Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 11
1.1 Свободные аминокислоты и дипептиды моллюсков. Содержание и физиологическая роль 12
1.2 Основные функции аминокислот и потребности в них животных организмов 20
1.3 Использование свободных аминокислот в качестве БАД и лекарственных средств 22
1.4 Антиоксиданты: возможность применения в качестве БАД 25
1.5 Антиоксидантные свойства аминокислот и гистидинсодержащих дипепти-дов . 27
1.6 Способы получения препаратов, содержащих свободные аминокислоты 32
2 Экспериментальная часть . 39
2 Объекты, материалы и методы исследований 39'
2.1 Объекты и материалы исследований . 39
2.2 Методы исследований 41
3 Результаты и их обсуждение 48
3.1 Разработка методов получения препаратов, содержащих свободные аминокислоты 48
3.1.1 Обоснования выбора сырья 48
3.1.2 Подбор условий проведения ферментативного гидролиза 53
3.1.3 Состав полученных ферментативных гидролизатов 62
3.2 Технологическая схема получения БАД «Моллюскам» 65
3.2.1 Технология получения препарата 65
3.2.2 Разработка рецептуры потребительских форм 68
3.3 Сравнительная характеристика различных методов получения БАД «Моллюскам» 71
3.4 Модификация технологии БАД «Моллюскам» 74
3.5 Оценка антиоксидантной активности БАД «Моллюскам» 79
3.5.1 Образование хлораминовых комплексов при взаимодействии «Моллю-скама» с гипохлорит-анионом 80
3.5.2 Ингибироваиие скорости образования свободных радикалов методом обесцвечивания ABTS (2,2 азинобис-3-этил-беизотиадолин-б-сульфоновой кислоты) . 84
3.5.3 Определение накопления МДА в модельных экспериментах 85
3.5.4 Определение накопления МДА в сыворотке крови пациентов 87
3.6 Экспериментальное обоснование возможности применения БАД «Моллюскам» при коррекции различных патологических состояний 87
3.7 Технико-экономические показатели промышленного производства БАД «Моллюскам» 95
Выводы 97
Список литературы 100
Приложение 114
- Использование свободных аминокислот в качестве БАД и лекарственных средств
- Объекты и материалы исследований
- Технологическая схема получения БАД «Моллюскам»
- Оценка антиоксидантной активности БАД «Моллюскам»
Введение к работе
Актуальность работы. Согласно современным литературным данным, морские беспозвоночные (двустворчатые моллюски, голотурии, морские ежи и др.) содержат уникальные биологически активные вещества различной природы, являющиеся основой для создания лечебно-профилактических пищевых продуктов или лекарственных средств (Слуцкая, 1972; Лебедев, 1974; Новикова и др., 1998; Левинтони др., 1999).
У морских беспозвоночных основную долю азотистых экстрактивных соединений внутренних органов составляют аминокислоты и родственные им соединения. Наиболее высокое содержание свободных аминокислот, в том числе и незаменимых, обнаружено в тканях двустворчатых моллюсков. Для них характерно высокое содержание глицина, аланина, серина, аргинина и циклических аминокислот. Доминирующими аминокислотами мышечных белков являются глутаминовая и аспарагиновая (Кудряшов, Гончаренко, 1999). В тканях моллюсков обнаружены такие вещества, как таурин и бетаин, которые пополняют общее число анионов и вносят определенный вклад в регуляцию осмотического давления. Только у моллюсков найдены метилированные производные гистидина, которые вместе с Р-аланином являются возможными предшественниками анзерина (метилированное производное карио-зина) и офидина (р-аланил-^-метил гистидин) (Лебедев, 1974; Болдырев, 1998).
Кроме аминокислот, встречающихся в составе тканей высших животных, у моллюсков обнаружено значительное количество аминокислот необычного строения. К ним относятся саркозин, фосфосерин, триметилгистидин, а-аминобензойная кислота, цитруллин, орнитин и некоторые другие (Аюшин и др., 1999). О биологической роли этих компонентов в настоящее время известно очень мало, они обозначены главным образом как промежуточные продукты метаболизма аминокислот и мочевины. Отсутствуют сведения о потенциальном лекарственном механизме действия этих компонентов.
Большинство из аминокислот, содержащихся в моллюсках, являются непременными участниками белкового обмена в организме человека, оказывают значительное стимулирующее действие на его функции и необходимы в качестве питательных добавок на определенных стадиях его развития.
В настоящее время препараты, содержащие свободные аминокислоты, используются не только как источники аминокислот для лиц, занятых интенсивным физическим или умственным трудом (Тутельян и др., 1999), но и как вспомогательные средства при функциональных нарушениях ЦНС (повышенная возбудимость, снижение физической активности, ухудшение памяти и др.) (Федеральный реестр...., 1999). В тоже время способность отдельных аминокислот и пептидов принимать участие в антиоксидантнои защите организма не рассматривается. Тем не менее, известно, что многие аминокислоты способны ингибировать различные формы свободных радикалов (Меныцикова, Зенков, 1993; Нечаев, 2003, Лёвочкина, 1993). К ним относятся триптофан, фенилаланин и тирозин, имеющие в ароматическом кольце одну или несколько гидроксильных групп, а также серусодержащие аминокислоты - таурин, цистеин, метионин. Наиболее активными антиоксидантами из компонентов аминокислотной природы являются таурин и гистидин-содержащие дипепти-ды. Таурин представляет собой серусодержащую аминокислоту, не входящую в состав белков и образующуюся в процессе метаболизма метионина. Структурная простота этой небелковой р-аминокислоты сопровождается сложностью и разнообразием биологических эффектов, что позволяет поставить ее в один ряд с важнейшими биологически активными веществами. Таурин вовлекается в сохранение нормального функционирования различных органов и тканей и, вероятно, занимает одно из центральных мест в реализации тех процессов, которые защищают клетки от разнообразных повреждающих факторов.
Таким образом, особенности химического состава двустворчатых моллюсков позволяют рекомендовать их в качестве источника БАД, обогащенных свободными аминокислотами, и рассматривать такие БАД в качестве антиок-
сидантов. В числе используемых объектов могут быть привлечены традиционно добываемые виды - гребешок, мидия, а также новые для промысла виды (спизула, анадара, гребешок белорозовый, гребешок Свифта, петушок, модио-лус длиннощетинистый, мерценария Стимпсона, мактра китайская, каллиста короткосифонная, перонидия жилковатая). В качестве еще одного массового источника сырья могут быть рассмотрены мантия и щупальца головоногих моллюсков.
Важнейшим этапом работы по созданию БАД является разработка эффективной технологии, позволяющей обогатить целевые продукты свободными аминокислотами. Наиболее распространенным методом получения подобных препаратов является кислотный гидролиз, обеспечивающий наибольший выход свободных аминокислот, однако при этом наблюдается частичное или полное разрушение отдельных аминокислот. Этот метод требует использования концентрированных кислот при высоких температурах и их последующей утилизацией. Разработанные в ТИНРО-центре методы ферментативного гидролиза (Пивненко и др. 1997), могут быть адаптированы к различным видам морского сырья, в том числе к тканям двустворчатых моллюсков. Модификация этих методов позволит регулировать специфичность ферментов, глубину гидролиза и состав получаемых БАД.
Целью настоящей работы явилась разработка биотехнологии биологически активной добавки к пище «Моллюскам», включая обоснование выбора сырьевых источников и направлений практического применения.
Для достижения целей поставлены следующие задачи:
исследование химического состава сырьевых источников для получения БАД «Моллюскам»;
подбор параметров ферментативного гидролиза применительно к различным видам сырья;
исследование состава полученных препаратов;
выявление перспективных дополнительных источников для получения БАД, исследование свободных аминокислот (САК) и гигиенической безопасности;
разработка методов регуляции скорости, глубины и специфичности ферментативного гидролиза;
оценка антиоксидантной активности препаратов, содержащих свободные аминокислоты с использованием различных методов;
оценка безопасности, исследование биологической активности и функциональной направленности действия.
Научная новизна: Впервые исследован полный состав свободных аминокислот в тканях двустворчатых и головоногих моллюсков, а также содержание таурина и гистидинсодержащих дипептидов в БАД «Моллюскам» на их основе. Впервые установлено, что соотношение суммарного количества ал:осн:2ар = 2:1:1 является устойчивым для БАД «Моллюскам» из двустворчатых и головоногих моллюсков. В качестве показателей подлинности этого продукта предложено использовать указанное соотношение наряду с нижним пределом содержания таурина. Исследовано влияние липофильности реакционной среды на скорость и глубину ферментативного гидролиза для однокомпонентных белковых субстратов и в условиях сложных многокомпонентных систем (тканей моллюсков) Определены пороговые точки концентраций этанола, в пределах которых сохраняется активность ферментов, дан сравнительный анализ состава свободных аминокислот в препаратах, полученных различными методами. Обоснованы пути и методы регуляции ферментативного катализа при различных условиях реакционной среды применительно к используемым сырьевым источникам.
Показано, что БАД «Моллюскам» обладает антиоксидантными свойствами. Впервые прямыми и косвенными методами проведена сравнительная оценка антиоксидантной активности препаратов, содержащих свободные аминокислоты. Показана способность компонентов БАД «Моллюскам» связывать
гипохлорит-анион, ингибировать образование свободнорадикального катиона ABTS"+, предотвращать накопление МДА.
Впервые установлена безопасность БАД «Моллюскам» и ее эффективность при применении в комплексе лечения ряда заболеваний.
Практическая значимость. Разработан способ получения БАД «Моллюскам», позволяющий наиболее эффективно обогащать целевой продукт свободными аминокислотами и регулировать его состав путем изменения условий реакции. Состав БАД и способ ее получения защищены патентом: №2171066 «Продукт, обогащенный свободными аминокислотами, и способ его получения».
Разработана и утверждена документация на БАД «Моллюскам»: ТУ 9283-247-00472012-04, ТИ № 36-247-2004 и двустворчатые моллюски - сырец: ТУ 9253-146-00472012-2001, ТИ№ 36-191-2001
По результатам экспертной оценки и санитарно-гигиенических исследо
ваний в федеральном центре Госсанэпиднадзора РФ «Моллюскам» соответст
вует требованиям СанПиН и зарегистрирован как БАД: санитарно-
эпидемиологическое заключение № 77.99.11.003.Т.001763.10.04 от
08.10.2004.
Препарат внедрен в производство и выпускается в ФГУП «ТИНРО-Центре» и ОАО «Биополимеры».
Апробация работы: основные положения были представлены на научно-практической конференции «Состояние здоровья населения Дальнего Востока. Новые медицинские технологии с использованием биоресурсов» (Владивосток, 1999); Международном симпозиуме «Пищевые биотехнологии: Проблемы и перспективы в XXI веке» (Владивосток, 2000); региональной конференции молодых ученых «Проблемы экологии и рационального природопользования Дальнего Востока» (Владивосток, 2000); Международном симпозиуме «Пищевые биотехнологии: проблемы и перспективы в XXI веке» (Владивосток, 2004).
Положения, выносимые на защиту:
Биотехнология БАД к пище, основанная на рационализации процесса ферментативного гидролиза приводит к получению продуктов с высоким содержанием свободных аминокислот, таурина и гистидинсодержащих дипеп-тидов.
Регулирование специфичности, скорости и глубины ферментативного гидролиза включает изменение липофильности реакционной среды и вызывает активацию протеолитических ферментов.
Антиоксидантная активность БАД «Моллюскам», содержащей свободные аминокислоты, таурин и ГСД, проявляется в прямых реакциях нейтрализации свободных радикалов и в опосредованных реакциях накопления продуктов окисления in vivo и in vitro.
Публикации: по теме диссертации опубликовано 10 работ.
Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, экспериментальную часть, заключение, выводы, список литературы, содержащий 137 источников (в том числе 23 зарубежных). Работа изложена на 166 страницах, содержит 27 таблиц, 20 рисунков и 16 приложений.
Использование свободных аминокислот в качестве БАД и лекарственных средств
Утверждения о том, что человек получает достаточное количество аминокислот из пищевых белков и не нуждается в их дополнительном приеме, не соответствует современным научным концепциям. Тот факт, что аминокислоты присутствуют в организме естественным образом, свидетельствует лишь о том, что при их применении практически отсутствует риск побочных дейст вий, присущий медикаментам. Существуют адекватный уровень (используется в тех случаях, когда рекомендуемая норма потребления не может быть определена) и верхний допустимый уровень потребления аминокислот (Рекомендуемые уровни потребления ..., 2004). Однако в настоящее время нет общепризнанных суточных дозировок аминокислот, как это принято, например, для витаминов и микроэлементов. Это связано и с различными условиями питания, и с разными целями профилактики и лечения. Если для лиц, занятых интенсивным умственным и физическим трудом, предлагаемые дозировки аминокислот могут составлять 1-100 мг в сутки, то для спортсменов они должны быть увеличены многократно. В случае назначения препаратов с целью лечения и профилактики определенных заболеваний дозировки подбираются согласно результатам медицинских испытаний.Как показано в таблице 5, многие аминокислоты являются нейромедиа-торами и стимуляторами метаболизма в различных тканях (Гриффит, 2000).
Препараты, содержащие свободные аминокислоты, представляют собой ценные биологически активные добавки, позволяющие не только компенсировать недостаток эссенциапьных компонентов, но и участвовать в лечении и профилактике ряда заболеваний.В настоящее время препараты, содержащие свободные аминокислоты, используются не только как источники аминокислот для лиц, занятых интенсивным физическим или умственным трудом (Тутельян и др., 1999), но и как вспомогательные средства при функциональных нарушениях ЦНС (повышенная возбудимость, снижение физической активности, ухудшение памяти и др.) (Федеральный реестр..., 1999).
В последние годы появилась большая группа препаратов, выделенных из моллюсков, обладающих широким спектром лечебно-профилактического, противолучевого и антистрессорного действия. Это препараты - МИГИ-К, "Орбитар", "Myhyda", "Биполан", БУК-М, БУК-Р, МКС (мидийный клеточный сок сублимированный), "Моревит" (белково-углеводный экстракт) (Пат. РФ 2090084, 2121844, 2134523, 2066105, 2017439; заявка № 94035039/14; Овсянникова и др., 1999; Пархоменко и др., 1999, Шульгина Л.В. и др., 2001). Известен также новый ферментно-кислотный гидролизат МФК-ЛП, на основе которого создан антивирусный препарат «Вирамид», эффективный при лечении гриппа разных серотипов - А1, A3 и В (Бойков и др., 1997).
Полученные препараты обладают неспецифическими иммуномодули-рующими свойствами, противоопухолевой активностью, ускоряют выведение радионуклидов (А.с. РФ 1827811), применяются при лечении гепатитов и как ингибиторы вируса гриппа (Пат. РФ 2043109), как средство, обладающее антивирусной активностью в композиции для лечения герпеса (Заявка № 98113555/14), а также для повышения резистентности человека к неблагоприятным факторам (Кудряшов, Гончаренко, 1999).
Возможность применения пищевых факторов для нормализации обмена веществ, в том числе и для регуляции антиоксидантного статуса организма, привлекает интерес к этой проблеме. Это вызвано тем, что сбой в антиокси-дантиой системе и чрезмерное усиление процессов свободнорадикалы-юго окисления рассматривается как важнейшее звено в развитии различных заболеваний (Лобарева, 1995).
Состояние окислительного стресса связано с интенсивной генерацией свободнорадикальных соединений, истощением антиоксидантной защиты и нарушением сбалансированности ее ферментативных и. неферментативных компонентов. Свободнорадикальное повреждение - синдром пероксидации -включает в себя повреждение клеточных и внутриклеточных мембран, инак тивацию или трансформацию ферментов, подавление деления клеток, накопление в клетках инертных продуктов полимеризации (Дубинина и др., Лоба-рева и др., 2000; Сейфула, Борисова, 1990; Воскресенский, 1992; Овсянникова и др., 1999) (рис. 1).Овъ НОВг ОТ Н07
Отсюда вытекает большая практическая значимость способов предупреждения и ослаблени этих процессов. Это достигается с помощью антиокси-дантов (АО) или антиокислителей, способных тормозить или устранять сво-боднорадикальное окисление (СРО), т.е. вещества которые вступают в реак цию с окислительными свободными радикалами и тем самым уменьшая их концентрацию в реакционной среде.Число эндогенных соединений, относимых в литературе к АО, постоянно возрастает. Однако универсальной классификации антиоксидантов пока нет. Вещества, обладающие способностью подавлять СРО, можно разделить на структурные, затрудняющие доступ компонентов окислительной реакции друг к другу или модифицирующие окисляемость субстрата (а-токоферол, холе-стерол, хелаторы металлов переменной валентности), и истинные АО, способные, вступая в реакцию с активными формами кислорода (АФК), образовывать либо молекулярные продукты, либо радикалы с меньшей реакционноспо-собностью.
Каждый из перечисленных АО является радикальной ловушкой сам по себе, а все вместе они составляют цепочку окислительно-восстановительных превращений, в результате которых образуется менее активная форма радикала. (Кения и др., 1993; Лобарева и др., 1995)
Если рассматривать аминокислоты в качестве антиоксидантов, то имеет смысл характеризовать их как смешанную группу низкомолекулярных антиоксидантов. Низкомолекулярные антиоксиданты и, в особенности, аминокислоты выполняют ряд собственных метаболических функций, напрямую не связанных с их антиоксидантными свойствами. Тканевой уровень низкомолекулярных антиоксидантов определяется соотношением активности ферментных систем их образования и метаболических превращений транспорта и выведения из организма.
Практически всем низкомолекулярным эндогенным антиоксидантам присуща нелинейная зависимость между их концентрацией и степенью ингибиро-вания свободнорадикальных процессов. Можно предполагать, что совокупность низкомолекулярных водорастворимых соединений этого типа регулиру ет интенсивность свободнорадикальных процессов в тканях и обеспечивают их участие в других метаболитических путях (Кения и др., 1993).
Свободные аминокислоты в организме выполняют самые разнообразные функции. При этом антиоксидантная защита не является их основной функцией, но благодаря своей химической структуре, многие из них могут участвовать во взаимодействии со свободными радикалами непосредственно или опосредованно. Поэтому представляет интерес рассмотреть антиоксидантные свойства отдельных аминокислот.
Ароматические аминокислоты. Аминокислоты, содержащие в своем составе ароматическое кольцо — триптофан, фенилаланин и тирозин относятся к фенольным антиоксидантам. Поскольку главным действующим началом, обеспечивающим способность тормозить антирадикальные процессы окисления является гидроксильная группа, присоединенная к ароматическому ядру, то в этой группе основное значение следует отвести тирозину. Тирозин является предшественником нейротрансмиттеров иорэпинефрина и допамина, которые наряду с другими свойствами, обладают регулирующим воздействием на эмоциональность. Он снижает аппетит уменьшает жировую массу, способствует производству меланина, а также улучшает функцию надпочечников, гипофиза и щитовидной железы. Фенилаланин - незаменимая аминокислота, участвующая в процессах переноса нервных импульсов в составе допамина и иорэпинефрина. Поэтому количество фенилаланина в головном мозге влияет на настроение, способствует снижению головных болей, улучшению памяти и способствует обучаемости, фенилаланин применяют при лечении депрессий, болезни Паркинсона, шизофрении (Тутельян и др., 1999; Пилат, Иванов, 2002). Триптофан - незаменимая аминокислота, из которой в организме синтезируется витамин ниацин и серотонин нейромедиатор головного мозга. В клинической практике триптофан применяют при бессоннице, депрессии, для стабилизации настроения, при контроле за массой тела и стимуляции выделения гормона роста (Тутельян и др., 1999).
Объекты и материалы исследований
Биологический материал: двустворчатые моллюски: мидии (Mytilus edulus, Mytilus trosselus, Crenomytilus grayanus), гребешок Приморский
(Patinopecten yessoensis), спизула сахалинская (Spisula sachalinensis), корбику-ла (Corbicula japonica), каллиста короткосифонная (CalHsta brevisiphonata), мерценария Стимпсона (МегсепагІа stimpsoni), мактра китайская (Mactra chinensis), анадара (Anadara brougtoni) и кальмары - тихоокеанский (Todarodes pacificus) и командорский (Berryteuthis magister), отходы переработки минтая, мясо тюленя заготовленные в экспериментальных условиях на месте промысла и в замороженном виде доставленные в ТННРО-центр; ферментные препараты - гепатопанкреатин из гепатопанкреаса камчатского краба (ТУ 9280-055-02698170-00), пилорин из пилорических придатков лососевых рыб (ТУ 9280-1203-00472012-96), полученные по собственному методу (Пивненко, 1986), мегатерии, выделенный из клеточных культур микроорганизма Bacillus megaterium (ТУ № 00479942-002-94), протамекс из Bacillus protease (Denmark), (Гигиеническое заключение № 77.99.9.916.П.154ПЛ0.00), препараты, содержащие свободные аминокислоты и дипептиды.
В качестве субстратов для определения протеолитической активности использовали казеин по Гаммерстену, гемоглобин («Биолар», Латвия), субстраты для определения активности трипсина и химотрипсина: ТАМЭ, БТЭЭ («Sigma», США).Схема проведения экспериментальных работ и методы исследования. Экспериментальные работы выполнялись в соответствии со схемой исследований (рис. 2).
Для определения общей протеолитической активности (ГОСТ 20264.2-88) использовали 2 % раствор казеина (в растворимое состояние переводили нагреванием в течение 15 мин) в 0,05 М фосфатном буфере рН 8,0. К раствору субстрата добавляли 2 мл 0,5 - 1 % раствора ферментного препарата, выдер оживали в течение 10 мин при температуре 37 С, реакцию останавливали добавлением трихлоруксусной кислоты (ТХУ), образовавшийся осадок отфильтровывали и измеряли оптическую плотность при X = 280 нм против контрольного раствора, полученного добавлением к 2 мл раствора субстрата 4 мл 5 % ТХУ, а затем 2 мл раствора ферментного препарата с последующей фильтрацией.
За единицу активности принимали такое количество фермента, которое приводит к увеличению поглощения при 280 нм на 1 оптическую единицу за 1 мин (единица измерения удельной активности - Е/г).
Метод определения активности с использованием нерастворимыхбелков.Для определения активности с использованием нерастворимых белков использовали 2 мл 0,5 % суспензии субстратов при рН 8, к ней добавляли 2 мл ферментного раствора концентрации 0,05-0,1 %, выдерживали 4 часа при температуре 37 С, затем отфильтровывали и замеряли оптическую плотность при длине волны 280 нм. В качестве контрольных растворов использовали раствор фермента той же концентрации и раствор полученный после фильтрации коллагена без добавления фермента.
Расчет активности проводили по формуле:240 - время реакции, мин; а - навеска препарата в г Метод определения накопления растворимых белковых компонентов.Для определения накопления продуктов гидролиза использовали модифицированный метод Ансона (Алексеенко, 1968).
Гидролиз белков проводили в соотношении сырье:вода от 1:2, 1:3, 1:4 и 1:5 при рН 6, 8; температуре 37 С, концентрации ферментного препарата 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 %. Через каждый час отбирали по 1 мл раствора и проводили осаждение 5 мл 10 %-ной ТХУ, затем отфильтровывали. Прирост оптической плотности измеряли при длинне волны 280 нм.
Определение содержания белка и различных форм азотистых соединенийОпределение содержания белка проводили по методу Лоури (Lowry et al., 1951).Содержание общего азота определяли рефрактометрически (Грачева и др.І 1982) График определения общего азота представлен на рисунке 3.Содержание аминного азота определяли методом формольного титрования (Шапиро, 1976).
Степень гидролиза определяли как соотношение аминного азота к общему.Определение содержания триптофана (Devenyi et al., 1991).К 0,5 мл испытуемого раствора прибавляли 1 мл воды, 0,5 мл 5 % раствора П-д им етил аминобензоальде гида в концентрированной соляной кислоте и 5 мл концентрированной соляной кислоты. Перемешивали, оставляли при комнатной температуре на 5 минут, и добавляли 0,1 мл 0,2 % водного свежеприготовленного раствора нитрата натрия. Через 10 минут определяли оптическую плотность полученного синего раствора при X = 540.
В качестве контрольного раствора брали 0,5 мл препарата, 5 мл концентрированной соляной кислоты и 1,5 мл воды. Вычисляли разность и находилиф содержание триптофана по калибровочному графику (рис. 4).
Определение состава аминокислот проводили в стандартных условиях на аминокислотном анализаторе «Hitachi - 935» (Япония). При определении общего аминокислотного состава обезвоженный с помощью ацетона материал подвергали кислотному гидролизу при температуре 110 С.
Определение молекулярной массы белковВ качестве сорбента использовали полиэтиленоксидный гель Toyopearl(«TOYO SODA», Япония). Молекулярную массу белков определяли методомгель-хроматографии, построив калибровочный график зависимости относительного объема элюции к молекулярной массе. Для определения свободногоф объема колонки (1,5 х 49 см) использовали голубой декстран. В качестве бел ков-маркеров использовали: даларгин (800 Да), цитохром С (12 кДа), лизоцим, (3-лактоглобулин («Sigma», США). Калибровочный график для определения молекулярной массы белков представлен на рисунке 5.
Методы определения антиокислительной активности Метод определения антиокислительной активности карнозина (Пат. SU 1807353).К 1 мл 1 мМ раствора карнозина добавляли 1 мл 5 мМ раствора гипохло рита натрия и спектрофотометрировали при 292 нм. Активность определялирН 7 в соотношении 1:1:5 по объему), 20 мкл 10 %-ного раствора FeCb пере ф мешивали и грели на кипящей водяной бане в течение 10 мин. Затем реакци онную смесь охлаждали в водно-ледяной бане, добавляли 1 мл 91 %-ной ТХУ, 2 мл хлороформа, встряхивали и центрифугировали 15 мин при g = 5000 об/мин. Верхний слой отделяли, измеряли его оптическую плотность при 532 нм и рассчитывали концентрацию МДА по молярному коэффициенту погло-щения его аддукта с тиобарбитуровой кислотой, равному 1,56x10 .
Метод с использованием ABTS (-2,2 азинобис-3-этил-бензотиадолин-бсульфоновой кислоты) (Re, Pellegrini et all., 1999). Как стандартный антиоксидант использовали тролокс (6-гидрокси2,5,7,8-тетраметшгхроман-2-карбоксильная кислота, Aldrich Chemical Co.,)Тролокс (2,5 мМ) растворяли в этаноле 5 мМ фосфатном буфере рН 7,4.Растворы моллгоскама готовили на основе дистиллированной воды.Ход эксперимента:Смешивали 7 мМ раствор тролокса и 2,45 мМ раствор персульфата калия в соотношение 1:0,5 и оставляли в темноте при комнатной температуре на 12-16 час. На этой стадии происходит образование ABTS +.Затем полученный раствор разводили до тех пор, пока поглощение при 734 нм не достигнет 0,70+0,02.
Технологическая схема получения БАД «Моллюскам»
На основании проведенных исследований нами был разработана технология получения ферментативных гидролизатов из двустворчатых и головоногих моллюсков «Моллюскам», предлагаемых в качестве БАД, содержащих свободные аминокислоты.
Схема технологического процесса включает стадии представленные на рисунке 15.Стадия подготовки включает в себя мойку и сортирование сырья для удаления песка, ила и других загрязнений, а также разделку. Моллюски промывали в проточной морской или питьевой воде при интенсивном перемешивании. Промытые моллюски сортировали, отделяя прилов, уснувшие раковины. Затем створки крупных раковин двустворчатых моллюсков вскрывали ножом, мягкие ткани осторожно отделяли от створок и вынимали из раковины и направляли на измельчение. У гребешка мускул идет на дальнейшую переработ ку, а мантию направляли на измельчение. Мелкие виды двустворчатых моллюсков направляли на измельчение вместе с раковиной. Головы кальмаров дефростировалй при температуре 20С, отделяли щупальца и мягкие ткани и направляли на измельчение.Для получения партии БАД «Моллюскам» использовали каждый вид сырья отдельно.
Измельчение. Мягкие ткани измельчали на аппаратах для измельчения сырья до однородного состояния. Мелкие моллюски в целом виде измельчали на волчке до однородного состояния с диаметром отверстий решетки 1,0 мм.Ферментирование проводили в реакторе из нержавеющей стали, снабженной мешалкой, сливным устройством, паровой рубашкой.
Измельченное сырье загружали в реактор, добавляли питьевую воду (в соотношении сырье:вода -1:2 - 1:4), 20%-ный раствор гидроокиси натрия из расчета 2,1 см на 1000 см смеси и раствор ферментного препарата (пилорин или гепатопанкреатин с активностью 2 Пе на 1 г фарша, либо мегатерии или протамекс активностью 5 Пе на 1 г фарша). Содержимое реактора подогревали до температуры 37±2С. Процесс проводили при данной температуре в течение 4,5-6 ч при периодическом перемешивании.
Для инактивирования ферментного препарата температуру в реакторе с гидролизатом доводили до 80С и выдерживали ее в течение 20 мин.Горячий гидролизат сливали и без задержки подавали на фильтромит-каль, где в процессе фильтрации он постепенно охлаждался, после чего охлажденный гидролизат поступал на сушку. Возможна замена фильтрации центрифугированием при Зэ5 тыс об/мин в течение 20 мин.
Сушка. Для сушки гидролизата возможно использование распылительных, барабанных, вальцовых и сублимационных сушилок при температуре не выше 80С до массовой доли влаги не более 10 %.Измельчение. Готовый сухой продукт измельчали до порошкообразного состояния на мельницах и аппаратах для тонкого измельчения, просеивали, взвешивали и фасовали или направляли для приготовления смеси с наполнителем для изготовления таблеток или капсул.
Оценивали органолептические показатели полученных продуктов. Выраженного горького вкуса в гидролизатах нет, они обладают вкусом морепродуктов, соленым из-за наличия в нем минеральных элементов. Они хорошо растворимы, образуют растворы с очень низкой вязкостью даже при высоких концентрациях, кроме того, они очень хорошо сочетаются с некоторыми продуктами - рыбными, мясными и далее напитками (томатным соком). Высушенные гидролизаты добавляли в чай «Золотой Уссури», состоящий из сухих экстрактов Дальневосточных растений, вкусовые качества опытных образцов незначительно отличались от контрольного, запаха рыбы и морепродуктов не обнаружено. Отмечено, что опытные образцы вызывали в отличие от кон трольного ощущение меньшего количества сахара и слегка изменяли аромат трав, не ухудшая вкусовых качеств.Для создания готовых потребительских форм (порошков, таблеток и капсул), пригодных для хранения, таблетирования или капсулирования необходимо было разработать их рецептуры.
При разработке рецептур порошков, таблеток и капсул, готовых для применения основывались на апробированных ранее составах БАД «Тинростим» и «ДНК» (Патент РФ 2105504; ТУ 9289-011-00038155-02). Соответственно в состав предполагаемой смеси вошли следующие компоненты: «Моллюскам»-субстанция и наполнители - глюкоза, МКЦ, аскорбиновая кислота.
Оптимальной явилась следующая рецептура (табл. 17), так как готовая БАД обладала приемлемыми органолептическими качествами и могла быть использована для таблетирования и капсулирования.
Изменение в показателях полученных форм прослеживали в течение времени для установления сроков хранения. В процессе хранения в течение 10 — 15 дней в условиях окружающей среды порошки со смесью и таблетки подвергались изменению, наблюдалось потемнение и увеличение влажности по
Оценка антиоксидантной активности БАД «Моллюскам»
После разработки технологии БАД «Моллюскам» и определения химического состава было установлено, что в ее составе преобладают свободные аминокислоты - до 50-70 % от сухой массы. Поэтому первоначальные эксперименты по оценке медико-биологической активности этого препарата были направлены по пути возмещения недостатка свободных аминокислот, а также включения их в метаболизм отдельных тканей и органов. Так, значительное количество таурина в БАД «Моллюскам» послужило основанием для применения его в офтальмологии (в следующей главе приведены результаты медицинских исследований).
Вместе с тем, проводимые в клиниках биохимические анализы, в частности анализы сыворотки крови пациентов, явно указывали на наличие у испытуемого препарата антиоксидантной активности.
Хотя, как показано в литературном обзоре, свободные аминокислоты являются достаточно слабыми антиоксидантами в отдельности, но можно предположить, что комплекс аминокислот и дипептидов, включающих таурин и гистидинсодержащие дипептиды, способны дополнить и усиливать друг друга, составляя комплекс антиокислителей. Для того, чтобы проверить высказанные предположения были проведены эксперименты по оценке антиоксидантной активности препаратов, обогащенных свободными аминокислотами, различными методами.Как было установлено ранее (Формазюк и др., 1992; Болдырев и др., 1993), ряд аминокислот (таурин, гистидин, валин, аланин) и гистидиысодер-жащих дипептидов способны эффективно взаимодействовать с гипохлорит анионом (СЮ"). Уже через 1 мин после смешивания растворов карнозина и гипохлорита натрия регистрируется появление пика с максимумом поглощения при 255-265 нм, что свидетельствует об образовании хлораминового комплекса. При этом поглощение реакционной смеси в области характерной для гипохлорита натрия полностью исчезает. Через час после начала реакции характер спектров существенно не меняется, за исключением некоторого снижения максимума вновь образованного соединения, что указывает на существенную стабильность образуемого комплекса. Кинетика взаимодействия хлораминовых комплексов, образованных карнозином и таурином практически одинакова. Для свободных [3-аланина и L-гастидина была обнаружена аналогичная кинетика разложения гипохлорита с некоторыми различиями в концентрационной зависимости. Однако эти комплексы были менее стабильны (Формазюк и др., 1992).
Согласно формуле, которую предложили Формазюк и Болдырев (Пат. РФ. 1807353), определять относительную антиоксидантную активность возможно следующим образом:А0 - поглощение 2,5 мМ раствора гипохлорита при 292 нмА+ - поглощение смеси гипохлорита и антиоксиданта.
В предлагаемом способе использовали карнозин и таурин, антиоксидантная активность первого составила 0,69+0,03, второго 0,79+0,02.Поскольку гипохлорит-антиоксидантный комплекс образуется при взаимодействии с рядом аминокислот и позволяет оценить убыль гипохлорит-аниона, мы провели ряд экспериментов по взаимодействию гипохлорит-аниона с БАД «Моллюскам».
Первоначально, для того, чтобы иметь модельную картину подобного взаимодействия, провели эксперименты в присутствии чистого таурина. На рисунке 18 показана зависимость спектров поглощения таурина, гипохлорита натрия и гипохлорит-тауринового комплекса при различных длинах волн.Нами зафиксирован максимум поглощения гипохлорита натрия при Я, = 255 нм и сдвиг и снижение пика после взаимодействия с таурином.
Дальнейшие исследования позволили оценить изменение оптической плотности гипохлорит-тауринового комплекса через 15, 30, 60 и 180 мин. Весь свободный гипохлорит в концентрации 5 мМ связывался 1 мМ раствором тау бешка, в) моллюскам из мидии, в) гипохлорит, г) моллюскам из мантии гребешка + гипохлорит, д) моллюскам из мидии + гипохлорит. А - оптическая плотность образцов.
Подобным же образом исследовали нейтрализацию гипохлорит-аниона в присутствии «Моллюскама», полученного из мидии и мантии гребешка. Спектры поглощения реагентов и их комплекса показаны показаны на рисунке 19. Они в целом аналогичны полученным для таурина.
Для стабильности гипохлорит - «Моллюскамового» комплекса характерна та же динамика: полное связывание в течение 180 мин. При этом концентрация «Моллюскама» составляла 0,2 мг/мл, (табл. 24).
Расчет абсолютных антиоксидантных активностей по приведенной ранее формуле позволил получить данные представленные в таблице 24.
Таким образом, проведенные исследования позволяют утверждать, что БАД «Моллюскам» проявляет антиоксидантную активность при взаимодействии с гипохлорит-анионом. Согласно современным взглядам на патогенез ряда заболеваний, для которых характерно воспаление и деструкция собственных тканей в очаге поражения, в качестве основного поражающего агента может выступать гипохлорит-анион. В частности присутствующий в хрусталике и сетчатке глаза фермент - миелопероксидаза (КФ 1.11.1.7.) при осуществлении своих функций образует гипогалиты. Последние с одной стороны являются метаболитами в естественных процессах, с другой стороны способны повреждать ткани и органы. Возможно, что функция таурина, присутствующего в значительных количествах в сетчатке и других отделах глаза, включают нейтрализацию гипохлорит-аниона, чем объясняется антикатаральный и антиглаукомный эффект таурина, карнозина и БАД «Моллюскам».
Похожие диссертации на Биотехнология биологически активной добавки к пище "моллюскам"
