Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 7
1.1. Характеристика печени лососей 7
1.2 печень как источник биологически активных веществ 11
1.3. Использование пептидов в качестве бав и лекарственных средств 13
1.4 гепатопротекторы 17
1.5. Обзор рынка современных гепатопротекторных препаратов 19
1.6. Методы выделения и получения пептидных компонентов из наземных животных и рыб
1.7. Хитозан. Строение и свойства 24
Глава 2. Обьекты, материалы и методы исследования 30
2.1. Объекты и материалы исследований 30
2.2. Методы исследований 30
Глава 3. Результаты и обсуждения 40
3.1. Характеристика печени лососей 40
3.2. Технология получения сушеной печени лососей 60
3.3. Технология выделения водорастворимых компонентов печени лососей и получения хитозан-липидных комплексов 63
3.4. Характеристика сорбционной емкости хитозанов из панциря камчатского краба и углохвостой креветки 74
3.5. Характеристика водорастворимого пептидного комплекса из печени лососей 77
3.6 Характеристика хитозан-липидных комплексов из печени лососей 84
3.7. Медико-биологические испытания 89
3.8. Расчет экономической эффективности производства бад к пище на основе ВПК 98
Выводы 101
Список сокращений 103
Список литературы
- Использование пептидов в качестве бав и лекарственных средств
- Методы выделения и получения пептидных компонентов из наземных животных и рыб
- Технология выделения водорастворимых компонентов печени лососей и получения хитозан-липидных комплексов
- Расчет экономической эффективности производства бад к пище на основе ВПК
Использование пептидов в качестве бав и лекарственных средств
Широкое распространение начиная с 90-х гг. XX столетия получила так называемая биорегулирующая терапия. Она основывается на применении при различных заболеваниях и патологических состояниях пептидных биорегуляторов -препаратов, выделенных из различных органов и тканей животных (Кузник и др., 1998; Хавинсон и др., 2012). Регуляторные пептиды обладают чрезвычайно широким спектром действия, что делает их незаменимыми в лечении самых различных заболеваний, в том числе комплексы иммунорегуляторных пептидов нашли широкое применение при лечении заболеваний печени (Пат. № 2426740).
Среди регуляторных пептидов особое место занимает новый класс биологически активных веществ, получивших наименование цитомедины. Цитомедины впервые обнаружены В.Х. Хавинсоном и В.Г. Морозовым (Хавинсон, Кветная, 2005) в различных органах и тканях животных. Эти соединения были выделены из гипоталамической области мозга, эпифиза и тимуса крупного рогатого скота (КРС). Впоследствии цитомедины идентифицировали практически во всех органах и тканях (Кузник и др., 1998). Термин цитомедины (от греческого cytos - клетка и латинского mediator - посредник) был предложен в 1981 г., а в основу названий отдельных цитомединов положена их тканевая принадлежность (Морозов, Хавинсон, 1983).
Установлено, что цитомедины представляют собой комплексы пептидов с относительно небольшой молекулярной массой (ММ) - от 300 до 10000 Да. Пептидные фракции, входящие в состав каждого цитомединового комплекса (таких фракций обнаруживается до 2-3 десятков), характеризуются одинаковыми, но не однотипными свойствами, что, по всей видимости, гарантирует высокую биологическую эффективность и надежность системы: при «выпадении» какой-либо фракции есть возможность ее замены другой, обладающей аналогичным эффектом (Кузник и др., 1998). Выделение индивидуальных пептидов и определение их биологической активности является чрезвычайно трудоемким и длительным процессом, который требует проведение оценки активности многих сотен пептидов. Результаты исследований пептидных препаратов с не идентифицированной структурой (Патент № 2301071; Патент № 2290936), а также синтетических коротких пептидов (Патент № 2297239) свидетельствуют о полифункциональности и тканес-пепифичности действия этих веществ. (Кузник и др., 1998).
В частности показано, что пептиды из печени оказывают тканеспецифиче-ское действие на рост эксплантантов печени in vitro. В.Х. Хавинсоном с соавторами (2002) показано, что культивирование фрагментов печени в присутствии гепалина - пептидного препарата из печени, приводит к достоверному увеличению индекса площади эксплантатов на 18,3±3,5%. К важнейшим свойствам цитомединов можно отнести их способность инги-бировать процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) (Морозов и др., 2000). Это свойство позволяет им играть роль антиоксидантов (АО), что имеет большое значение при реализации противоопухолевой защиты, замедлении старения организма, а также при различных интоксикациях печени, при которых образуются свободные радикалы.
Известно, что пептиды обладают тканеспецифическим действием, восстанавливая метаболизм в клетках тех тканей, из которых они были выделены (Хавинсон, 2001; Хавинсон и др., 2002, 2003; Евлахов и др., 2013; Пат. № 2290936).
Под тканеспецифическим действием пептидов подразумевается механизм влияния пептидов на молекулярно-генетические или биохимические маркеры специализированных клеток-мишеней присутствующих в различных органах и тканях (Xu et al., 2001). Тканеспецифичность пептидов также рассматривается с точки зрения структурной организации белков различного происхождения. В ряде работ показано, что фракции низкомолекулярных компонентов, выделенные из экстрактов тканей, характеризуются стабильным набором веществ пептидной природы, что позволяет считать определенные группы тканеспецифических пептидов характеристикой соответствующей ткани (Ivanov et al., 1997; Karelin et al., 1998; Gelman etal., 2010).
Установлено, что эффективность воздействия цитомединов максимальна в отношении того органа, из которого они выделены (Морозов, Хавинсон, 1983). Ци-томедины представляют собой естественный продукт жизнедеятельности клетки. Авторы исследований заявляют, что есть все основания предполагать, что препараты класса цитомединов имеют большой потенциал для использования в качестве средств профилактики и лечения многих заболеваний (Кузник и др., 1998; Морозов и др., 2000; Хавинсон и др., 2012), а также способствуют устойчивости организма к стрессорным воздействиям (Лысенко и др., 2005).
В 80-е годы 20-го столетия академиком Ашмариным И.П. была сформулирована гипотеза о функциональном континууме пептидов, которая объясняет механизмы действия регуляторных пептидов с позиций существования пептидного каскада (Ашмарин, 1982, 1986; Ашмарин, Обухова 1986, 1994; Ашмарин, Каразеева 1996, 2003; Ашмарин, Каменская, 1988). Согласно этой теории каждый пептид обладает спектром биологической активности, определяемой, как его непосредственным действием, так и способностью инициировать выход эндогенных регуляторов следующего уровня, в том числе регуляторных пептидов. Каждые из них, в свою очередь, также могут инициировать выход, следующей группы пептидов и т.д. Благодаря такому механизму действия регуляторные пептиды формируют сложный каскадный процесс. Гипотеза о существовании функционального континуума пептидов позволяет преодолеть серьезные противоречия, возникающие при попытках объяснить, относительно длительные физиологические эффекты короткоживущих пептидов (Ашмарин, 1988; Гомазков, 1995, 2006).
Известно, что каждая клетка организма обладает системой защиты от активных форм кислорода и продуктов перекисного окисления, способных инициировать необратимые процессы трансформации и распада биомолекул. Основанная часть такой защитной системы представлена рядом ферментов: супероксиддисму-тазой, каталазой, глутатионпероксидазой и локализуется в микросомах и митохондриях. Важнейшая роль функционирования митохондрий, мембраны которых несут на своих поверхностях комплексы ферментов, катализирующие транспорт электронов, принимающие участие в цикле трикарбоновых кислот и в процессах фосфорилирования, состоит в ингибировании избыточного свободнорадикального окисления (Козина, 2009).
Методы выделения и получения пептидных компонентов из наземных животных и рыб
Навеску сырой ткани гомогенизировали в этаноле, для осаждения белков в экстракт добавляли сульфосалициловую кислоту и безводный сульфат натрия для связывания воды. Осадок отделяли фильтрованием, а фильтрат упаривали досуха на роторном испарителе. Полученный сухой остаток метилировали раствором соляной кислоты в метаноле.
Анализ желчных кислот проводили двумя способами; 1. На газовом хроматографе GC-14B фирмы "Shimadzu" (Япония). Использо валась колонка DB 5HS длиной 25 м, толщиной 0,2 мм, толщина фазы (неполярная, силикон с 5% фенильных групп) 0,33 мкм. Газ-носитель - гелий, скорость 30 см/сек. Детектор пламенно-ионизационный, 300 С, инжектор 280 С, делитель по тока 1/40. Использовалась температурная программа от 50 до 290С. 2. На газовом хроматографе СР-3800 (Varian, США), снабженном масс селективным детектором 1200L Quadrupole MS (Varian, США) с квадрупольным масс-анализатором, с использованием колонки VF-5ms (длина - 30 м; внутренний диаметр - 0,25 мм; толщина пленки - 0,25 мкм, Varian, США). В качестве газа носителя использовали гелий. Скорость потока газа-носителя составляла 1 мл/мин с делением потока 1/20. Все спектры регистрировались при энергии ионизации 70 эВ и температуре ионного источника 200 С. Температура инжектора 250 С. Ана лиз проводили в условиях градиента температур колонки: 50 С (20 мин) 10С/мин - 200 С (20 мин) - 10 С/мин - 250 С (180 мин). Идентификация ве ществ проводилась с помощью специального математического обеспечения, вклю чающего электронную библиотеку стандартных масс-спектров различных веществ.
Определение фракционного состава пептидов проводили методом хроматографии на колонке Супероза-12 аналитическая (1,0 х 30 см), элюент - 0,2 М хлорид натрия, УФ-детектор 280 нм, скорость - 0,4 мл/мин (Остерман, 1981). 2.2.12 Ультрафильтрация
Ультрафильтрацию проводили согласно инструкции к прибору на аппарате Millipore (50-650 RPM) (Франция) с плоскими мембранными модулями Pellicon, рассчитанными на пропускание молекул с массой в 1 и 10 кДа.
Кинематическую вязкость определяют для 1 %-го раствора хитозана в 1% уксусной кислоте (Бондалетова, Сутягин, 2003).
Навеску хитозана массой 1,0 г, помещали в плоскодонную колбу и добавля-ли 99 см 1 %-ой уксусной кислоты. Перемешивали на магнитной мешалке до полного растворения хитозана. Полученный раствор фильтровали через фильтровальную бумагу. Вязкость раствора хитозана определяли по инструкции, прилагаемой к вискозиметру.
Ионный эквивалент добавки определяли по иону меди (II). Метод основывается на определении концентрации комплекса иона меди (II) с трилоном Б в растворе.
Приготовление рабочего раствора хлорида меди. На аналитических весах взвешивали 76,25 мг безводного хлорида меди (II). Навеску переносили в аналити-ческую колбу вместимостью 25 см и добавляли дистиллированную воду в количе-стве 10-15 см . После растворения соли объем раствора доводили до 25 см . Полу-ченный раствор имел концентрацию ионов меди 3,05 мг/см .
Построение калибровочного графика. Готовили стандартные растворы хлорида меди методом разбавления рабочего раствора с содержанием соли от 35 до 3600 мкг/см . К 2 см стандартного раствора хлорида меди добавляли 4 см 0,1 н раствора трилона Б, перемешивали, оставляли на 1 ч. Доводили рН раствора до 4,8-6,5 и измеряли оптическую плотность при длине волны 740 нм на спектрофо-тометре. В кювету сравнения помещали 4 см раствора трилона Б и 2 см воды.
Определение ионного эквивалента. К навеске массой 0,2 г, помещенной в коническую колбу вместимостью 25 см , добавляли 10 см рабочего раствора хло 36 рида меди. Через 24 ч раствор фильтровали на воронке через фильтровальную бумагу. Определяли оптическую плотность фильтрата на спектрофотометре. Концентрацию раствора меди определяли с помощью калибровочного графика.
Расчет ионного эквивалента. По калибровочному графику определяли кон-центрацию ионов меди (в мг/ см ).
Ионный эквивалент образца рассчитывали по формуле: ИЭ = V (3,05 - X) / а, где ИЭ - ионный эквивалент, мг/г; X - концентрация меди в растворе после сорб-ции, мг/ см ; а - масса образца, г; V - объем рабочего раствора хлорида меди, см ; 3,05 - концентрация ионов меди в исходном растворе, мг/ см .
Метод определения удельной поверхности основан на определении оптической плотности раствора метиленового синего и сравнении концентраций красителя в рабочем растворе и в испытываемом растворе (Леваньков, Якуш, 20016).
Приготовление рабочего раствора метиленового синего. Взвешивали 10 мг метиленового синего на аналитических весах. Навеску помещали в аналитическую колбу вместимостью 25 см . К навеске добавляли 10-15 см дистиллированной во-ды. После растворения метиленового синего объем раствора доводили до 25 см .
Построение калибровочного графика. Из приготовленного рабочего раствора метиленового синего методом последовательного разбавления готовили серию стандартных растворов с содержанием метиленового синего от 0 до 0,02 мг/см . Оптическую плотность стандартных растворов определяли на спектрофотометре при длине волны 650 нм. Строили график зависимости оптической плотности от содержания метиленового синего в растворе.
Определение удельной поверхности. К навеске образца массой 0,2 г добавля-ли 9,5 см дистиллированной воды и 0,5 см рабочего раствора метиленового синего. Через 24 ч на спектрофотометре измеряли оптическую плотность при длине волны 650 нм.
Расчет удельной поверхности. По калибровочному графику определяли концентрацию метиленового синего в исследуемом растворе (X). Удельную поверхность образца рассчитывали по формуле: УП = 15,55 (V1C1 - V2X) I m, где УП - удельная поверхность образца, м /г; m - масса образца, г; Vi - объем рас-твора метиленового синего, взятый для испытаний, см ; У2 - объем рабочего рас-твора метиленового синего, взятый для испытаний, см ; X - концентрация метиле-нового синего после эксперимента, мг/см ; 15,55 - площадь поверхности, соответ-ствующая сорбции 1 мг красителя, м /мг.
Определение гепсидина проводили методом масс-спектрометрии с лазерной ионизацией на приборе фирмы "Ciphergen Biosystems" (США) (Lauth et al., 2005; Kemna et al., 2007). Пробу готовили согласно инструкции к прибору.
Биологические испытания проводились в лаборатории иммунологии Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова СО РАМН, г. Владивосток (Приложение 5).
Для исследования были представлены препараты из мороженой печени горбуши: печень сушеная (ПС), хитозан-липидный комплекс - ХЛК и водорастворимый пептидный комплекс - ВПК.
Экспериментальные исследования выполнены на 84 неинбредных белых мышах массой тела 18-20 г, разброс животных в группе по массе тела не превышал ± 10%. Животные получены из питомника РАМН "Столбовая", находились на стандартной диете в боксированных помещениях. Работу выполняли с соблюдением всех правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных работах. Животные контрольных и опытных групп одного пола и возраста получены из питомника одновременно, содержались на стандартном рационе вивария. Животных выводили из опыта с использованием эфирного наркоза.
Технология выделения водорастворимых компонентов печени лососей и получения хитозан-липидных комплексов
Руководствуясь результатами определения полноты экстракции белково-пептидного материала и свойством хитозана, из сушеной и мороженой печени горбуши по следующей схеме получен водорастворимый пептидный комплекс (ВПК) (рис. 18).
Прием, хранение и подготовка сырья: на первом этапе проводят приём сырья по массе, качеству и хранение до переработки.
Подготовка сырья: мороженую печень рыб лососевых пород предварите ль 70 но размораживают на воздухе до достижения температуры в блоке -2 С. Сушеная печень не требует специальной подготовки.
Измельчение размороженной печени проводят на аппаратах для измельчения сырья - волчке или мясорубке - с диаметром отверстий решетки не более 2 мм до однородного состояния. Как показали предварительные опыты, более тщательное измельчение с разрушением клеток не требуется. Высушенную печень измельчать нет необходимости, поскольку она измельчается в процессе сушки.
Экстракцию белково-пептидных компонентов из гомогената замороженной печени проводят в слабощелочной среде при рН = 8 и соотношении экстрагент : вода =1:5. Экстракцию белково-пептидных компонентов из сушеной печени осуществляют в слабокислой среде при рН = 5 и соотношении экстрагент : вода = 1 : 30. Экстракцию проводят при периодическом перемешивании (5 мин перемешивания при скорости вращения ротора 60 об/мин, 20 мин отстаивания) в течение 4 ч.
Добавление раствора хитозана. Перед добавлением раствора хитозана в экстракт сушеной печени его подщелачивают до рН = 8. Далее в экстракт добавляют 1/20 объема 0,3 %-ного раствора хитозана в 3 %-ной уксусной кислоте, рН 2,5.
Перемешивание хитозана. Экстракт с добавленным раствором хитозана перемешивают в течение одного часа (при скорости вращения ротора 20 об/мин) для обеспечения наиболее полного процесса сорбции липидных и высокомолекулярных пептидных компонентов на полимере.
Формирование осадка. Экстракт с хитозаном оставляют на 4 ч для формирования осадка. Надосадочную жидкость отделяли методом декантации.
Сепарирование (центрифугирование). Выпавший осадок отделяли от надоса-дочной жидкости на сепараторе или центрифуге (3000 об/ мин, 20 мин). Осадок представляет собой хитозан-липидный комплекс (ХЛК), осветленный экстракт -водорастворимый пептидный комплекс (ВПК).
Технологическая схема получения Б АД из печени лососей При использовании сублимационной сушки экстракт наливают в кюветы высотой слоя не более 10 мм и замораживают при температуре от минус 45 до минус 50 С в течение 12 ч. Температура в толщине замороженного продукта должна быть не выше минус 40 С. Кюветы с замороженным экстрактом помещают в сублимационную камеру и сушат в соответствии с инструкцией по эксплуатации оборудования. Процесс сушки проводят до выравнивания температуры продукта и полок сублимационной камеры и выдерживают в этих условиях в течение 2 ч. Конечная температура досушивания при этом составляет (25 + 3) С.
При использовании распылительной сушки циклонного типа экстракт печени сушат при температуре не выше 50 С. Выход водорастворимого пептидного комплекса (ВПК), определенный как отношение массы полученного ВПК к массе исходного сырья в процентах, составил от 4,1 до 4,6 % в зависимости от вида сырья (мороженая или сушеная печень) и типа используемого сушильного аппарата. Сублимационная сушка позволяет получить ВПК в более мягких условиях, чем при использовании распылительной сушки, однако такие сушки имеют ограничения по загрузке. Для сушки ХЛК использовали сублимационную сушилку. Процесс проводили до массовой доли воды в конечном продукте не более 8%.
Хитозан-липидный осадок укладывали в кюветы высотой слоя не более 10 мм и замораживали при температуре от минус 45С до минус 50С в течение 12 ч. Кюветы с замороженным хитозан-липидным осадком помещали в сублимационную камеру и сушили в соответствии с инструкцией по эксплуатации оборудования. Процесс сушки проводили до выравнивания температуры продукта и полок сублимационной камеры и выдерживали в этих условиях в течение 2 ч, конечная температура досушивания при этом составляла 25+ 3С.
Выход ХЛК, определенный как отношение массы полученного ХЛК к массе исходного сырья в процентах, составил от 85 до 90 % на сухой вес.
Сушка ВПК и ХЛК возможна и на других сушильных аппаратах, обеспечивающих соблюдение параметров температуры продукта не выше 50 С и получение продукта с массовой долей воды не более 8 %. Окончательный процесс получения ВПК и ХЛК из печени лососевых рыб описывается технологической схемой, представленной на рис. 18. Выход ВПК и содержание в нем белка в зависимости от вида сырья представлены в табл. 23.
Таким образом, установлено, что выход сухого ВПК, полученного из мороженой печени, практически не отличатся от выхода ВПК полученного из сушеной печени. Количество белка в ВПК, полученных из сушеной и мороженой печени, также отличается не значительно.
С учетом имеющегося на производственной базе ТИНРО-Центра и используемого для получения ВПК оборудования для обоснования промышленной переработки печени лососевых рыб нами приняты во внимание следующие обстоятельства. Центрифугирование большого объема жидкости на роторной центрифуге и высушивание экстракта на сублимационном сушильном аппарате занимает много времени из-за ограничения обоих аппаратов по разовой загрузке. Использование этих аппаратов позволяет проводить переработку до 20 кг печени и получать до 900 г готового сухого ВПК за один цикл. При замене в условиях производства роторной центрифуги на проточную, а сублимационного сушильного аппарата на сушильный аппарат другого вида, не имеющего ограничения по разовой загрузке, возможно увеличение количества перерабатываемого сырья и выхода готового продукта за один производственный цикл.
Таким образом, технологическая схема, с помощью которой возможно проводить переработку печени лососей, вполне пригодна для применения в промышленных условиях. Предлагаемое техническое решение соответствует критерию «промышленное применение», так как использование свежего и мороженого или сухого сырья позволяет организовать производство водорастворимого полипептидного комплекса (ВПК) на любом предприятии по производству БАД, в том числе находящемся в удалении от мест промысла, оригинальность технического реше 74 ния защищена патентом: № 2409291 «Способ получения водорастворимого полипептидного комплекса из печени рыб лососевых пород» (Приложение 3). Кроме этого, получаемый в том же технологическом цикле ХЛК может быть использован для получения БАД липопротеидной природы.
Для обезжиривания и осветления экстракта печени лососей использовали хитозан, полученный из панциря камчатского краба. В рамках изучения хитозановых осадков возникает необходимость изучения не только его липидной составляющей, но и собственно матрицы - хитозана. Так как на рынке существует определенный дефицит хитозана, а его свойства не унифицированы, то возникает необходимость изучения свойств других видов хитозана с целью корректировки его использования в разработанной технологии.
При разработке технологии получения БАД из печени лососей был использован хитозан, полученный из панциря камчатского краба. Проведено исследование и сравнение свойств хитозана, полученного из панциря углохвостой креветки, с хи-тозаном из панциря краба.
Из литературных данных известно, что хитозаны полученные из разных источников, имеют различные свойства (Хитин и хитозан..., 2002). Углохвостая креветка является перспективным объектом промысла. В результате ее переработки в качестве отходов образуется достаточно большое количество панциря, из которого согласно ТУ 9289-003-49857769-2003 получен хитозан. Проведено сравнение техно-химических характеристик хитозанов из панциря камчатского краба и углохвостой креветки (табл. 24).
Расчет экономической эффективности производства бад к пище на основе ВПК
Лечение и профилактика заболеваний печени являются одними из важных задач современной медицины, для решения, которых используют различные препараты. Особое место среди них занимают лекарственные средства, которые обладают избирательным действием в отношении печени - гепатопротекторы.
Тетрахлорметан широко применятся для создания модели токсического гепатита у лабораторных животных (Владимиров, Арчаков, 1972). Согласно литературным данным, экспериментальные поражения печени, моделируемые с использованием СС14, по биохимическим характеристикам и морфологическим изменениям достаточно близки к острым поражениям печени различной этиологии у человека (Лазарева, 1976; Лужников, 1994; Звягинцева, Чернобай, 2011). В механизме действия СС14 на мембраны гепатоцитов одним из ведущих моментов является активация процессов перекисного окисления липидов. При метаболизме четыреххло-ристого углерода в эндоплазматическом ретикулуме гепатоцитов под действием ферментов системы микросомального окисления, в том числе цитохрома Р450, образуются свободные радикалы, окисляющие микросомальные липиды, что и обусловливает гепатотоксический эффект СС14 (Есауленко, 2014).При этом в плазме крови увеличивается содержания продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), происходит снижение антиоксидантной емкости печени и фиксируется выход в кровь эндогенных ферментов (Кравченко и др., 2009).
В связи с этим изучение биологических эффектов четыреххлористого углерода используется в исследованиях молекулярной патологии клеточных мембран (Борисов и др., 2007; Eidi et al., 2012).
Было проведено исследование по оценке влияния сушеной печени тихоокеанских лососей (ПС), а так же препаратов, полученных из нее: водорастворимого пептидного комплекса (ВПК) и хитозан-липидного комплекса (ХЛК) на биохимические показатели сыворотки крови у мышей с токсическим гепатитом, индуцированном тетрахлорметаном (Чепкасова и др., 2011, Приложение 4).
При индукции гепатита у мышей наблюдали различные изменения в состоянии печени и биохимических показателях крови (табл. 34).
Гепатит вызвал увеличение массы печени у мышей в 1,6 раза по сравнению с показателями интактной группы, что указывало на развитие воспалительного процесса (Кравченко и др., 2009). Уровень глюкозы увеличился в 1,4 раза, что является следствие тяжелой интоксикации печени.
Биохимическим критерием функционального состояния печени является уровни маркерных ферментов АЛТ и ACT, а так же уровень билирубина (Камышников, 2007). Ферменты аланинаминотрансфераза и аспартатаминотрансфераза относятся к группе аминотрансфераз или трансаминаз, катализирующих обратимое превращение а-кетокислот в аминокислоты путем переноса аминогруппы. Повышение уровня сывороточных АСТ/АЛТ происходит еще до проявления клинических симптомов повреждения печени и потому широко используется в медицинской практике для лабораторной диагностики повреждений печени (Андрушкевич, 2006).
В связи с тем что наибольшее количество этих аминотрансфераз содержится в клетках печени и сердечной мышцы, а содержание в норме в крови очень низкое, справедливо говорить об органоспецифичности этих ферментов (Биохимия, 2003). Токсическое повреждение печени тетрахлорметаном вызывает разрушение клеток и выброс этих ферментов в кровоток. Это позволяет использовать данные ферменты в качестве маркеров повреждения печени (Камышников, 2007). В клетках печени мышей с индуцированным СС14 гепатитом уровень АЛТ превышает уровень ACT в 1,5 раза (табл. 34), что свидетельствует о возникшем токсическом поражении печени.
Образование билирубина происходит в клетках ретикулоэндотелиальной системы печени и является результатом катаболизма геминовой части гемоглобина и других гемсодержащих белков. Вследствие того, что билирубин плохо растворяется в воде, то при попании в кровь он связывается с альбуминами и в таком виде транспортируется в печень. Эта фракция называется свободным или неконъюгиро-ванным билирубином. Билирубин, связанный с альбумином липофилен, что позволяет ему легко растворяться в липидах, проникая в мембраны митохондрий, тем самым нарушая процессы метаболизма клеток. В печени происходит конъюгирова-ние билирубина с глюкуроновой кислотой, в результате которого образуется менее токсичный конъюгированный билирубин, способный растворяться в воде, и который активно против градиента концентрации экскретируется в желчные протоки (Марри и др., 1993; Клиническая биохимия, 2008).
В норме уровень конъюгированного билирубина выше, чем уровень не-конъюгированного. Состояние, при котором количество билирубина в крови превышает норму, называется билирубинемия. Гипербилирубинемия классифицируется как постгепатитная (неконъюгированная, паренхиматозная, токсическая) и ре-гургитационная (конъюгированная) зависимости от того, какой тип билирубина присутствует в сыворотке крови - неконъюгированный или конъюгированный (прямой) (Марри и др., 1993; Клиническая биохимия, 2008).
Индукция гепатита тетрахлорметаном вызывает нарушения в работе печени, и, как следствие, происходит снижение уровня конъюгированного (переработанного) билирубина и увеличение уровня прямого - непереработанного печенью - билирубина. Таким образом, неконъюгированная (токсическая) билирубинемия является следствием токсического действия тетрахлорметана на печень (табл. 34).
Показано, что при индукции гепатита тетрахлорметаном уровень прямого билирубина снижается, а уровни трансаминаз и непрямого билирубина повышаются в 1,5-1,8 раза, что свидетельствует о возникновении интоксикации печени, вызванной ССІ4 (табл. 34).
Одним из наиболее вероятных механизмов, с помощью которых можно объяснить биохимические изменения в крови у подопытных животных, является акти 92 вация процессов ПОЛ, что нашло подтверждение в различных исследованиях (Хильчук М.А., 2013; Есауленко, 2014). Согласно полученным данным, при интоксикации ССІ4, в крови животных наблюдается накопление вторичных продуктов липопероксидации (Хильчук, 2013). Свободные радикалы, образующиеся из ССІ4, способствуют повреждению мембран клеток, модуляции апоптоза, развитию окислительного стресса (Кравченко и др., 2009).
Препараты ПС, ВПК и ХЛК использовали в качестве гепатопротекторов при токсическом гепатите, индукцированном тетрахлорметаном, в двух схемах: в качестве профилактического средства и в качестве лечебного средства (приложение 4). О гепатопротекторной активности исследуемых препаратов печени лососей судили по восстановлению уровня маркерных ферментов крови (АЛТ и ACT), снижению массы печени и изменению уровня билирубина и глюкозы (Колб, Камышников, 1982).
Печень сушеная При использовании в качестве гепатопротектора сушенной печени лососей (горбуши) - ПС - одновременно с индукцией гепатита (профилактическая схема) отмечено снижение показателей массы печени, уровня глюкозы, уровня ACT и нормализация уровней билирубина у мышей с индуцированным гепатитом во всех группах мышей (рис. 24).
Использование ПС после индукции гепатита (лечебная схема) также приводило к снижению показателей массы печени, уровня глюкозы, уровня АЛТ и нормализации уровней билирубина (особенно непрямого) у мышей с гепатитом, индуцированным тетрахлорметаном, во всех группах (рис. 25).
Как было показано ранее, ПС содержит фракцию низкомолекулярных пептидов, свободные аминокислоты, фосфолипиды и жирорастворимые витамины, а так же желчные кислоты и обладает АОА. Все эти компоненты обладают физиологическими эффектами и могут вносить вклад в обеспечение гепатопротекторной активности ПС.
