Введение к работе
Актуальность. В настоящее время производственные процессы, основанные на жизнедеятельности микроорганизмов, приобрели огромное значение. Современная биотехнология прямо или косвенно связана с генной инженерией – созданием новых форм микроорганизмов путем непосредственного изменения их генетической системы для получения высокоэффективных полезных штаммов, что влечет за собой увеличение разнообразия биотехнологической продукции. XXI век объявлен Организацией объединенных наций веком биотехнологии. Достижение превосходства в биотехнологии – одна из важных задач в экономической политике промышленных государств. Возможно, что в XXI веке биотехнология окажет решающее воздействие на решение таких важных проблем, как охрана здоровья, обеспечение человека продовольствием, охрана окружающей природы и энергообеспечение.
Тенденцией сегодняшнего дня является создание функциональных продуктов питания с целью улучшения здоровья потребителя. Чаще всего в этой роли выступают кисломолочные продукты, в состав которых входят живые пробиотические культуры. Эффективность и безопасность этих микроорганизмов для здоровья доказаны за долгие годы их применения (). Сухие колбасы и другие ферментированные мясные продукты также могут быть «курьерами» для доставки пробиотиков в желудочно-кишечный тракт человека.
Одним из основных аспектов биотехнологии является обеспечение безопасности мясных продуктов, поэтому для гарантии безопасности Институт питания РАМН обязательно рекомендует в технологиях производства мясопродуктов, не подвергающихся тепловой обработке, предусматривать добавление в рецептуру эффективных в отношении санитарно-показательной микрофлоры стартовых культур (Шевелева С.А., 2007).
Микробная биотехнология предлагает новые подходы к переработке нетрадиционных видов сельскохозяйственного сырья, появлению безотходных и усовершенствованию классических технологий мясопродуктов, и созданию широкого спектра полноценных высококачественных продуктов питания.
Фундаментальные основы промышленной биотехнологии микроорганизмов, направленной на получение продуктов питания нового поколения, заложены в трудах Ганиной В.И., Костенко Ю.Г., Липатова Н.Н. (мл), Митасевой Л.Ф., Рогова И.А., Семенихиной В.Ф., Соловьева В.И., Титова Е.И., Токаева Э.С., Хорольского В.В., Bover-Cid S., De Vuyst L., Eerola S., Klaenhammer T.R., Leroy F., Niinivaara F., Tanous C., Vandamme E.J. и др.
В пищевой промышленности до последнего времени использовали штаммы микроорганизмов, выделенные из природы. В других промышленных технологиях применяются оптимизированные штаммы, создание которых является важной частью микробиологического синтеза.
Вопросами совершенствования промышленных микроорганизмов традиционно занимаются микробиологи-селекционеры. Для микроорганизмов, недостаточно изученных с точки зрения генетики, единственным инструментом их улучшения является индуцированный мутагенез и ступенчатый отбор лучших вариантов штаммов-продуцентов. Такой метод чрезвычайно трудоемок, и селекционные работы могут занимать многие годы. Развитие методологии генной инженерии, позволяющей выделять и изменять отдельные гены, значительно расширило возможности перестройки геномов микроорганизмов. Сегодня селекция микроорганизмов-продуцентов проводится с помощью методов генной инженерии. Так, если раньше сначала искали активный штамм микроорганизма и только затем разрабатывали процесс получения продукта, то теперь можно взять приспособленный к условиям производства штамм и ввести в него генную конструкцию, которая обеспечит эффективный синтез необходимого продукта.
Конструирование высокопродуктивных штаммов микроорганизмов с заданными свойствами позволит собрать в одном штамме все полезные свойства и элиминировать вредные.
Цель работы – теоретически обосновать и разработать научные принципы совершенствования свойств стартовых культур, позволяющих управлять биотехнологической переработкой сельскохозяйственного сырья, гарантирующей качество и безопасность мясных продуктов.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
провести направленный отбор и идентификацию стартовых культур с применением классических фенотипических методов в сочетании с генетическими методами в соответствии с рекомендациями ФАО/ВОЗ (Аргентина, 2001; Канада, 2002);
расшифровать механизмы формирования качественных характеристик мясопродуктов за счет внесения стартовых культур, и определить основные критерии отбора промышленно-ценных микроорганизмов;
определить генетические детерминанты, ответственные за проявление основных технологических свойств у стартовых культур;
предложить принцип конструирования высокопродуктивных штаммов микроорганизмов с заданными свойствами;
разработать генетическую систему трансформации, экспрессии и селекции перспективных штаммов, и создать штамм-суперпродуцент необходимого технологически-ценного метаболита;
создать коллекцию промышленных микроорганизмов, в том числе штаммов-суперпродуцентов с активностями, направленными на обеспечение качества и безопасности мясных продуктов;
научно и экспериментально обосновать методологию создания бактериальных препаратов (б/п) на основе стартовых культур по совокупности функциональных свойств микроорганизмов, обладающих взаимной совместимостью;
разработать структуру, пользовательские функции и программную оболочку информационного ресурса стартовых культур;
провести оценку эффективности влияния стартовых культур на качество и функциональные свойства модельных мясных систем и готовых мясных продуктов;
разработать и утвердить техническую документацию на бактериальные препараты и новые виды мясопродуктов.
Научная новизна. Теоретически обоснована и предложена схема направленного отбора молочнокислых бактерий, денитрифицирующих стафилококков, дрожжей и мицелиальных грибов. Проведена идентификация молочнокислых бактерий с применением классических фенотипических методов в сочетании с генетическими методами в соответствии с рекомендациями ФАО/ВОЗ. Проведена идентификация дрожжей и мицелиальных грибов по совокупности микро- и макроморфологических свойств. У выделенных штаммов мицелиальных грибов вида Penicillium camembertii были исследованы вторичные метаболиты. Результаты показали, что ни один из штаммов P. camembertii не продуцирует характерные для данного вида микотоксины, а именно циклопиазоновую кислоту (ЦПК) и ругуловазины А и В.
Обоснована возможность использования энтерококков в качестве стартовых культур. Исследования на тестовых питательных средах (тесты на протеолитическое разжижение желатина, ДНКазу и гемолизин) показали отсутствие факторов вирулентности у штаммов Enterococcus faecalis. Поиск генов, отвечающих за признаки патогенности энтерококков: прикрепление бактерий к поверхности эукариотической клетки (agg), синтез токсина, обеспечивающего гемолиз эритроцитов, (gelE), cylA – активация цитолизина и esp – внеклеточный поверхностный протеин, необходимый E. faecalis для колонизации мочевыводящих путей и образования биопленок, показал присутствие генов agg и gelE в геномах исследуемых штаммов E. faecalis, хотя и не проявляющих свою активность фенотипически.
Изучена проблема распространения антибиотикоустойчивости у промышленных микроорганизмов. Определено отношение к антибиотикам различных групп стартовых культур, проведен анализ природы антибиотикоустойчивости с оценкой ее потенциальной опасности в плане горизонтального переноса.
Разработан системный подход направленного отбора и оптимизации свойств бактерий, позволяющий управлять технологическими процессами производства мясных продуктов, и схемы конструирования штаммов с заданными свойствами: «Схема получения суперэкспрессии гена Y» и «Схема получения делеции участка ДНК, кодирующего ген Y».
Изучена генетическая природа бактериальной денитрификации. Проведено сравнение нитритредуктазной активности штаммов S. carnosus и S. xylosus коллекций МГУПБ и ВКПМ. Сконструирован термочувствительный челночный вектор pBTmcs для репликации в грамположительных бактериях. Получен мутантный штамм S. carnosus (thyA–) на основе штамма S. carnosus B-8953. Клонирован и использован селективный маркер – ген, кодирующий фермент тимидилат синтетазу. Сконструирована экспрессионная плазмида для грамположительных бактерий, включающая сильный промотор гена, кодирующего фермент глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназу. С помощью генетических преобразований путем замены промоторной области гена nirR на сильный промотор гена gap на основе штамма S. carnosus (thyA–) получен штамм-суперпродуцент фермента нитритредуктазы S. carnosus LIA-96 (ВКПМ В-9518). Определена значимость наличия всех белковых продуктов нитритредуктазного оперона штамма S. carnosus для активного восстановления нитрита.
Выявлены причины образования биогенных аминов (БА) в мясных продуктах и их влияние на организм человека. Проведен скрининг штаммов с низкой декарбоксилазной активностью или с полным ее отсутствием. Определены генетические детерминанты – tdc гены декарбоксилаз аминокислот у ряда штаммов L. sakei, образующих биогенные амины выше допустимого уровня. Предложен подход к созданию методами генной инженерии штаммов с выключенной декарбоксилазной активностью делецией участка хромосомы с геном tdc. Выбраны штаммы с аминоксидазной активностью, снижающие содержание биогенных аминов в мясных продуктах.
Систематизирована информация о классификации бактериоцинов, механизмах их действия, влиянии условий культивирования штаммов-продуцентов на синтез бактериоцинов стартовыми культурами и методов их определения. Проведен поиск продуцентов бактериоцинов с применением экспресс-метода с нейтрализацией молочной кислоты. Изучена генетика продуцирования бактериоцинов, и определена локализация генетических детерминантов синтеза бактериоцинов у педиококков. Предложены пути к повышению синтеза бактериоцинов стартовыми культурами.
Объяснен механизм ароматообразования в мясных продуктах за счет использования стартовых культур, и определены критерии отбора ароматобразующих микроорганизмов. Проведен скрининг ароматобразующих штаммов с глутаматдегидрогеназной активностью, и изучено их влияние на образование ароматических соединений. Определены генетические детерминанты – гены gdh, кодирующие фермент глутаматдегидрогеназу. Предложен подход к созданию методами генной инженерии штаммов с суперэкспрессией гена gdh.
У стартовых культур определены супероксиддисмутазная (СОД), каталазная, пероксидазная активности и способность связывать ионы металлов переменной валентности Fe2+ и Cu2+, способствующие инактивации производных форм кислорода. Определены генетические детерминанты фермента супероксиддисмутазы – sodA гены у микроорганизмов различных таксонов. Предложен подход к созданию методами генной инженерии штаммов с суперэкспрессией гена sodA.
Предложены научные и практические основы создания бактериальных препаратов, содержащих стартовые культуры различных таксонов, обладающие взаимной совместимостью.
Практическая значимость и реализация результатов. Создана коллекция стартовых культур для мясной промышленности, содержащая микроорганизмы следующих видов: Lactobacillus curvatus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus claussenii, Macrococcus caseolyticus, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus xylosus, Debaryomyces vanriji, Debaryomyces polymorphus, Debaryomyces hansenii, Candida famata, Penicillium camembertii.
Предложены пути предотвращения распространения детерминантов антибиотикоустойчивости промышленными микроорганизмами.
Предложен подход к изучению и отбору непатогенных стартовых культур энтерококков.
Разработаны экспресс-методы отбора штаммов с аминоксидазной активностью, ароматобразующих штаммов с глутаматдегидрогеназной и трансаминазной активностью с помощью ТСХ.
Создана программа с базой данных основных функциональных свойств микроорганизмов, входящих в коллекцию МГУПБ, позволяющая проектировать состав бактериальных препаратов комплексной направленности для мясных продуктов.
Проведена паспортизация промышленно-ценных штаммов с помощью ДНК-фингерпринта (геномной дактилоскопии) методом ПЦР с использованием штаммоспецифических праймеров. Проведено депонирование штаммов стартовых культур в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика, ряд штаммов поставлен на национальное патентное депонирование.
На основе природных штаммов разработаны бактериальные препараты: «Лактомикс», предназначенный для биотрансформации мясного сырья и производства ферментированных мясопродуктов; «Аромалакт» – для цвето- и ароматообразования ферментированных мясопродуктов и биотрансформированного мясного сырья; «Биосейф» – для снижения уровня биогенных аминов в ферментированных мясопродуктах и биотрансформированном мясном сырье, ТУ 9229-045-02068640-07; «Дебарс плюс» – для производства ферментированных мясных изделий, ТУ 9229-046-02068640-07.
На основе штамма S. carnosus LIA-96 разработан бактериальный препарат «Биоцвет», предназначенный для производства термически обработанных предварительно ферментированных мясных изделий, ТУ 9229-047-02068640-07 (на стадии согласования с органами Роспотребнадзора по договору № С-77НЛ/06 от 18.12.2006 г.).
Молекулярно-генетическая экспертиза, проведенная ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, установила, что штамм S. carnosus LIA-96 не является генетически модифицированным, так как был получен путем перестройки собственного генетического материала без включения в его состав чужеродной ДНК. Показана фенотипическая и генотипическая стабильность данного штамма. Проведено молекулярно-генетическое исследование, подтверждающее отсутствие в геноме штамма S. carnosus LIA-96 генов, кодирующих белки-токсины.
Проведены клинические исследования штамма S. carnosus LIA-96 in vivo на белых линейных мышах, в результате которых штамм признан безопасным по показателям безвредности, токсичности, токсигенности и вирулентности.
Разработаны рецептуры и технологии новых видов комбинированных и традиционных мясопродуктов: Мясные продукты в форме первого сорта с добавлением биотрансформированного легкого, ТУ 9213-002-51611136-03, Паштеты в оболочке с добавлением биотрансформированной селезенки, ТУ 9213-002-00423769-03, Полуфабрикаты мясные рубленые с бактериальным препаратом «Лактомикс», ТУ 9214-350-23476484-08, Колбасы сырокопченые, ТУ 9213-007-224-68-005-08, Колбасы сыровяленые, ТУ 9213-008-224-68-005-08, Продукты из свинины деликатесные, ТУ 9213-007-02068315-08. Промышленная апробация разработанных технологий проводилась в условиях Черкизовского МПЗ, ЗАО «Микояновский мясокомбинат», ОАО «Царицыно», ООО МПЗ «Рублевский», ОАО «ИКМА», ООО «АНСЕЙ ВМК», Ростовского и Новочеркасского мясокомбинатов, ЗАО «Агрофирма «Мясо», ООО «Гиперглобус».
Результаты работы нашли применение в учебном процессе МГУПБ на кафедре «Технология мяса и мясопродуктов», при проведении специализации инженеров-технологов мясной промышленности, при выполнении дипломных и диссертационных работ. Новизна решений защищена патентами, справками о депонировании стартовых культур в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика. Практическая значимость работы подтверждена соответствующими документами.
Апробация работы. В диссертации обобщены результаты исследований, проведенных лично автором, при его непосредственном участии и под его руководством.
Основные результаты работы были предметом докладов и обсуждений на Международных и Российских научных конференциях, семинарах: «Проблемы экологической безопасности Северо-Кавказского региона», Ставрополь, 2000; «Пищевой белок и экология», Москва, 2000; «Экологические, технологические и экономические аспекты производства продуктов питания», Семипалатинск, 2000; «Пища, экология, человек», Москва, 2001; «Пробиотические микроорганизмы – современное состояние вопроса и перспективы использования», Москва, 2002; «Технологические аспекты комплексной переработки сельскохозяйственного сырья при производстве экологически безопасных пищевых продуктов общего и специального назначения», Углич, 2002; «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2002, 2003, 2005, 2007, 2008; «Живые системы и биологическая безопасность населения», Москва, 2002; «Современные технологии переработки животноводческого сырья в обеспечении здорового питания: наука, образование и производство», «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы», Москва, 2004; «Значение биотехнологии для здорового питания и решения медико-социальных проблем», Калининград, 2005; «Живые системы и биологическая безопасность населения», Москва, 2005; Выездной пленум НОГР клинико-патогенические аспекты желудочно-кишечного дисбиоза при заболеваниях органов пищеварения: диагностика, лечение и профилактика, 2005; Биология наука XXI века: 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых, посвященная 50-летию Пущинского научного центра РАН, Пущино, 2006; «Успехи медицинской микологии», 2006; «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 2006; «Живые биосистемы 2007», Москва, 2007.
Результаты работы удостоены дипломами, грамотами и медалями конференций «Биотехнология: состояние и перспективы развития», «Биотехнология. Вода и пищевые продукты», «Биотехнология и медицина», «Технологии живых систем», «Живые системы и биологическая безопасность населения», биотехнологической выставки-ярмарки «РосБиоТех-2007». Исследования выполнялись в рамках научных тематик МГУПБ, их результаты регулярно рассматривались на научно-техническом и ученом советах. По материалам диссертации опубликовано: 101 работа (в т.ч. статей в журналах, рекомендованных ВАК – 17, в других изданиях – 37); монография, патенты, два лабораторных практикума и методические указания для студентов специальностей 270900, 250301, 240901, 240902 и магистров направления 260100.
Структура и объем работы. Диссертационная работа включает введение, 9 глав, выводы и приложения, изложена на 363 страницах основного текста, содержит 76 таблиц и 133 рисунка. Список литературы состоит из 288 источников.
