Введение к работе
Актуальность проблемы. Исследование химических компонентов, входящих в состав морских животных, в течение последних лет остается на пике интересов биохимиков, фармакологов и исследователей смежных специальностей. Обнаружение компонентов с новыми качественными характеристиками, изучение их структуры и биологической активности позволяет выявить новые виды природных соединений, оценить их физиологическую активность (Еляков и др., 1992; Еляков, Стоник, 2003; Пивненко, 2006; Суховеева, Подкорытова, 2006; Стоник, Толстиков, 2008). Гидробионты, особенно беспозвоночные животные, отличаются от наземных организмов значительным разнообразием вторичных метаболитов, среди которых доминирующая часть представлена функциональными соединениями. К соединениям такого типа относятся каротиноиды, которые проявляют широкий спектр биологической активности (Cantrell et al., 2003; Chew, Park, 2004; Konishi et al., 2006; Santocono et al., 2007; McNulty et al., 2008). Анализ литературных источников показывает, что каротиноиды морских организмов изучены недостаточно. В настоящее время исследования каротиноидов ведутся по нескольким направлениям. Прежде всего, это исследования состава и метаболизма, а также антиоксидантных свойств (Young et al., 2004; Stahl, Sies, 2005; Wolf et al., 2009), в основе которых лежат окислительно-восстановительные характеристики этих веществ с их уникальной системой сопряженных связей (Carotenoids 1А, IB, 1995). На примере астаксан-тина морских животных показано, что его активность в десять раз превышает аналогичные свойства Р-каротина (Miki, 1991). Также проводятся исследования иммуномодулирующей, противоопухолевой активностей, способности модулировать экспрессию генов, обеспечивая защиту от воспалительных повреждений и неопластических трансформаций (Nishino et al., 1992; Hix et al., 2004; Hughes, 2004; Ishikawa et al., 2008).
В настоящее время в нашей стране происходят существенные изменения в структуре промысла, наблюдается расширение списка объектов за счет видов ранее считавшихся не пригодными для пищевого использования. К ним относятся многие виды моллюсков, иглокожих, ракообразных. В странах АТР ассортимент привлекаемых к пищевому использованию гидробионтов значительно шире, он включает также асцидий — животных, принадлежащих к типу хордовых (Chordata), подтипу оболочников (Tunicate!). Наибольшее количество их видов принадлежит к классу асцидий (Ascidiacea), химический состав которых характеризуется наличием специфических компонентов из разряда пептидов (Lee et al., 2001; Jang et al., 2002), каротиноидов (Ookubo, Matsuno, 1985; Choi et al., 1994a; Белорукова и др., 2006), алкалоидов (Еляков, Стоник, 2003; Agrawal et al., 2004; Issa et al., 2004), углеводов (Anno et al., 1974; Lee et al., 1998a; Усов и др., 2002).
4 В дальневосточных и арктических морях России широко распространена асцидия На-
locynthia aurantium, содержащая в своих тканях каротиноиды в высоких концентрациях. Она обитает преимущественно на глубине от 1 до 65 м, и ее запасы позволяют производить промышленный вылов. Ранее предпринимались попытки обоснования пищевого использования этого вида асцидий, не получившие дальнейшего развития (Савватеева, 1990), поэтому биотехнологический и биогенный потенциал данного вида сырья не имеет объективной оценки.
Известны работы по использованию туники Н. aurantium для получения БАД «Хау-рантин», обладающей стресс-протекторной активностью (Кушнерова и др., 2000; Добряков, 2004). Однако предлагаемая технология обеспечивает выход каротиноидов, не превышающий 1 % их суммарного количества в исходном сырье.
Таким образом, широкий спектр биологической активности каротиноидов морских организмов свидетельствует о целесообразности их выделения и использования в лечебных и профилактических целях. Обоснование использования асцидий пурпурной в качестве источника каротиноидов позволит не только расширить сырьевую базу биопрепаратов, но и выявить особенности их состава и биологической активности, предложить новые рациональные технологии переработки.
Цель работы — исследование распределения и свойств биологически активных компонентов асцидий пурпурной как перспективного промыслового объекта, разработка эффективных технологий концентратов каротиноидов и определение их биологической активности.
Задачи исследования:
исследовать технохимический состав тканей и органов асцидий пурпурной как основу для рекомендаций по ее переработке для производства БАД и пищевых продуктов;
исследовать состав биологически активных компонентов в тканях асцидий для обоснования направлений их применения;
исследовать качественный и количественный состав каротиноидов в тканях асцидий;
определить структуру преобладающих каротиноидов, входящих в состав сырья и препаратов;
определить рациональные параметры процесса экстракции и концентрирования каротиноидов;
обосновать и разработать технологию масляных экстрактов каротиноидов в качестве БАД к пище;
провести оценку безопасности и биологической активности БАД к пище, исследовать антиоксидантные и мембранотропные свойства препаратов;
Научная новизна. На основе новых инструментальных методов пересмотрены данные по составу биологически активных соединений в различных органах и тканях асцидии пурпурной Н. aurantium, дана сравнительная характеристика качественного и количественного содержания азотистых соединений (свободных аминокислот, дипептидов, аминосаха-ров). Впервые проведен анализ компонентного состава каротиноидов тканей и органов асцидии и показано наличие 8 индивидуальных соединений в тунике методом ВЭЖХ. Выявлено значительное преобладание кислородсодержащих форм (ксантофиллов).
Значения молекулярных масс (с точностью до третьего знака), полученные масс-спектрометрией высокого разрешения, и характеры электронных спектров поглощения использованы для идентификации каротиноидов и построения структурных формул 5 преобладающих компонентов.
На основе сравнительного анализа способности каротиноидов асцидии к экстракции и реэкстракции в различных системах растворителей впервые разработан способ получения масляных концентратов, показано влияние органических кислот на процесс разрушения ка-ротинопротеиновых комплексов асцидии. Показана зависимость процесса реэкстракции от липидного состава растительных масел и жиров морских организмов.
Разработана и научно обоснована технология БАД к пище «Экстракт асцидии масляный» из туники Н. aurantium. Показателем подлинности сырья и продуктов на его основе может служить количественное содержание каротиноида галоцинтиаксантина.
Впервые исследовано влияние каротиноидов Н. aurantium на текучесть мембран в модельных экспериментах. Показано, что каротиноиды из туники асцидии обеспечивают увеличение структурной стабильности, уменьшение текучести и повышение термостабильности мембраны в жидкокристаллическом состоянии. Установлены антиоксидантная и иммуно-тропная активности БАД к пище «Экстракт асцидии масляный».
Практическая значимость состоит в обосновании способов утилизации ранее не используемого вида морских организмов; разработке рекомендаций по комплексной безотходной переработке асцидии пурпурной, включающей создание БАД направленного типа действия; разработке технологии концентрированных масляных экстрактов каротиноидов.
Разработана и утверждена нормативная документация на «Асцидию пурпурную — сырец» ТУ 9253-308-00472012-06, «Асцидию пурпурную мороженую» ТУ 9265-311-00472012-06, БАД к пище «Экстракт асцидии масляный» ТУ 9283-315-00472012-07.
По результатам экспертной оценки и санитарно-гигиенических исследований в Федеральном центре Госсанэпиднадзора РФ «Экстракт асцидии масляный» соответствует требованиям СанПиН и зарегистрирован как БАД к пище (санитарно-эпидемиологическое заключение № 77.99.13.003.Т.002367 от 31.10.2007).
Реализация результатов исследования. В настоящее время промышленный выпуск БАД к пище «Экстракт асцидии масляный» (субстанция) осуществляется на экспериментальном участке ФГУП «ТИНРО-Центр», конечная форма производится в ООО «Биополимеры». Установлена экономическая эффективность производства БАД.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на «XII Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилита-ции» (Таиланд, 2007); на конференции «Современное состояние водных биоресурсов», посвященной 70-летию СМ. Коновалова (Владивосток, 2008); на 9-й Тихоокеанской международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины» (Владивосток, 2008); на научной конференции «Иммуномодуляторы природного происхождения» (Владивосток, 2009).
Основные положения, выносимые на защиту
^ По совокупным признакам (распространению, химическому составу и составу БАВ) асцидия пурпурная Halocynthia aurantium является наиболее перспективным видом асцидии Дальневосточного региона России для использования в пищевой промышленности.
^ Исследование каротиноидов асцидии Н. aurantium методами ВЭЖХ и масс-спектрометрии позволяет выделить и идентифицировать преобладающие компоненты. В качестве показателя подлинности сырья и продуктов на его основе может быть использован гал оцинтиаксантин.
> Технология масляного экстракта асцидии Н. aurantium позволяет получать кислородсодержащие каротиноиды (ксантофиллы) в виде концентрированных препаратов, обладающих широким спектром биологической активности.
Публикации. По результатам диссертационной работы опубликовано 6 печатных работ, в том числе 4 - в изданиях, рекомендованных ВАК и один патент на изобретение
Структура и объем диссертации. Диссертация включает введение, обзор литературы, описания материалов и методов исследования, экспериментальную часть, выводы, список цитируемой литературы, содержащий 215 источников, в том числе 140 зарубежных. Работа изложена на 141 странице, содержит 31 таблицу, 30 рисунков и 8 приложений.
Благодарности. Я искренне благодарна своему научному руководителю Т.Н. Пив-ненко за помощь и наставления при написании диссертации, а также выражаю признательность П.А. Задорожному, В.Г. Рыбину, Н.М. Саниной за помощь в работе и полезные советы, Н.М. Купиной за ценные замечания по улучшению структуры работы.
