходимо отметить, что сведений этих недостаточно, данные часто весьма противоречивы и остается еще очень много пробелов в этом направлении исследований. Поэтому исследования по содержанию фукоидана в бурых водорослях необходимо проводить систематически как для сбора информации, так и для разработки рекомендаций по добыче водорослей для промышленного получения фукоидана.

23 1.3. Физико-химические свойства и биологическая активность фукоидана

Состав и свойства фукоидана, а также его биологическая активность, зависят от структурных особенностей полисахарида, которые определяются видом водоросли (Patankar, 1993; Usov, 1998; Nagaoka, 1999).

Фукоидан представляет собой гигроскопичный порошок, способный образовывать коллоиды (Encyclopedia Natural Products, 2000). Полисахарид in vivo не токсичен и не вызывает морфологических изменений внутренних органов при употреблении его в количестве 300 мг/ кг в течение 6 месяцев (Nagaoka et al., 1999; Пат, JP 2002265370; Li et al., 2005). В опытах на белых крысах при пероральном введении установлено LD50 5000 мг/кг для фукоидана из L. saccharina и L. digitata (Пат. РФ 2028153), а из L. japonica - 10000 мг/кг (Пат. РФ 2019186 С1); при внутривенном - 1000-500 мг/ кг (Пат. РФ 2019186 О), что и позволило отнести данное вещество к группе нетоксичных веществ (Березовская, 2003).

Изучение реологических свойств растворов природных фукоиданов бурых водорослей показало, что растворение полисахаридов в воде вызывает значительное повышение вязкости, но гелеобразования не происходит вплоть до концентрации 25 %о. Фукоиданы с большей молекулярной массой и степенью сульфатирования образуют более вязкие растворы (Щипунов и др,, 2000).

Данные по определению молекулярной массы фукоиданов в литературе встречаются нечасто. Вероятно, молекулярная масса фукоиданов, полученных из разных видов водорослей, зависит от вида водоросли и способа получения и колеблется от 850 кДа -A. nodosum (Grauffel et al., 1989) до 20-30 кДау Е. kurome (Nishino et al., 199Id). Еще в 70-х годах было отмечено непостоянство молекулярной массы фукоидана, полученного из F. vesiculosus (Doner, 1973). Даже для одного вида водоросли предлагают разные значения молекулярной массы, например, по измерению осмотического давления (Doner, Whistler, 1973) - 133 + 20 кДа, а по методу ультрацентрифугирования - 78 кДа (Bernardi, 1962).

24 Фукоиданы и их низкомолекулярные фрагменты обладают широким спектром биологического действия. Они могут бытв успешно использованы в комплексной терапии многих заболеваний (McClure et al., 1992; Soeda et al., 1994; Mauray et al, 1995; Angstwurm et al, 1995). Установлено, что фукоидан из L. japonica с молекулярной массой менее 15 кДа не вызывает симптомов острой токсичности или каких либо нарушений морфологии внутренних органов (Пат. РФ 2019186 С1). Поэтому предложено использовать в терапии тромбозов кровеносных сосудов фукоидан с молекулярной массой около 10 кДа (Пат. WO 115654 А2; Пат. РФ 2019186 CI).

Фукоиданы морских водорослей обладают антикоагулянтной (Chargaff et al, 1936; Maruyama et al., 1987; Nishino et al., 1989; Dobashi et al., 1989; Church et al., 1989; Nishino et al., 1991a; Nishino et al., 1991b; Kitamura et al,,,.. 1991; Colliec et al., 1994; Кузнецова и др., 2003) и антитромбиновой активностями (Mauray et al., 1995), а также фибринолитическими свойствами (Maruyama et al., 1987; Soeda et al, 1992). Эти свойства являются весьма важными для профилактики тромбоэмболии, являющихся осложнениями многих заболеваний и хирургических вмешательств, а также для профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний (Беспалов и др., 2000).

Впервые высокая антикоагулянтная активность фукоидана была установлена для фукоидана из Eisenia bicyclis на плазме овцы (Usui et ah, 1980), как 54 IU/мг (международные единицы/мг (United States Pharmacopoeia, XVI, 317)), что соответствовало 40 % активности промышленного гепарина (140 единип/мг). В настоящее время считается, что фукоидан является более эффективным препаратом, чем гепарин (Religa et al., 2000).

Фукоиданы обладают онкопротективными свойствами (Lizima-Mizui et al, 1985; Maruyama et al., 1987; Nagumo et al., 1988; Riov et al., 1996; Usui et al., 1980). Установлена связь между антиметастатическим эффектом фукоиданов и их способностью ингибировать эндогликозидазную активность опухолевых клеток, которая способствует миграции последних в здоровые

25 ткани. Наряду с этим они ингибируют пролиферацию фибробластов (Ferrao et al, 1993) и разрастание в сосудистой системе клеток гладких мышц (McCaffrey et al, 1992; Logeart et al., 1997).

Фукоидан ингибирует цитопатическое действие вируса везикулярного стоматита, поверхностного антигена вируса гепатита В, цитомегаловируса, вируса Африканской свиной лихорадки (Baba et al., 1988; McClure et a]., 1992), генитального герпеса (Zeitlin et al., 1997). Исключительно важными являются результаты работ, указывающие на способность ингибировать активность нативного и рекомбинированного вируса человеческого иммунодефицита in vitro (Baba et al., 1988; Быковский и др., 1995; Beress et al., 1996; Schaeffer et al., 2000). Причем ингибирующий эффект фукоидана из L. japonica в отношении ВИЧ-инфекции in vitro проявлялся уже через неделю при добавлении раствора полисахарида концентрацией 1 мкг/ мл к вируссодержащей культуре (Пат. РФ 2019186 СУ).

Известно, что прикрепление бактерий и колонизация ими эпителиальных клеток является первым звеном в развитии большинства инфекции (Езепчук, 1985). Фукоиданы из бурых водорослей проявляли антибактериальную активность по отношению к Bacillys subtilis, Staphylococcus aureus (Запорожец и др, 1991), Acinetobacter Iwoffi и Esherichia coli (Беспалов и др., 2000), Helicobacter pylori (Shibata et al, 1998; Shibata et al., 1999). Антибактериальное действие данных полисахаридов сохранялось и по отношению к бактериям, имеющим устойчивость ко многим антибиотикам (Запорожец и др, 1991). Причем, в условиях in vitro уже через 15 мин контакта 0,5 % раствора фукоидана с взвесью исследуемых микроорганизмов погибают практически все Е. coli (96,1 %), через 30 мин - К pseudotuberculosis (99,8 %), спустя 2 ч - S. typhimurium (99,6 %) и S. aureus (84,2 %) (Запорожец и др, 1991). В тоже время фукоидан оказывает позитивное воздействие на кишечную микрофлору и нормализует функции желудочно-кишечного тракта (Fujii et al, 1992; Kuda et al., 1998).

26 Фукоидан обладает противовоспалительным эффектом за счет взаимодействия с Р- и L-селектином in vitro, а также способен ингибировать экстравазацию лейкоцитов при экспериментальном перитоните у крыс (Preobrazhenskaya et al., 1997; Семенов и др., 1998). Ингибирующая активность фукоидана на два порядка величин превышает таковую гепарина. Минимальная доза фукоидана, ингибирующая выход нейтрофилов, составила 0,8 мг на крысу, наилучший ингибиругощий эффект достигался в первые 15 мин. Значительный эффект (около 80 % ингибирования) наблюдался также при введении через 1,5 часа, через 2,5 часа заметного ингибирующего действия не наблюдалось. Можно предположить, что фукоидан блокирует воспаление на ранней стадии его развития за счет взаимодействия с Р-селектином (Семенов и др., 1998).

Фукоиданы являются ингибиторами взаимодействия сперматозоидов с клеточным эпителием яйцеклетки (Bolwell et al., 1979; Ahuja, 1982; Mahony et al., 1993; Oehmnger et al., 1998).

Сообщается об антиоксидантних свойствах фукоидана (Anggadiredja et" al., 1997; Tutour et al, 1998; Xue et al, 1998; Xue et al, 2001), причем полисахариды с большей молекулярной массой обладают более сильным антиокислительным эффектом (Xue et al, 2001). Фукоидан также обладает иммунологической активностью (Незговоров и др., 2005).

Проявление биологической активности фукоиданов связывают со степенью сульфатирования (Nishino et al, 1989; Kitamura et al, 1991), структурными особенностями (Nishino et al, 1987; Nishino et al, 1989; Nishino et al, 1991 a; Nishino et al, 1991b) и молекулярной массой (Nishino et al, 1991 с d; Nagumo, Nishino, 1996).

Антикоагулянтные свойства фукоидана, главным образом, зависят от сульфатных групп, расположенных на фукозных единицах (Nishino et al, 1991b), а также от степени сульфатирования полисахарида (Розкин и др., 1989; Nishino, Nagumo, 1991а; Chevolot et al, 1999; Pereira et al, 1999; Soeda et al, 2000). Только фукоиданы с отношением сульфатных групп к общему

27 содержанию Сахаров выше, чем единица, проявляют значительную антикоагулянтную активность (Nishino et al., 1991 b), а фукой даны с содержанием сульфатных групп меньше 20 % не проявляют таковую (Haroun-Bouhedja et al., 2000). Причем, для проявления активности необходимо присутствие сульфатных групп в положениях 0-2 и иногда в О-З (Chevolot et al., 1999). Эти данные подтверждают ранее опубликованные данные по фукоиданам и из других видов бурых водорослей (Nishino et al., І 991 с). Антипролиферативная активность фукоидана также зависит от степени сульфатирования полисахарида. Оптимальная концентрация сульфатных групп, необходимая для уменьшения клеточных пролиферации аденомокарциномы и клеток гладких мышц составляет 20 %. Данный эффект низкомолекулярных фукоиданов наблюдался даже при низкой концентрации (0,1 мкг/мл) и увеличивался с ростом содержания сульфатных групп, а также дозы, достигая максимального ингибирования (90-100 %) при концентрации 1000 мкг/мл. При содержании сульфатных групп ниже 20 % антипролиферативная активность уменьшается, даже при высоких концентрациях: для полисахарида с содержанием сульфатных групп 12 % и 18,4 % при концентрации 1000 мкг/мл наблюдается 12 % и 40 % ингибирования, соответственно. Ингибирование роста клеток вообще не наблюдалось для данных фракций при низкой концентрации (ОД - 100 мкг/мл). Однако при уменьшении сульфатирования фукоидан сохраняет свою способность тормозить рост раковых клеток (Haroun-Bouhedja et al., 2000). Механизм действия полисахарида на пролиферацию клеток остается до сих пор неясным (Haroun-Bouhedja et al., 2000).

Антикоагулянтная активность фукоидана увеличивается с ростом молекулярной массы (Nishino, Nagumol991 a; Nishino et al., 1991 d). Наибольшая антикоагулянтная активность наблюдалась для полисахаридов с молекулярной массой 50-100 кДз (Dobashi et al., 1989; Grauffel et al., 1989; Nishino et al., 1991 с). В медицинский практике используют деградированные полисахариды с молекулярной массой около 10-30 кДа (Colliec et al., 1994;

28 Пат, WO 115654 А2; Пат. РФ 2019186 СІ) благодаря их низкой вязкости, хотя антикоагулянтная активность таких полисахаридов ниже. Однако даже низкомолекулярные полисахариды (20+5 кДа) превышают антикоагулянтную активность гепарина (стандартного образа сравнения) в 30 раз (Colliec et ah, 1994).

Антипролиферативная активность фукоиданов также зависит и от размера макромолекулярной цепи. Фукоиданы способны к ингибироваиию при молекулярной массе 13-19 кДа (Ellouali et al., 1994; Zhuang et al., 1995).

Таким образом, фукоиданы из разных видов водорослей обладают высокой биологической активностью, которая во многих случаях определяется составом полисахарида, его молекулярной массой.

1.4 Методы выделения и очистки фукоидана

Экстрагирование и очистка полисахаридов представляет собой трудную задачу. В природных условиях эти соединения находятся в виде сложных смесей с низкомолекулярными веществами, молекулами неуглеводной природы, наконец, с другими высокополимерными углеводами. Трудности возрастают в связи с тем, что, будучи весьма лабильными веществами, полисахариды под влиянием даже слабых воздействий легко подвергаются различным изменениям: часто происходят их деполимеризация, окисление и другие изменения (Денисова и др., 2001). Способ выделения полисахаридов должен удовлетворять основным требованиям: быть максимально эффективным, сопровождаться незначительными потерями на всех стадиях, особенно когда содержание выделяемого полисахарида в источнике невелико; в процессе выделения полисахарид должен подвергаться как можно меньшим изменениям; должен быть предусмотрен эффективный способ очистки биополимера (Кочетков и др., 1967).

Выделение и очистка фукоидана в основном проводится согласно следующим этапам:

1. сушка и измельчение водорослевого материала;

2. предобработка водорослей;

3. выделение фукоидана из водорослей экстрагирующим агентом;

4. очистка полисахарида.

Для удаления сопутствующих механических примесей, водоросли промывают в проточной или дистиллированной водах, высушивают и измельчают (Mian et al., 1973; Fujihara et al., 1984; Nagaoka et al., 1999).

Для предотвращения загрязнения экстрактов низкомолекулярными веществами зачастую водоросли обрабатывают 80 или 85 % водными растворами этанола (Mian et al, 1973; Carlberg et a)., 1978; Percivai et al., 1983; Finch et al., 1986) или метанола (Anno et al, 1966; Mori et al., 1982; Dobashi et al., 1989). За счет предварительной обработки водорослей спиртовыми растворами практически полностью устраняются низкомолекулярные. вещества (Anno et al., 1966; Mian et al., 1973). В некоторых случаях после спиртовой обработки водоросли еще дополнительно обрабатывали водным раствором формальдегида, для того чтобы полимеризовать вещества фенольной природы (Mian et al., 1973; Percivai et al., 1983; Carlberg et ah, 1978; Nishide, 1981; Finch et al., 1986). Для удаления низкомолекулярных веществ воздушно-сухую водоросль также обрабатывают смесью метанол -хлороформ - вода в соотношении 4:2:1 (Whyte et al., 1970; Усов и др, 1994). Иногда вместо предварительной спиртовой обработки для удаления низкомолекулярных веществ полученные экстракты диализуют против дистиллированной воды (Abdel-Fattah et al., 1973; Abdel-Fattah et al., 1975; Fujikawa et al., 1975; Abdel-Fattah et al., 1977; Lizima-Mizui et al., 1985).

Экстракция является основной стадией почти каждого процесса выделения полисахаридов, причем в результате экстракции достигается либо растворение полисахарида и ряда сопутствующих веществ, в то время как многочисленные примеси остаются нерастворенными, либо удаление сопутствующих веществ, а извлекаемый полисахарид представляет собой остаток после экстракции. Более обычный вариант экстракции - это растворение выделяемого полисахарида. Растворителем, применяемым в

подавляющем большинстве случаев, является вода. Повышение растворимости может быть достигнуто нагреванием, а также изменением рН. Так многие полисахариды, находящиеся в природе в виде солей, легче растворяются в разбавленных минеральных кислотах. Поэтому для выделения фукоидана из бурых водорослей в качестве экстрагирующих агентов могут быть использованы разбавленные растворы кислот (главным образом, соляная кислота, рН 2,0) (Black et al., 1952; Haug, 1964; Medcalf et al., 1977; Mori et ai., 1982; Nagaoka et al., 1999; Honya et al., 1999; Tako et al., 1999; Zvyagintseva at al., 1999; Rupe Bires et al., 2002), а также горячая вода (Fujihara et al., 1984; Nishino et al., 1989; Lee et al., 1995; Zhuang et al., 1995; Zvyagintseva et al, 1999; Hou et al., 2000; Duarte et al., 2001). Наряду с химическими существуют ферментативные способы выделения фукоидана. (Dietrich et al., 1995; Sakai et al, 2002).

Выход фукоидана зависит от рН среды, температуры и времени экстракции. В 1952 г. Блек (Black et al., 1952) начал исследования оптимальных условий экстракции фукоиданов из Pelveiia canaliculata и F. vesiculosus водой, соляной кислотой и растворами щелочей. Блек установил, что при нагревании до 70 С в течение 1 ч с соляной кислоты (рН 2,0 - 2,5) при ЖК 1:10 из водорослей экстрагируется около 50 % от общего содержания фукоиданов в водоросли. При экстракции водой температурой 100 С в течение 3 - 7,5 ч, при ЖК 1:10 выделяется 55 - 60 % фукоиданов.

Более эффективная экстракция полисахарида может быть достигнута с помощью увеличения жидкостного коэффициента (отношение водоросли к экстрагенту), времени экстракции, или количества повторных экстракций (Black et al, 1952). На холоде, даже при рН ниже 1,5, выделяется очень небольшое количество фукоиданов, а при обработке щелочью при 75 С в течение 1 ч - еще меньше.

В 1981 г. проводили подобные работы по подбору оптимальных условий экстракции фукоидана из Kjellmaniella crassifolia (Nishide et al., 1981). Для этого определяли содержание фукозы в недиализованном

31 экстракте. При экстрагировании водой (рН 5,5) максимальный выход полисахарида наблюдался в следующих условиях: температура - 100 С в течение 3 ч. В результате кислотной экстракции (рН 2,5) в течение 2 ч в диапазоне температур от 1,5 до 5,5 С выход полисахарида увеличивался с возрастанием температуры экстракции. Выход при 90 С и 100 С в диапазоне рЫ экстрагирующей среды от 2,5 до 5,5 почти одинаковый, при понижении кислотности среды до рН 1,0 выход резко падает вследствие деструкции полисахарида (Nishide et al., 1981).

Для экстрагирования фукоидана, помимо воды и растворов кислот, используется водный раствор хлорида кальция (Mian et al., 1973; Usui et al., 1980; Percival et al., 1983; Finch et ah, 1986; Усов и др., 1994), а также этилендиаминтетрауксусная кислота (Medcalf et al., 1977). Использование 2 %,. раствора хлорида кальция на первой стадии экстракции переводит альгиновую кислоту в нерастворимую кальциевую форму.

Наряду с фукоиданом в экстрактах могут также содержаться другие полисахариды (ламинаран и альгиновая кислота), низкомолекулярные вещества (пигменты, маннит, глюкоза) (Mian et al., 1973; Усов и др., 1998; Zvyagintseva et al., 1999).

Поэтому дальнейшая обработка экстракта проводится так, чтобы по возможности удалить эти сопутствующие вещества (Кочетков и др., 1967).

Наиболее обычным приемом выделения полисахаридов из водных растворов является осаждение их смесью воды с органическими растворителями, причем в подавляющем большинстве случаев применяется этиловый спирт. Только в очень редких случаях полисахариды выделяют из растворов простым упариванием растворителя. В случае недостаточно очищенных полисахаридов применяют осаждение в условиях, когда примеси остаются в растворе.

Известно, что в 80 % спирте хорошо растворимы низкомолекулярные вещества, . экстрагируемые из биологических объектов вместе с полисахаридами, в том числе и многие олигосахариды. Полисахариды при

32 такой концентрации спирта, как правило, выпадают в осадок. Таким простым приемом, как осаждение спиртом, часто можно избавиться от низкомолекулярных примесей. Гораздо реже для удаления альгиновой кислоты и белка применяют метанол, ацетон, а также ацетат кальция и трихлоруксусную кислоту (Кочетков и др., 1967; Mori et al., 1982).

Простое осаждение не приводит к разделению смесей полисахаридов. Чтобы отделить полисахариды друг от друга, проводят дробное осаждение, получая серию фракций осаждаемых веществ, соответствующих разным концентрациям осадителя в растворе, и исследуют их состав и свойства (Larsen et al, 1966; Abdel-Fattah et al., 1973; Nishide et al., 1990).

Фукоидаы может быть отделен от других полисахаридов путем осаждения последних в виде нерастворимых солей кальция (Nishino et al.,.. 1989; Усов и др., 1998; Nagaoka et al., 1999; Duarte et al., 2001; Park et al., 2002) или бария (Tako et al, 1999). Чрезвычайно большое значение для отделения кислых полисахаридов от нейтральных и фракционирования полисахаридов приобрело в последнее время использование в качестве-осадителей четвертичных аммонийных солей типа бромистого цетилтриметиламммония (цетавлона) или хлористого цетилперединия. Реагируя стихеомегрически с анниоными группировками полисахаридов, цетавлон и его аналоги вызывают значительное уменьшение гидрофильных свойств полисахаридов и, как следствие, выпадение цетавлоновых солей полисахаридов из водных растворов. Получаемые осадки обычно легко растворимы в растворах солей, например в растворе хлористого натрия; полисахарид может быть выделен из такого раствора в виде натриевой соли осаждением спиртом. Воздействуя цетавлоном при различных рН на смеси полисахаридов, можно разделить полисахариды разной степени кислотности, например, отделить сульфатированные полисахариды от полиуронидов (Кочетков и др., 1967; Nishino et al., 1989; Усов и др., 1998; Duarte et al., 2001).

Осаждение полисахаридов описанными выше методами, способствует получению препаратов, загрязненных неуглеводными примесями, в первую

33 очередь, неорганическими солями, а также белком. В этих случаях растворы, содержащие полисахариды, после осаждения нуждаются в последующей обработке (Кочетков и др., 1967).

Для отделения низкомолекулярных примесей, присутствующих в больших количествах, применяется диализ. При данном способе низкомолекулярные примеси легко диффундируют в раствор. Процесс диффузии ускоряется при перемешивании диализуемого раствора и диализе против проточной воды. Уяьтрафильтрование, фильтрование растворов через полупроницаемые мембраны с известной величиной пор, также позволяет удалять низкомолекулярные примеси, одновременно сконцентрировать растворы полисахаридов и даже в ряде случаев получить фракции полисахаридов, различающиеся по молекулярной массе. При этом высокомолекулярные примеси, не удаляемые диализом, обычно осаждаются впоследствии вместе с выделяемым полисахаридом (Кочетков и др., 1967).

Современная химия, и в первую очередь, химия природных соединений, обязана своими достижениями прежде всего применению хроматографических методов разделения. Наиболее эффективной для отделения фукоидана от других полисахаридов оказалась ионообменная хроматография (Mori et al, 1982; Усов и др., 1994). Ионообменниками обычно служат такие аниониты, как DEAE-целлюлоза (Pereira et al., 1999; Cimino et al., 2001), Сефадекс G-100 (Soeda et al, 1995; Soeda et al., 2000), Q-Сефароза FF (Xue et al., 2001), QAE-Сефароза (Patankar et al, 1993), DEAE-Сефароза (Chevolot et al., 1999), Fractogel EMD2-650 M (Durig et al., 1997). Для элюирования полисахаридов с колонок используют буферные растворы разной концентрации.

В последние годы все большее распространение получает хроматографическое разделение веществ по их молекулярной массе - гель-фильтрация на сефадексах. Гель-хроматография незаменима для быстрого отделения полимера от низкомолекулярных примесей (Nishino et al., 1989; Усов и др., 1994). Ее применяют и для разделения полимеров, причем

34 одновременно можно оценить и молекулярную массу фукоидана. Для этого используют колонку с Toyopearl HW-50S и HW-65S (Усов и др., 1994), Bio-Gel РЮО (Patankar et al., 1993), Superdex (Chevolot et al.,1998; Chevolot et al., 1999), Superose 12 (Tako et al., 1999). Особенно интересным является использование сефадексов для разделения высоко- и низкомолекулярных осколков, образующихся при расщеплении биополимеров. Хроматография на модифицированных сефадексах, обладающих ионообменными свойствами, особенно на DEAE- Сефадекс А-25 (Кочетков и др., 1967; Chizhov et al, 1999; Нолуа et al., 1999; Haroun-Bouhedjal et al., 2000), также может служить эффективным приемом фракционирования полисахаридов.

Дня анализа смеси кислых полисахаридов может с успехом применяться электрофорез. Таким путем отделяют кислые полисахариды водорослей от полиуронидов при низких рН (Кочетков и др., 1967; Mori et al., 1982).

Таким образом, в зависимости от цели и чистоты получения фукоидана можно использовать различные методы его очистки путем фильтрации, дробного осаждения, хроматографии. Экстракцию фукоидана чаще всего--проводят водой, растворами кислот или солей кальция, при этом существующие методики позволяют получить полисахарид как реактив для проведения медико-биологических работ. Однако, применение дорогостоящих (цетавлон) или токсичных (гидроксид свинца) реактивов, многостадийность и длительность процесса не позволяют использовать представленные методы в промышленности.

В настоящее время существует несколько промышленных способов получения фукоидана или фукоидансодержащих комплексов. Например, в Пат. РФ 2247574 Тихоокеанского Института Биоорганической Химии описывается способ получения фукоидана из свежей или замороженной бурой водоросли К vesiculosus. Для этого водоросли после удаления этанолом низкомолекулярных веществ обрабатывают водой (ЖК 1:20) при комнатной температуре в течение 5 ч и нагревают в течение 5 ч при температуре 50-60 С, затем экстракт концентрируют, для осаждения примеси альгиновой кислоты

35 доводят рН до значения 3, затем экстракт нейтрализуют, диализуют, осаждают фукоидан двумя объемами 96 % этанола, и еще трижды промывают спиртом. Сотрудниками этого же института был предложен способ комплексной переработки свежих или замороженных бурых водорослей (Заявка на Пат. РФ 2003123744 А), в которой, помимо прочих компонентов, экстрагируют фукоидан, Способ отличается тем, что вместо водной обработки проводят солянокислую экстракцию рН 2-2,5 в течение 10-14 ч при комнатной температуре, с дальнейшей двукратной экстракцией водой при температуре 60-70 С в течение 2-4 ч, с последующим отделением альгиновои кислоты и ламинарана от экстракта.

На наш взгляд предложенные способы имеют ряд недостатков, связанных с трудоемкостью и энергоемкостью процессов: дополнительная очистка. экстракта от альгиновои кислоты, упаривание и регенерация большого объема спирта, а также использование свежей водоросли (что позволяет применять технологию только в промысловый период с июня по август) или замороженной водоросли (затраты электроэнергии на заморозку и хранение, частичная потеря фукоидана и других БАВ при дефростации водорослей).

Сотрудниками Пятигорского фармацевтического института также предложен способ комплексной переработки сушеных водорослей Белого и Баренцева морей L. saccharina и L. digitata (Пат. РФ 2028153), где с помощью двукратной водной обработки (ЖК 1:10, 80 С, 30 мин) экстрагируют водорастворимый полисахаридный комплекс, представляющий собой смесь фукоидана с ламинараном. Недостаток данного способа заключается в многостадийном отделении фукоидана от ламинарана с использованием цетавлона.

Еще один способ получения фукоидансодержащего полисахаридного комплекса «Фукусовый» из фукусовых водорослей Белого моря был предложен Репиной (Репина, 2005 б). Для получения комплекса водоросли обрабатывали этиловым спиртом, проводили экстракцию 0,4 % соляной кислотой (ЖК 1:6-1:8) при температуре 70 С в течение 1 ч и водой этой же

36 температуры в течение 3 ч. Полученный продукт представляет собой смесь фукоидана, ламинарана и альгината.

В последние годы стала актуальной комплексная переработка водорослей, позволяющая извлекать из сырья биологически-активные вещества (БАВ). Кроме того, получение БАВ в одном технологическом цикле является основой рационального использования водорослей, сокращает количество отходов производства, приводит к повышению рентабельности и снижению себестоимости продукции. Традиционными продуктами переработки бурых водорослей являются маннит и альгинаты. Однако наличие в составе бурых водорослей других не менее ценных БАВ привело к необходимости разработки новых технологий, позволяющих выделить водорастворимые полисахариды - фукоидан, ламинаран, липиды, пигменты, а также экстракты, содержащие комплексы БАВ.

На основании анализа литературных данных представляется целесообразным подбор такого сырья и разработка технологии фукоидана, которые позволяют получить конечный продукт с минимальными примесями-других полисахаридов. Разрабатываемая технология должна отвечать следующим требованиям: максимальное извлечение фукоидана из водорослей, высокое содержание сульфатных групп в полисахариде, напичие биологической активности, а также экономичное и нетрудоемкое производство, возможность дальнейшего использования водорослей для производства альганатсодержащих продуктов.

Химический состав, структура и содержание фукоидана в водорослях

Мировая добыча и использование в коммерческих целях морских водорослей, в первую очередь на производство полисахаридов, постоянно растет. Известно, что мировой сбор макрофитов достигает 11,35 млн.т. в год. Из них 10,13 млн.т. выращивают преимущественно в море на плантациях, а 1,22 млн.т. добывают из естественных зарослей. Мировая добыча бурых водорослей из естественных зарослей составляет около 670 тыс.т. (Шевченко, 2005). В России добыча бурых водорослей в основном ведется из естественных зарослей на Дальнем Востоке и Севере и составляет около 30 тыс.т., в то время как в Китае добывается около 2,2 млн.т бурых водорослей; основная доля которых приходится на марикультуру (Промысловые и перспективные..., 1998).

Бурые водоросли, как правило, типичные обитатели холодных и умеренных климатических зон. В бассейнах с океанической или близкой к ней соленостью (Баренцево, Белое, Охотское, Японское моря) флора водорослей значительно богаче, чем в морях с низкой соленостью (Азовское, Каспийское, Балтийское) (Гарибова и др., 1978).

Северные моря - Белое и Баренцево - характеризуются разнообразной флорой. Литоральную зону здесь населяют обычно бурые водоросли из порядка фукусовых (Fucales), которые представлены следующими видами: Fucus vesiculosus, Fucus distichus, Fucus serratus и Ascophyllum nodosum. Общий запас основных видов бурых водорослей Белого моря составляет 19,8 тыс.т. Доминирующим видом является F. vesiculosus, составляя 79 % от общего количества водорослей, остальное приходится на долю A. nodosum (Гарибова и др., 1978; Пронина, 2005). Среди порядка ламинариевых (Laminariales) преобладают виды хорды (Chorda), ламинарии (Laminaria), алярии (Alaria). В Черном море с его относительно малой прозрачностью воды, наличием сероводородной зоны и значительным опреснением ламинариевых водорослей нет совсем, фукусовые представлены Cystoseira barbata и Cystoseira crinita (Гарибова и др., 1978; Шевченко, 2005). По экспертной оценке общий запас данных видов водорослей у Российских берегов составляет около 85 тыс.т. (Вилкова, 2005)

Альгофлора Азовского и Каспийского морей еще беднее черноморской, из крупных бурых водорослей растет лишь С. barbata (Гарибова и др., 1978). В морях Дальнего Востока произрастает более 200 видов бурых водорослей (Гусарова и др., 2000), заросли которых образуют водорослевые пояса вдоль всего дальневосточного побережья, особенно у Курильских островов (о. Кунашир, Шикотан) и островов Малой Курильской гряды, в Охотском море (у Шантарских островов), в Восточно-Камчатской зоне и в Лионском море (Приморье, Западно-Сахалинская зона).

Камчатский промысловый район (Рис. 1) по общим запасам ламинариевых водорослей занимает одно из ведущих мест на Российском-Дальнем Востоке, особенно Каррагинская подзона, где биомасса промысловых видов составляет 180 тыс.т (Прогноз общих допустимых уловов..., 2005). Однако вплоть до последних лет водорослевые ресурсы Камчатки по разным причинам не использовались (Королева и др., 2002). Кроме наиболее массовых видов камчатского региона - Laminaria bongardiana и Laminaria gurjanovae широкое распространение и значительные запасы имеет Fucus evanescens (Клочкова, Березовская, 1997).

Курильские острова (Рис.1) отличаются самыми крупными на Дальнем Востоке запасами промысловых видов водорослей - 289,7 тыс. т (Прогноз общих допустимых уловов..., 2005). Основное количество видов представлено водорослями из семейства ламинариевых, объединенных под общим названием «морская капуста» - Laminaria japonica, Laminaria angustata, Cymatherefibrosa, Cymathere japonica (Евсеева, 2005).

Растительные ресурсы северо-охотоморского побережья в прибрежных зонах Магаданской области и Хабаровского края (Рис. 1) содержат огромные запасы Cystoseira crassipes - более 800 тыс.т (Суховеева, 1976; Суховеева, Подкорытова, 2006). Однако промысел водоросли в данных районах не ведется в связи с ее значимостью как нерестового субстрата сельди. (Балконская и др., 2005; Прогноз общих допустимых уловов..., 2005).

Массовыми видами побережья Приморья (Рис. 1)-являются бурые водоросли: L. japonica, Costaria costata, С. crassipes. По данным съемки 2004 г. общие запасы фитомассы промысловых и потенциально промысловых растительных ресурсов у побережья Приморья составили 130-150 тыс.т., из них 65 тыс.т. приходится на L. japonica, 14,8 тыс.т. - на С. costata, 1,0 тыс.т. -С crassipes (Кулепанов и др., 2005). В Приморье основные промысловые заросли бурых водорослей сконцентрированы в районе от мыса Поворотного до мыса Бычьего (Кизеветтер и др., 1981; Клочкова, Березовская, 1997; Балконская, 2001; Евсеева, 2001; Тарасюк и др., 2001; Трофимова, Козлов 2001; Аминина, Клочкова, 2001; Болдырев, Солодовников, 2001; Подкорытова, Суховеева, 2002; Прогноз общих допустимых уловов..., 2005)

В целом запасы ламинариевых водорослей, обладающие промысловыми запасами, в Дальневосточном регионе оцениваются в 725 тыс. тонн, их допустимый объем вылова (ОДУ) на 2005 г составил 173,05 тыс.т. (Прогиоз общих допустимых уловов..., 2005). Однако добыча бурых водорослей идет в очень малых масштабах. Так, в 2002 г при прогнозе 150,5 тыс.т добыто 7,2 тыс. т, в 2003 г - соответственно, 169 тыс.т и 6.6. тыс.т, в 2004 г - 160 тыс. т и 8,8 тыс. т (Прогноз общих допустимых уловов..., 2005). Наиболее массовыми промысловым видами на Дальнем Востоке среди ламинариевых являются L. japonica, L. gurjanovae, L. bongardiana, среди фукусовых - С. crassipes и F. evanescens. Несмотря на это, только L. japonica добывается в промышленных масштабах. Эта водоросль имеет двухлетний цикл развития, отмирает на втором году жизни после летнего спороношения и достигает наибольшей массы в июне-июле второго года жизни. Промыслом используется только двулетняя водоросль. Период созревания и оптимальной ценности слоевищ весьма непродолжителен, поэтому при сборе водорослей существует страда, требующая максимальной интенсивности труда при заготовке водорослей (Кизеветтер и др., 1981; Подкорытова, Шмелькова, 1983). Таким образом, Дальневосточный регион обладает значительными запасами бурых водорослей, которые практически не используются. По биомассе, плотности поселения и доступности для промысла практическое значение для промышленной переработки имеют следующие виды: L. japonica, L. gurjanovae, L. bongardiana, С. crassipes и F. evanescens.

Фракционирование фукоидана методом ионообменной хроматографии

Экстрагирование и очистка полисахаридов представляет собой трудную задачу. В природных условиях эти соединения находятся в виде сложных смесей с низкомолекулярными веществами, молекулами неуглеводной природы, наконец, с другими высокополимерными углеводами. Трудности возрастают в связи с тем, что, будучи весьма лабильными веществами, полисахариды под влиянием даже слабых воздействий легко подвергаются различным изменениям: часто происходят их деполимеризация, окисление и другие изменения (Денисова и др., 2001). Способ выделения полисахаридов должен удовлетворять основным требованиям: быть максимально эффективным, сопровождаться незначительными потерями на всех стадиях, особенно когда содержание выделяемого полисахарида в источнике невелико; в процессе выделения полисахарид должен подвергаться как можно меньшим изменениям; должен быть предусмотрен эффективный способ очистки биополимера (Кочетков и др., 1967). Выделение и очистка фукоидана в основном проводится согласно следующим этапам: 1. сушка и измельчение водорослевого материала; 2. предобработка водорослей; 3. выделение фукоидана из водорослей экстрагирующим агентом; 4. очистка полисахарида. Для удаления сопутствующих механических примесей, водоросли промывают в проточной или дистиллированной водах, высушивают и измельчают (Mian et al., 1973; Fujihara et al., 1984; Nagaoka et al., 1999).

Для предотвращения загрязнения экстрактов низкомолекулярными веществами зачастую водоросли обрабатывают 80 или 85 % водными растворами этанола (Mian et al, 1973; Carlberg et a)., 1978; Percivai et al., 1983; Finch et al., 1986) или метанола (Anno et al, 1966; Mori et al., 1982; Dobashi et al., 1989). За счет предварительной обработки водорослей спиртовыми растворами практически полностью устраняются низкомолекулярные. вещества (Anno et al., 1966; Mian et al., 1973). В некоторых случаях после спиртовой обработки водоросли еще дополнительно обрабатывали водным раствором формальдегида, для того чтобы полимеризовать вещества фенольной природы (Mian et al., 1973; Percivai et al., 1983; Carlberg et ah, 1978; Nishide, 1981; Finch et al., 1986). Для удаления низкомолекулярных веществ воздушно-сухую водоросль также обрабатывают смесью метанол -хлороформ - вода в соотношении 4:2:1 (Whyte et al., 1970; Усов и др, 1994). Иногда вместо предварительной спиртовой обработки для удаления низкомолекулярных веществ полученные экстракты диализуют против дистиллированной воды (Abdel-Fattah et al., 1973; Abdel-Fattah et al., 1975; Fujikawa et al., 1975; Abdel-Fattah et al., 1977; Lizima-Mizui et al., 1985).

Экстракция является основной стадией почти каждого процесса выделения полисахаридов, причем в результате экстракции достигается либо растворение полисахарида и ряда сопутствующих веществ, в то время как многочисленные примеси остаются нерастворенными, либо удаление сопутствующих веществ, а извлекаемый полисахарид представляет собой остаток после экстракции. Более обычный вариант экстракции - это растворение выделяемого полисахарида. Растворителем, применяемым в подавляющем большинстве случаев, является вода. Повышение растворимости может быть достигнуто нагреванием, а также изменением рН. Так многие полисахариды, находящиеся в природе в виде солей, легче растворяются в разбавленных минеральных кислотах. Поэтому для выделения фукоидана из бурых водорослей в качестве экстрагирующих агентов могут быть использованы разбавленные растворы кислот (главным образом, соляная кислота, рН 2,0) (Black et al., 1952; Haug, 1964; Medcalf et al., 1977; Mori et ai., 1982; Nagaoka et al., 1999; Honya et al., 1999; Tako et al., 1999; Zvyagintseva at al., 1999; Rupe Bires et al., 2002), а также горячая вода (Fujihara et al., 1984; Nishino et al., 1989; Lee et al., 1995; Zhuang et al., 1995; Zvyagintseva et al, 1999; Hou et al., 2000; Duarte et al., 2001). Наряду с химическими существуют ферментативные способы выделения фукоидана. (Dietrich et al., 1995; Sakai et al, 2002).

Выход фукоидана зависит от рН среды, температуры и времени экстракции. В 1952 г. Блек (Black et al., 1952) начал исследования оптимальных условий экстракции фукоиданов из Pelveiia canaliculata и F. vesiculosus водой, соляной кислотой и растворами щелочей. Блек установил, что при нагревании до 70 С в течение 1 ч с соляной кислоты (рН 2,0 - 2,5) при ЖК 1:10 из водорослей экстрагируется около 50 % от общего содержания фукоиданов в водоросли. При экстракции водой температурой 100 С в течение 3 - 7,5 ч, при ЖК 1:10 выделяется 55 - 60 % фукоиданов.

Более эффективная экстракция полисахарида может быть достигнута с помощью увеличения жидкостного коэффициента (отношение водоросли к экстрагенту), времени экстракции, или количества повторных экстракций (Black et al, 1952). На холоде, даже при рН ниже 1,5, выделяется очень небольшое количество фукоиданов, а при обработке щелочью при 75 С в течение 1 ч - еще меньше.

В 1981 г. проводили подобные работы по подбору оптимальных условий экстракции фукоидана из Kjellmaniella crassifolia (Nishide et al., 1981). Для этого определяли содержание фукозы в недиализованном экстракте. При экстрагировании водой (рН 5,5) максимальный выход полисахарида наблюдался в следующих условиях: температура - 100 С в течение 3 ч. В результате кислотной экстракции (рН 2,5) в течение 2 ч в диапазоне температур от 1,5 до 5,5 С выход полисахарида увеличивался с возрастанием температуры экстракции. Выход при 90 С и 100 С в диапазоне рЫ экстрагирующей среды от 2,5 до 5,5 почти одинаковый, при понижении кислотности среды до рН 1,0 выход резко падает вследствие деструкции полисахарида (Nishide et al., 1981).

Для экстрагирования фукоидана, помимо воды и растворов кислот, используется водный раствор хлорида кальция (Mian et al., 1973; Usui et al., 1980; Percival et al., 1983; Finch et ah, 1986; Усов и др., 1994), а также этилендиаминтетрауксусная кислота (Medcalf et al., 1977). Использование 2 %,. раствора хлорида кальция на первой стадии экстракции переводит альгиновую кислоту в нерастворимую кальциевую форму.

Наряду с фукоиданом в экстрактах могут также содержаться другие полисахариды (ламинаран и альгиновая кислота), низкомолекулярные вещества (пигменты, маннит, глюкоза) (Mian et al., 1973; Усов и др., 1998; Zvyagintseva et al., 1999).

Исследование содержания фукоидана в бурых водорослях в зависимости от места произрастания

Сравнительный анализ показал, что в верхней части L. bongardiana из Второго Курильского пролива, как и в водоросли из более северного места обитания, содержание фукоидана увеличивается с первого по второй год жизни в 2 раза (Рис. 12, 13). В средней и нижней частях пластины у водоросли из пролива также наблюдается увеличение полисахарида с первого по второй год жизни на 0,6 % и 2,5 %, соответственно (Рис. 13). Причем, полученные данные в первый и второй годы жизни растения из Второго Курильского пролива обратно пропорциональны таковым в средней и нижней частях таллома у водоросли из Авачинского залива (Рис. 12, 13). Так, содержание фукоидана в средней и нижней частях слоевища водоросли из Авачинского залива понижается на 0,4 и 2,5 %, соответственно (Рис. 12). Вероятно, такие различия в распределении фукоидана по талому водорослей из двух мест обитания связаны с особенностями гидрологии (Шунтов, 2001) в данных районах, и, как следствие, с разными особенностями развития.

Таким образом, максимальное количество фукоидана в ламинарии Бонгарда накапливается на второй год развития, причем в верхней части слоевища независимо от места произрастания водоросли. На основании этого можно рекомендовать для получения фукоидана использовать также верхние части пластин водорослей, которые являются отходами производства.

Исследование моносахаридного состава бурых водорослей, с помощью выбранных нами условий, представляет интерес в связи с расширяющимися возможностями их промышленного использования в качестве источников фукоидана и ламинарана, а также для более углубленных химических исследований полисахаридов. Особенно актуальны сведения о моносахаридном составе промысловых и потенциально промысловых видов водорослей (Табл. 5). Так, с помощью хроматографического анализа возможно не только определение основного моносахарида фукоидана - фукозы, но и остальных моносахаров, которые могут входить в состав полисахарида, а также ламинарана.

ГЖХ анализ показал значительные отличия по моносахаридному составу разных видов водорослей. Фукоза является основным моносахаридом водорослей (Табл. 5). Исключение составляет L. gurjanovae, где основной моносахарид - глюкоза, содержание которой составляет 16 %. По наличию глюкозы в водоросли можно судить о присутствии в ней ламинарана - р-1,3-1,6-глюкана, который легко извлекается из водоросли при условиях близких к выделению фукоидана, В остальных видах ламинариевых водорослей накапливается незначительное количество ламинарана и колеблется от 0,05 % до 0,39 %. В фукусовых водорослях С. crassipes и F. evanescens содержание ламинарана выше и составляет 1,76 % и 2,58 %, соответственно (Табл. 5).

Наибольшее количество фукозы среди ламинариевых водорослей содержится в К. crassifolia (3,20 %), наименьшее - в L. gurjanovae и A. fistulosa (около 0,5 %), в остальных видах - около 1,8 %. Фукусовые водоросли С crassipes и F. evanescens также отличаются высоким содержанием фукозы (2,26 и 4,55 %, соответственно) (Табл. 5).

Помимо основного моносахарида - фукозы, в фукоидане также могут присутствовать ксилоза, манноза, галактоза. Как показал анализ, количество остальных моносахаридов фукоидана не превышает 1 %, за исключением галактозы в К. crassifolia (Табл. 5).

Наиболее наглядным определением структурных особенностей фукоидана могут служить молярные отношения моносахаридов. Так, в L gurjanovae, помимо ламинарана, присутствует полисахарид с соотношением Fuc/ Man/ Gal - 1/ 0,9/ 1,1, а в і. yezoensis и A, fistulosa фукоиданы с высоким содержанием маннозы (Fuc/ Man - 1/ 0,7). По молярным отношениям можно также оценить «идеальную» структуру фукоидана - наибольшее количество фукозы по отношению к сумме других моносахаридов (Xyl+ Man+Gal). Так, фукоидан с количеством остальных моносахаридов 1 содержится в фукусовых водорослях и в ламинариевых, за исключением L. gurjanovae, L. yezoensis и А. fistuiosa (Табл. 5).

Таким образом, для получения фукоидана с наибольшим отношением фукозы к остальным моносахаридам таких, как ксилоза, манноза и галактоза могут служить фукусовые и ламинариевые водоросли за исключением L. gurjanovae и A. fistuiosa в меньшей степени L. yezoensis. Для извлечения фукоидана, содержащего небольшое количество примесей других полисахаридов, необходимо использовать водоросли с минимальным количеством ламинарана, для этих целей идеально подходит L. japonica.

Обоснование комплексной технологии переработки бурых водорослей

Как показал анализ, при получении полисахарида в виде кислой формы, снижаются его качественные характеристики - получается низкосульфатированный фукоидан (4,7 %) с минимальным содержанием фукозы (1,1 %). Вероятно, это связано с деструкцией полисахарида при сушке, в связи с уменьшением рН экстракта.

Поэтому после фильтрации экстракта исследовали процесс нейтрализации до рН 7. Нами были использованы различные реагенты для нейтрализации, такие как карбонат натрия, гидрокарбонат натрия, гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид кальция. Как показал анализ, использование малорастворимого гидроксида кальция приводит к увеличению времени нейтрализации, а сильных оснований гидроксида натрия и калия - к бурному протеканию процесса. Поэтому для нейтрализации экстракта лучше всего использовать карбонат натрия или гидрокарбонат натрия. К тому же карбонат натрия давно используется в производстве полисахаридов, например, для перевода альгиновой кислоты в альгинат натрия, и нормируется по ГОСТ 83-79.

На основании проведенных исследований был установлен рациональный режим экстрагирования фукоидана, позволяющий получить максимальный выход полисахарида с подходящими показателями, при использовании следующих параметров: предварительная спиртовая обработка водоросли, двукратное экстрагирование 1 % раствором соляной кислоты при соотношении водоросль: кислота 1:5 в течение 16 ч и 6 ч при комнатной температуре, нейтрализация экстракта карбонатом или гидрокарбонатом натрия.

В литературе отсутствуют данные по изменению структурных... особенностей фукоидана в процессе экстракции. Поэтому нами было изучено влияние условий экстрагирования на структуру фукоидана, для чего был определен его моносахаридный состав (Табл. 12).

Методом ГЖХ в составе фукоиданов, выделенных ламинарии японской, обнаружено четыре основных моносахарида (ксилоза, фукоза, манноза, галактоза) и шестиатомный спирт маннит, основное количество которого удаляется при спиртовой обработке (Табл. 12, образец № 2), Главным моносахаридом фукоидана является фукоза, ее содержание в образцах № 15 и 16 достигает 17,3 и 17,7 %, соответственно.

В результате экстракции количество всех моносахаридов меняется в зависимости от условий экстрагирования. Так, содержание фукозы варьирует от 2,2 до 17,7 %, ксилозы - от 0,3 до 7 %. Количество галактозы и маннозы меняется от 0,4-5,5 % (Табл. 12).

В составе полисахарида не обнаружена глюкоза, которая в небольших количествах (0,05 %) содержится в исходной водоросли (Табл. 5). Хотя, по литературным данным в составе фукоидана из ламинарии японской в следовых количествах (0,01- 0,03 %) может присутствовать глюкоза, а также арабиноза (0,003-0,012 %) и рамноза (0-0,002 %) (Honya et al., 1999).

Анализ молярных отношений моносахаридов показал, что при использовании в качестве экстрагентов 0,5 % (ЖК 1:10) и 1 % растворов соляной кислоты и времени экстракции 2 ч в полисахаридах увеличивается относительное содержание ксилозы, и составляет Fuc/ Xyl 1:0,4-1:0,6. При использовании воды и 0,5 % (ЖК 1:5) кислоты изменяется отношение Fuc/ Man 1:1-1:0,5, соответственно (Табл. 12). При увеличении времени экстрагирования до 16 ч отношение нейтральных моносахаров к фукозе не превышает 0,1-0,2 (образцы № 9-14). Только при использовании двукратной экстракции в течение 16 и 6 ч (1 % НС1, ЖК 1:5), а также при однократной в течение 16 ч (1 % НС1, ЖК 1:5) были получены полисахариды с наименьшим отношением Fuc/ Xyl/Gal/ Man - 1/ 0,1/ 0,1/ 0,1 (образцы № 11, 14). Также было установлено влияние ЖК при нагревании при повторном экстрагировании на соотношение моносахаридов. При этом экстракция с 1 % НС1 при ЖК 1:5 приводит к увеличению относительного содержания ксилозы в полисахариде (образцы № 15-16), а при ЖК 1:10-галактозы (образцы № 17-18).

Во всех полученных нами образцах полисахаридов содержание сульфатных групп варьирует от 6,32 % до 31,02 %. Отношение сульфатных групп к фукозе во всех образцах больше единицы. Согласно литературным данным это свидетельствует о высокой биологической активности полученных полисахаридов (Nishino, Nagumo, 1991 a; Nishino et al., 1995; Chevolot et aL, 1999; Soeda et al, 2000). При этом, только при степени сульфатирования около- 30 % фукоиданы способны обладать значительной антикоагулянтной и противоопухолевой активностью (Усов и др. 1998; Haroun-Bouhedja et.al., 2000). Предложенный нами режим получения фукоидана позволяет выделить полисахарид с аналогичным содержанием сульфатных групп (образец № 14).

Таким образом, изменение условий экстрагирования фукоидана влияет не только на количество основных моносахаридов, но и на их молярные отношения. Однако при условиях экстракции, рассмотренных нами, не было выявлено факторов, которые могли бы привести к существенным изменениям структуры полисахарида, за исключением отщепления сульфатных групп при нагревании, что было рассмотрено ранее. Исследование моносахаридного состава фукоидана также показало, что обоснованные нами условия двукратного экстрагирования 1 % раствором соляной кислоты (ЖК 1:5) в течение 16 ч и 6 ч при комнатной температуре позволяют получить полисахарид с наименьшим содержанием остальных моносахаридов.

Для сравнения разработанного нами способа экстракции фукоидана из ламинарии японской были выделены полисахариды по методикам, описанным в литературе (Усов и др., 1994; Park et al., 2002), условия которых наиболее близки к нашей технологии. В качестве экстрагента используется 2 % раствор хлорида кальция (Усов и др., 1994) и 0,4 % раствор соляной кислоты (Park et al., 2002). Сравнительный анализ образцов фукоиданов, полученных по трем методам представлен в таблице 13.

Похожие диссертации на Обоснование технологии фукоидана при комплексной переработке бурых водорослей дальневосточных морей

Обоснование технологии использования вторичных продуктов переработки риса в кулинарных изделияхКаравай Людмила Владимировна

Обоснование применения отходов переработки Cucumaria Japonica в технологии эмульсионных продуктов Табакаева Оксана Вацлавовна

Комплексная технологий йод- и альгинатсодержащих продуктов из бурых водорослей дальневосточных морей Вишневская Татьяна Ивановна

Обоснование технологии модификации белкового растительного сырья и комбинированных продуктов на его основе для общественного питанияЧернышова Анна Николаевна

Разработка и научное обоснование технологии получения рыбного гидролизата - основы белковой зернистой икры Косарина Елена Борисовна

Обоснование технологии сапонинсодержащих экстрактов Saponaria officinalis L. и использование их в производстве сбивных кондитерских изделийКлочкова Ирина Сергеевна

Обоснование технологии пробиотической продукции на основе рыбного, животного и растительного сырья Дроздова Любовь Ивановна

Обоснование технологии и исследование влияния соевых добавок на качество и пищевую ценность рыбных белково-липидных продуктовМакаренко, Василий Васильевич

Обоснование, разработка технологии и товароведная характеристика продуктов из щавеля Rumex Acetosa L. и ревеня Rheum L.Филонова Ольга Владимировна

Обоснование и разработка технологии комбинированных напитков геродиетического назначенияЧеркасова Светлана Анатольевна