Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы
1.1. Индукция синтеза белков и нуклеиновых кислот тиреоид-ными гормонами 9
1.2. Ядерные сайты связывания тиреоидных гормонов 15
1.3. Связывание тиреоидных гормонов в цитоплазме 23
1.4. Современная модель внутриядерной функции тиреоидных гормонов 31
Экспериментальная часть
2.1. Материалы 41
2.2. Методы исследований 41
2.2.1. Получение препарата ядер 41
2.2.2. Получение цитоплазматического рецептора тироксина 42
2.2.3. Получение рецептора тироксина из микросомальной фракции печени крыс 43
2.2.4. Получение ядерных 30-40 S РНП-частиц и иммунологическая идентификация в их составе тироксин связывающего белка 43
2.2.5. Выделение ДНК 44
2.2.6. Выделение РНК из препарата рецептора 46
2.2.7. Электрофорез РНК 46
2.2.8. Взаимодействие гормон-рецепторного комплекса тироксина с ядрами 47
2.2.9. Взаимодействие гормон-рецепторного комплекса с ДНК 48
2.2.10. Определение общей РНК-полимеразной активности изолированных ядер 48
2.2.11. Изучение ядерно-цитоплазматического транспорта -РБК 49
3. Результаты исследований и обсуждение
3.1. Изучение взаимодействия цитоплазматического гормон-рецепторного комплекса с изолированными ядрами клеток печени 51
3.2. Характеристика нуклеинового компонента цитоплазматического рецептора тироксина 67
3.3. Исследование влияния гормон-рецепторных комплексов из нормальных и опухолевых тканей на РИК-полимеразную активность изолированных ядер печени крыс 74
3.4. Исследование взаимодействия гормон-рецепторного ком-лекса с ДНК 78
3.5. Исследование ядерно-цитоплазматического транспорта -РНК 85
4. Заключение 93
5. Выводы 102
6. Список литературы 103
- Индукция синтеза белков и нуклеиновых кислот тиреоид-ными гормонами
- Получение цитоплазматического рецептора тироксина
- Изучение взаимодействия цитоплазматического гормон-рецепторного комплекса с изолированными ядрами клеток печени
- Исследование взаимодействия гормон-рецепторного ком-лекса с ДНК
Введение к работе
Выяснение механизмов регуляции генетическом активности ти-реоидными гормонами является одной из важнейших проблем молекулярной эндокринологии.
В настоящее время не вызывает сомнения факт, что эффект гормонального воздействия опосредован взаимодействием гормонов щитовидной железы со специфическими рецепторными белками. Несмотря на то, что специфическое связывание Тд и Тд было обнаружено и в ядре (Ор-penheimer J., 1979; Baxter J.D. , 1979) и в ЦИТОЗОЛЄ (Spanld-ing et-al. , 1971; Defer et al. , 1975; Csaba et al. , 1977) гормон-чувствительных клеток, большинство исследователей считают, что ядерные хроматиновые сайты связывания являются первичными рецепторами тиреоидных гормонов. Цитоплазматическим же белкам отводится вторичная роль и до сих пор оспаривается их функция в опосредовании генотропного эффекта гормонов. Основанием для такого заключения служило большее сродство цитоплазматических рецепторов к Т4 , чем к Тд , способность тиреоидных гормонов акцептироваться хроматином при непосредственной инкубации с ним в отсутствие цитоплазмы, одинаковое количество ядерных тиронинсвязывающих сайтов в ядрах печени тиреоидэктомированных и нормальных крыс ( Oppenhei-mer et al. , 1974; Surks et al. , 1975; Defer N. et al. , 1975) и неспособность цитоплазматических ТСБ связываться с ДНК ( Mac Le-od et al. , 1976). Вместе с тем, ряд других экспериментов свидетельствует о том, что аккумуляция тироксина ядрами зависит от температуры, от концентрации гормона и увеличивается при инкубации с гормоном интактных клеток ( Samuels, Tsai , 1973; Kistler et al., 1975). В опытах Tata J.R., Widnell С.С. (1966), Cohen P.P. (1970), Griswold M.D., Cohen p.p. (1972) было показано, что свободный
тироксин в отсутствии цитоплазмы инертен в регуляции матричной активности хроматина и РНК-полимеразной реакции в изолированных ядрах, что свидетельствует об участии цитоплазмы или ее компонентов в эффекте тироксина на генетически!'! аппарат клетки.
В 1976 году Лбдукаршовым А. и др. была высказана гипотеза о генетической функции цитоплазматического рецептора, согласно которой специфический рецепторний белок, являющийся продуктом гена-регулятора, взаимодействует с гормоном и приобретает способность узнавать специфические акцепторные сайты ДНК, входящие в состав ре-гуляторной части оперона.
В экспериментах по изучению матричной активности хроматина и РНК-полимеразной активности изолированных ядер было показано, что цитоплазматическин гормон-рецепторный комплекс является посредником генетического действия тиреоидных гормонов (Адылова А.Т., 1978). Это подтверждает и транслокация очищенного %-цитоплазматического рецептора в ядра и обнаружение его в составе метафазных хромосом эукариотов (Абдукаримов А., 1978 б).
Однако, механизм проникновения ГРК в ядро не известен, поэтому одной из наших целей было выяснение условий транслокации ГРК из цитоплазмы в ядро. Обработка цитоплазматического ІРК смесью РНК-аз А и Tj , показала, что необходимым условием его взаимодействия с ядрами является диссоциация РНКового компонента, ассоциированного с молекулой рецептора.
Современная модель механизма действия тиреоидных гормонов предполагает, что определяющим эффектом взаимодействия ГРК с генетическим аппаратом клетки является стимуляция транскрипции специфических мРНК ( Baxter et ai. , 1979), и менно в результате этого обеспечивается избирательная регуляция функционирования генома.
Однако, известно, что избирательное выражение генетической информации обеспечивается не только на уровне последовательной
транскрипции индивидуальных пре-мРНК, но и на этапе их процессин-га и сплайсинга, а также избирательностью ядерно-цитоплазматичес-кого транспорта РШС и трансляции специфических белковых молекул на матрице РЖ.
Логично, поэтому предположить, что тиреоидине гормоны, контролирующие огромное количество функций и метаболических реакцій организма, имеют Енутри ядра множественные функциональные сайты связывания, взаимодействие с которыми позволяет игл координировать работу ядерного генетического аппарата. Б подтверждение этого предположения сайты связывания тиреоидных гормонов были обнаружены в составе хроматина ( Oppenheimer et al., 1972 ), ядерных PEII-частиц ( Defer b.d. et al. , 1977) и в белках ядерного матрикса
(Wilson B.D. et al., 1982).
Исходя из этого, а также показанного ранее (Азимова и др., 1982) структурного отличия цитоплазматического рецептора тироксина опухолевых тканей от рецептора нормальных тканей мы провели сравнительное изучение их участия в регуляции ассоциированной с хроматином РНК-полимеразной активности, а также в процессе ядерно-цито-плазматического транспорта вновь синтезированной РНК.
Наши данные показывают, что Т4-рецепторный комплекс включается в регуляцию как на транскрипционном уровне, так и на посттранскрипционном, однако степень участия нормального и трансформированного ГРК в стимуляции этих двух процессов различна: ГРК из нормаль-ных тканей эффективен как в регуляции РНК-полимеразной активности изолированных ядер, так и в ядерно-цитоплазматическом транспорте %-РНК, а ГРК опухолевых тканей не влияет на РНК-полимеразную активность, но более цитоплазматического нормального ГРК эффективен в транспорте %-РНК в цитоплазму. Кроме этого ГРК опухолевой ткани в отличие от нормального ГРК не способен взаимодействовать . с
ДНК.
Таким образом, наши данные в совокупности с данными литературы свидетельствуют, что цитоплазматический рецептор Ти способен транслоцироваться в ядра клеток и опосредовать как ассоциированные с хроматином, так и посттранскрипционные генетические процессы.
Индукция синтеза белков и нуклеиновых кислот тиреоид-ными гормонами
Гормоны щитовидной железы обладают самым широким спектром действия. Под контролем трийодтиронина и тироксина находится ряд важнейших биохимических реакцій белкового, углеводного, липидного и водно-солевого обмена, процессы дыхания, роста и дифференцировки клеток и всего организма в целом.
Но несмотря на столь большое значение тиреоидных гормонов в жизнедеятельности организма, молекулярные механизмы их действия остаются до сих пор неизвестными.
Многочисленными исследованиями было доказано, что в различных субклеточных структурах тиреоидные гормоны связываются со специфическими белками-рецепторами. Так, наличие специфических сайтов связывания тироксина и трийодтиронина с высоким сродствогя и низкой емкостью было показано в матриксе и внутренних мембранах митохондрий (Туракулов и др., 1974; sterling et al. , 1975, 1978), на плазматической мембране ( Rao et al. , 1976; Pliarn , Goldfine , 1977; Gharbi-Chini , 1981; Little , 1984), в растворимой фракции ( Toccafondi, Sufi , 1973; Samuels Tsai , 1973; Oppen heimer et al., 1974 a; Davis et al. , 1974; Defer N. et al. , 1975; Goldfine et al. , 1976), в хроматине ( Grisv/old,Cohen , 1972; Oppenheimer et al. , 1972; De Groot L. et al. , 1974;
Baxter J. et al., 1975), ядерном матриксе ( Wilson B.D. et al. , 1982), ядерных РНП-частицах ( Defer n.efc al, 1977), лшіосомах ( Gharbi-Chini et al., 1979).
О ключевой роли взаимодействия гормона с молекулой специфического рецептора в механизме реализации гормонального воздействия в клетке свидетельствует зависимость степени ответа клеток на гормон от концентрации гормон-связывающих сайтов в ядре ( Samuels et ai., 1979), нечувствительность к тиреоидным гормонам больных с пониженной концентрацией гормон-связывающих сайтов ( Bemal et al. ,1978), нечувствительность к тиреоидным гормонам клеток Drosophila при совершенном отсутствии в них рецепторних молекул для Тз и Т (Charles et al. , 1975).
Таким образом, наличие специюических рецепторов в различных компартментах клетки хорошо согласуется с гипотезой Hoch , высказанной в 1962 году о множественности направлений в механизме действия тиреоидных гормонов. Однако, в настоящее время наиболее изученным является генотропный эффект тиреоидных гормонов.
После ОПЫТОВ Tata ( Tata J.R., Widnell С.С. , 1963, 1966), показавших, что наиболее ранние эффекты трийодтиронина связаны с синтезом новой ядерной РЖ и увеличением активности ДБК-зависимой РНК-полимеразы, внимание исследователей сконцентрировалось на клеточном ядре, как месте первичного действия тиреоидных гормонов.
Исследование вновь синтезированной РНК методом гибридизации позволило Тата установить, что под действием тироксина увеличивается синтез рибосомальной РБК , что согласуется с показанным ранее увеличением активности РНК-полимеразы I изолированных ядер ( v/yatt, Tata j.R. , 1968). Далее было показано, что трийодтиронин увеличивает не только специфическую активность фермента, участвующего в синтезе рибосостальной РНК, но и его количество ( Smucler, Tata J.Е., 1971; De Groot et al., 1980).
Griswold, Cohen (1972, 1973), Flicinger et al. (1972) также отмечали преимущественное увеличение под действием тироксина РНК-полимеразы I и соответственно - индукцию синтеза рибосомальной РНК.
По данным Jothy et al. (1975) при введении трийодтиронина тиреоидэктомированным "крысам активность РБК-полимеразы I остается неизменной в течение 3 часов, но уже через 40 минут резко возрастает (на 200-300%) активность РНК-полимеразы II, ответственной за транскрипцию пре-м-РНК.
Повышение активности обеих форм РНК-полимераз было показано De Groot L. et ai. (1980) через 8-Ю часов после инъекции трийод-тиронина гипотиреоидншл крысам. Кроме того, в этом же интервале времени наблюдалось увеличение количества поли-А-содержащей РБК, причем РЖ, синтезированная изолированными ядрами крыс в среде с Т3, качественно была подобна таковой у гипотиреоидных крыс, получавших Т3. ( De Groot L. et al., 1980).
Суммируя приведенные данные можно заключить, что наиболее ранний метаболический ответ на введение Т3 - генерализованная индукция синтеза как мРБК, так и рибосомальной РНК.
Следует отметить, что в условиях in vivo эффект тиреоидных гормонов на индукцию синтеза нуклеиновых кислот сложным образом связан с общим гормональным статусом организма. Так, введение гипотиреоидншл крысам соматотропного гормона изменяет концентрацию восьми фракции мРНК, причем уровень 4-х мРНК снижается, а уровень других 4-х мРНК повышается ( Liaw Chen et al., 1983). Для двух мРНК показана необходимость одновременного введения трийодтиронина и соматотропного гормона для восстановления их нормальной концентрации. С другой стороны, содержание крыс на обезжиренной диете с высоким содержанием углеводов изменяет уровень 10 мРНК. Во всех случаях, кроме одного, эти мРНК зависят от тиреоидного статуса животных ( Liaw Сben et al., 983)
Выражением стттуляции синтеза РНК является синтез специфических белков на матрице этой мРНК. С этой точки зрения важно отметить Елияние тиреоидных гормонов на уровень синтеза гормона роста в культивируемых клетках гипофиза . Martial et al. (1977) обнаружили стимуляцию тиреоидными гормонами синтеза гормона роста в 2,5 раза, причем повышению уровня содержания гормона роста предшествовало соответственное увеличение уровня специфической мРНК.
Весьма интересны также данные Barbanel и Assenmacber о неопосредованном уровнем эстрогенов в крови влиянии гормонов щитовидной делеЗЫ На СИНТев ЭСТрОГенсвяЗЫВающиХ беЛКОВ ( Barbanel G., Assenmacher J., 1982).
Тиреоидине гормоны контролируют также и синтез рецепторов глго-кокортикоидов в легких новорожденных крысят: подавление функции щитовидной железы у них путем пре- или постнатальном обработки про-пилтиоурацилом предотвращало увеличение содержания глюкокортикоид-ных рецепторов в легких, характерное для нормальных животных. Введение таким крысятам I мкг Тд приводило к увеличению количества рецепторов глюкокортикоидных гормонов в легких в течение 48 часов после ИНъеКЦИИ ( Morishige Walter К., 1982).
Эти данные в совокупности с данными Martial et ai.(I977), Samuels et al. (1973), Dobner et al. (1981) О том, что тиреоид-ные гормоны контролируют степень влияния глюкокортикоидов на уровень мРНК гормона роста не только дают представление об участии ти-реоидных гормонов в регуляции транскрипционных процессов, но и способствуют пониманию молекулярных механизмов взаимодействия гормонов и взаимозависимости их эффектов в целом организме.
Получение цитоплазматического рецептора тироксина
Ядра из печени крыс получали ПО Методу V/idnel CO., Tata Y. (1966), ГОМОГеНИЗИруЯ ПерФузи рованную холодньм 0,14 М NaCi печень в растворе 0,25 М сахарозы, приготовленной на 0,02 М трис-нсі буфере рН 7,4, содержащем 3 мМ MgCi2 , 15 мМ КС1 , 10 мМ б -меркаптоэтанола. Гомогенат фильтровали через капрон, центрифугировали 10 минут при 2000 об/мин на ЦЛТ. Осадок ядер суспендировали в растворе 2,2 М сахарозы, приготовленной на том же буфере, что и 0,25 М сахароза и наслаивали на равный объем 2,2 М сахарозы. Центрифугировали 90 мин при 24000 об/мин в роторе SV." 25 центрифуги Backman или К-32. Осадок ядер дважды промывали раствором 0,25 М сахарозы и суспендировали в необходимом буфере в зависимости от целей использования. "Чистоту препарата ядер проверяли светооптически при окраске гема-т ок силином-эо3ином.
Получение цитоплазматического рецептора тироксина. Ци-топлазматический рецептор тироксина получали из 105000 xg суперна-танта печени нормальных крыс и из цитозоля перевиваемой саркомы Ж крыс в зависимости от целей использования двумя описанными ранее методами: методом фракционирования на ДЕАЕ-целлюлозе (Абдукаримов и др., 1977) и методом, основанным на специфическом взашлодействии рецептора с иммобилизованным на акрилексе Р-60 тироксином (Гулямо-ва, IS80) с последующим препаративным электрофорезом и гельфильт-рацией на сефадексе Г-100. Во всех случаях аликвоты фракции рецептора проверялись на тироксинсвязывающую способность с меченым гормоном с использованием колонки сефадекса Г-25, уравновешенной 0,05 М трис- неї буфером рН 7,4 для разделения связанного с рецептором и свободного гормона.
- При получении рецептора тироксина, меченого по С-аминокис-лотам, крысам в течение 4-х дней дважды в день внутрибрюшинно вводили смесь 14С-аминокислот по 20 мкКи на каждую инъекцию. В день забоя делали две инъекции с интервалом 3 часа. Забой производили через 1,5 часа после последней инъекции. Такой способ введения метки позволяет получить рецептор с наибольшей удельной радиоактивностью (46000 импульсов в минуту на мг белка). После забоя печень перфузировали, гомогенизировали и из цитозоля получали рецептор описанным ранее методом (Абдукаримов и др., 1977)
Для получения рецептора, меченого по нуклеиновому компоненту, крысам за 45 минут до забоя внутрибрюшинно вводили іЗ-оротовую кислоту (30-50 мкКи на крысу).
Для получения рецептора, меченого по углеводному компоненту за 3 часа до забоя крысам вводили внутрибрюшинно смесь 4С-углево-дов (Д-галактоза, 200 мкКи, Д-манноза 150 мкКи, Д-глюкозамин 200 мкКи). После перфузии печени in situ цитоплазматическии рецептор получали как описано выше.
Получение рецептора тироксина из микрооомальной фракции печени крыс. Микросомальную фракцию печени крыс получали центрифугированием постмитохондриального супернатанта гомогената печени крыс в 0,25 М растворе сахарозы при 105000 xg в течение часа на центрифуге VAC-601. Осадок микросом суспендировали в небольшом объеме того лее раствора, определяли содержание белка по Лоури ( Lowry о.н. et ai., 1951), разбавляли суспензию микросом растзором сахарозы до кошдентрации белка 25 мг/мл, а затем по каплет,! добавляли 10/ь раствор дезоксихолата натрия, рН 8,0 до достижения соотношения I мг дезоксихолата на 10 мг белка микросом ( мае Lennan D.H. , 1970). Смесь перемешивали в течение 15 минут при 20С. Осадок центрифугировали при 105000 xg І час. Супернатант диализ овали против дистиллированной воды при многократной смене диализата. После диализа дезоксихолатный экстракт микросомальной фракции центрифугировали 105000 xg І час и из супернатанта получали рецептор тироксина.
Получение ядерных 30-4QS РНП-частвд и иммунологическая идентификация в их составе тироксинсвязывающего белка. Для получения ядерных 30-40S РШ-частиц животным за 35-45 минут до забоя внутрибрюшинно вводили 3Н-оротовую кислоту (300-400 мкМк на крысу). Выделяли ядра описанным выше способом и экстрагировали их 10 объемами среды следующего состава: 10 мМ трис неї рН 7,0, 0,14 U ЫаС1 , 0,001 М ivigcig. После центрифугирования супернатант отбрасывали, а из ядерного осадка последовательно (3-4 раза) экстрагировали РШ-частицы тем же буфером, но при рН 8,0. Экстракты объединяли и наносили на градиент концентрации сахарозы 15-30 . Ультрацентрифугирование проводили в течение 4 часов при 38000 об/мин в роторе GV;- :-1 при 3С. Фракции, седиментируїощие в области 30-40 s , диализ овали против 0,14 М KaCi , концентрировали и тестировали на специфичность преципитации в реакции Оухтерлони с антителами к цитоплазматическому рецептору тироксина.
Моноспецифическая антисыворотка против цитоплазматического рецептора тироксина была получена Петровой О.С. при иммунизации кроликов цитоплазматическим рецептором печени крыс по модифицированной схеме Зубжицкого (Зубжицкий О.Н., I960). Моноспецифические антитела к рецептору тироксина вьщеляли аффинным методом на BrCN сефарозе 4В (иммобилизацию антигена и элюцию антител проводили согласно инструкции фирмы изготовителя (Fins Chemical, Sweden).
Выделение ДНК. ДНК из ядер печени крыс получали методом Кирби в модификации Георгиева (Георгиев Г.П., 1968). Печень перфузировали in situ холодным 0,14 М NaCi , измельчали ножницами и гомогенизировали в ножевом гомогенизаторе, а затем в слабо притертом стеклянном гомогенизаторе с тефлоновим пестиком в 10 объемах 0,14 М NaCi - 3 минуты. Гомогенат фильтровали через два слоя марли и добавляли равный объем свежеперегнанного водонасыщен-ного фенола рН 6,0. Смесь энергично встряхивали на холоду 10-15 минут, затем центрифугировали 15 минут при 5500 об/минуту. Верхнюю водную фазу, содержащую цитоплазматическуго РНК, фенольную фракцию с растворимыми в феноле веществами и осадок отбрасывали, а к промежуточному слою (неочищенные фенольные ядра)
Изучение взаимодействия цитоплазматического гормон-рецепторного комплекса с изолированными ядрами клеток печени
В настоящее время наибольшее внимание исследователей привлекает генотропный эффект тиреоидных гормонов, изучение которого позволило бы установить конкретные, механизмы регуляции генетической активности у эукариот.
Несмотря на то, что большинством исследователей отвергается роль цитоплазматических тиронин связывающих белков в механизме действия тиреоидных гормонов на ядро ( Oppenheimer et ai., 1978; Baxter et al. , 1979), Абдукаримовым и др. в 1976 году было высказано предположение, что для реализации генотропного эффекта тироксина, аналогично механизму действия стероидных гормонов, необходим цитоплазматический рецептор.
Цитоплазматический рецептор тироксина печени крыс был выделен в чистом виде и частично охарактеризован (Абдукаримов и др.,1977; іулямова и др., 1979). Его электрофоретическая подвижность соответствует подвижности преальбумина сыворотки крови. Было установлено, что по ряду таких свойств, как конформационный переход белка при взаимодействии с тироксином в молярных отношениях 1:1, з ве-личение- константы седиментации ДНК под действием этого комплекса, увеличение температуры плавления ДНК и хроматина (Абдукаримов и др., 1977), увеличение матричной активности хроматина и РНК-полиме-разной активности изолированных ядер (Адылова А.Т., 1978), конкуренция с ДНК плазмиды pRB 322 (Абдукаримов и др., 1981 б) и ряду других свойств этот белок является истинным рецептором тироксина, так как ни гормон, ни белок раздельно не обладали такими эффектами. В то же время многие аспекты функционирования гормон-рецепторного комплекса в клетке остаются неизученными.
Мы осуществили дальнейшую характеристику гормон-рецепторного комплекса и определили некоторые условия, необходимые для его транслокации в ядро в опытах in vitro.
Исходя из данных Navab et ai. (1977) о наибольшем количественном содержании ТСПА в микросомальной фракции печени и данных Азимовой и др. (1982) об идентичности полипептидных цепей цитоплаз-матического рецептора тироксина и тироксин связывающего преальбуми-на сыворотки крови, перед решением этой задачи предстояло выяснить различие по данной функции (транслокация в ядро) рецепторов из различных компартментов клетки: рецепторов из растворимой и из микросомальной фракции цитоплазмы.
Цитоплазматический рецептор, выделенный из печени крыс, представлен единственной полосой при электрофорезе в 8% ПААГе, а при инкубации его с І-Тд в молярных отношениях 1:1 с последующей гельфильтрацией на сефадексе Г-100 наибольшей тироксин связывающей способностью обладает вторая фракция (рис. 2). Эта фракция тлеет максимум поглощения при 260 нм (рис. 3), окрашивается при электрофорезе амидо-черным, толуидиновым синим и акридиновым оранжевым, что свидетельствует о наличии в составе цитоплазматического рецептора тироксина нуклеинового компонента.
Наличие нуклеинового компонента было подтверждено в опытах по введению крысам in vivo Н-оротовой кислоты (эксперименты проведены совместно с Ддыловой А.Т.). При введении животным за 45 ми-нут до забоя Н-оротовой кислоты радиоактивная метка обнаруживалась в составе электрофоретически гомогенной фракции рецептора, причем при разделении на сефадексе Г-100 второй пик, обладающий наибольшей тироксин связывающей способностью, включал и наибольшее количество радиоактивной метки (рис. 4). Радиоактивность в составе тироксин связывающего пика обнаруживается и при введении in vivo смеси меченых углеводов (Д-галактоза, Д-манноза, Д-глюкозамин), что подтверждает данные о наличии углеводного компонента при окрашивании толуидиновым синим.
В параллельных опытах при получении Т связывающего рецептора из микросомальной фракции печени тех же экспериментальных животных было также обнаружено наличие в его составе радиоактивности по нуклеиновому и углеводному компонентам.
Однако, обработка меченых смесью С-углеводов цитоплазмати-ческого и микросомального рецепторов РНКазой выявила различия в количественном соотношении нуклеинового и углеводного компонентов в их составе. Так, из табл. I видно, что обработка РНКазой цитоп-лазматического рецептора приводит к существенному (в 2 раза) уменьшению радиоактивности, в то время как аналогичная обработка микросомального рецептора и лишь незначительно снижает радиоактивность.
Таким образом, рецептор из растворимой фракции цитоплазмы печени крыс отличается от микросомального рецептора по количественному составу небелковых компонентов, о чем свидетельствует также отношение A2gn : A2QQ В спектрах поглощения цитоплазматического и микросомального рецепторов, равное в случае цитоплазматического рецептора 1,26, а в случае микросомального 1,07.
Из опытов с РНКазной обработкой цитоплазматического рецептора и микросомального тироксин связывающего белка можно предположить различную доступность нуклеинового компонента в них для действия РНКаз, а также то, что в составе микросомального тироксин связывающего белка появляются гликозшшрованные участки, не атакуемые РНКазой.
В связи с обнаруженными различиями в составе тироксин связывающих белков из различных компартментов клетки возникло предположение и об их различном влиянии на процесс транслокации гормона в ядро.
Проведенные в этом направлении исследования подтвердили наше предположение. Как видно из таблицы 2 гормон-рецепторный комплекс, образованный взаимодействием цитоплазматического рецептора с - 1-тироксином в молярных отношениях 1:1, связывается с ядрами клеток печени крыс в 2 раза более эффективно, чем в тех же условиях образованный гормон-рецепторный комплекс из микросом (44,0$ и 18,5$ соответственно). Этот процесс не зависит от температуры, поскольку связывание с ядрами этих комплексов одинаково при 4С и при 37С при данном времени инкубации. Связывание с ядрами свободного 1251-Т4 при 37С было незначительным и достигало максимума (12$) уже через 15-20 минут инкубации при рН 7,6 (рис. 5).
Исследование взаимодействия гормон-рецепторного ком-лекса с ДНК
Применение концепции специфического рецептора к объяснению механизма действия гормонов привело к установлению факта, что именно наличие специфического рецепторного белка определяет в каждом случае возможность ответа на гормон, и любой дефект в звене структурный ген рецептора - рецептор - акцепторные сайты вызывает нарушение нормального метаболизма в клетке. Прішером сказанного может служить известньш в литературе синдром тестикулярної? феминизации, встречающийся у людей, крупного рогатого скота, крыс,мышей (Gehring, Tom-kins , 1974; Ohno , 1971). Феноменом такого лее рода ЯЕЛЯЄТСЯ от-сутствие акцепции меченого ( I ) тироксина хромосомами клеток Heia при сохранении способности тироксин-рецепторного комплекса этих клеток транслоцироваться в ядро, показанное в нашей лаборатории (Абдукаримов А. и др., 1979).
Сравнительное изучение молекулярных свойств нитоплазматических рецепторов тироксина из нормальных и трансформированных тканей показало, что эти белки имеют одинаковы!! молекулярный вес, электро-форетическую подвижность, Т -связывающую способность, одинаково способны транслоцироваться в ядро, но различны по структуре, антигенным детерминантам и ряду функциональных свойств ( Abdukarimov л., 1983). Так, например, была продемонстрирована генетическая функция цитоплазматического рецептора Тд из печени нормальных крыс, заключающаяся в стимуляции матричной активности хроматина и РНК-полиме-разной реакции изолированных ядер. Кроме того, нормальный тироксин-рецепторный комплекс имеет определенные сайты связывания на ДНК плазмиды pBR 322 (Абдукаримов и др., 1981 б), тогда как ГРК из клеток Не la не взаигло действует с ней и не конкурирует с рестрикта-зой Нае III за сайты связывания на ДНК плазмиды.
Однако, для генетического ответа клетки на гормональный стимул необходимо взаимодействие ГРК с ДНК, первичным функциональным выражением которого является изменение РБК-полимеразной активности ( De Groot ее al. , 1980), обеспечивающей избирательную транскрипцию специфических мРНК. Поскольку в случае злокачественной трансформации предполагается итленно нарушение избирательности функционирования генома (Арбузов, 1980), мы провели сравнительное изучение связывания очищенных цитоплазматических гормон-рецепторных комплексов из нормальной (печень крыс) и трансформированных тканей с на-тивной двухцепочечной ДНК печени крыс и их участия в регуляции РНК-полимеразной активности изолированных ядер.
Так как в литературе тлеются указания на преимущественное изменение под действием тироксина in vivo активности как РНК-полимеразы I формы (Tata, widnell , 1966; Griswold, Cohen , 1972, 1973; Viarengo et al. , 1975), так и РНК-полимеразы II ( Jothy et al. , 1975), а в нашей лаборатории ранее была показана стимуляция обеих форм РНК-полимеразы с преимущественной активацией РНК-полимеразы I (Адылова, 1978), то тлы в своих экспериментах определяли общую РНК-полимеразную активность в среде с высокой ионной силой, обеспечивающей максимальную активность РНК-полимеразы II (табл. 5). Как видно из представленных данных, на фоне существенной стимуляции РБК-полимеразной активности под действием гормон-рецепторного комплекса из питозоля печени крыс (в 2,64 раза), гормон-рецепторны!! комплекс из цитоплазмы клеток саркомы Ж лишь на 31,7$ увеличивает включение радиоактивного предшественника в РЖ по отношению к контролю.
Вопрос о состоянии транскрипционной системы в ядрах опухолевых клеток в настоящее время решается в литературе неоднозначно. Большинство исследователей констатируют отсутствие, либо небольшое увеличение синтеза РБК под действием опухолевой цитоплазмы, причем добавление ингибитора РНКаз в случае цитоплазмы из гепатомы показало, что этот эффект цитозоля не связан с наличием в нем РНКаз ( Gribnou et ai. , I970;Kiaude et ai. , 1982). Однако, имеются также и данные о более выраженном стимулирующем эффекте цитоплазмы опухолевых клеток на синтез РНК в ядрах по сравнению с цитоплазмой нормальных клеток ( Thomson et ai. , 1968). Кроме того, показано также, что при инкубации ядер клеток печени в цитоплазме гепатомных клеток синтез РНК в ядрах специфически угнетается, причем образуется более ограниченный набор молекул РНК по сравнению с РНК, синтезируемыми в присутствии гомологичной цитоплазмы (Дворкин Г.Л. и др., 1974). Авторы предполагают, что цитоплазма опухолевых клеток содержит, по-видимому, высокомолекулярный фактор, ответственный за специфическое ограничение синтеза РЖ в ядрах нормальной печени. Вероятно, способность цитоплазмы опухолевых клеток вызывать ограничение транскрипции является существенным свойством опухоли и связана с синтезом в опухоли необычных для нормальной ткани регуляторных белков. По предварительным данным этих авторов фактор тлеет белковую природу и включается в хроматин нормальных клеток печени.
Не исключена возможность, что одним из таких белковых факторов является именно рецептор тироксина из цитоплазмы трансформированных тканей. Только в этом случае наши данные не противоречат литературе .
Следует однако отметить, что в наших опытах стимуляция РНК-полимеразной реакции под влиянием свободного тироксина, взятого в физиологических концентрациях (10" М), свободного рецептора из опухолевой цитоплазмы и опухолевого гормон-рецепторного комплекса практически одинакова (128,0$, 129,0$, 131,0$ соответственно), в то время как стимулирующее действие нормального рецептора (140$) и особенно нормального гормон-рецепторного комплекса (264,0$) намного превышает эффект свободного тироксина (128,0$). Зто обстоятельство свидетельствует, во-первых, о том, что стимуляция синтеза РНК в ответ на введение тироксина не является следствием прямого взашлодействия тироксина с генетическим аппаратом, а опосредована рецепторним белком, молекула которого активируется при взаимодействии с гормоном и приобретает способность узнавать определенные последовательности ДІЖ или другие компоненты хроматина (Абду-каримов А. и др., 1981). Во-вторых, выявленная в модельных экспериментах с ядрами нормальной печени слабо выраженная стимуляция РНК-полимеразной активности гормон-рецепторным комплексом из опухолевой ткани указывает на то, что в злокачественно трансформированных тканях тироксин связывающий белок лишен биологической активности з регуляции генетической экспрессии тиреоидными гормонами, по крайней мере на транскрипционном этапе.
Отметим, что одинаковая степень стимуляции РНК-полимеразной реакции нативным цитоплазматическим гормон-рецепторным комплексом и ГРК, обработанным РІЖазой, очевидно, объясняется саїлопроизвольнои диссоциацией РНКового компонента в случае нативного рецептора под действием высокой ионной силы ( 200 мМ (Ш4)2БО,,) , характерной для инкубационной смеси, использованной нами для определения общей РНК-полимеразной активности изолированных ядер.
