Введение к работе
Актуальность темы
Гемобластозы занимают 5-6 место среди всех онкологических заболеваний и составляют 50% злокачественных новообразований у детей. Классическая химиотерапия гемобластозов включает в себя цитостатические препараты, и ее стандартным компонентом являются глюкокортикоиды (GC). Они являются важными физиологическими и фармакологическими регуляторами роста и жизнедеятельности клеток крови. Высокие дозы GC применяются для снижения количества бластных клеток в острой фазе заболевания при индукции ремиссии. Для успешной консолидации ремиссии в протокол химиотерапии также включают GC. Эти препараты обладают не только системным противовоспалительным действием на организм, но и специфической способностью вызывать гибель лимфоидных клеток.
Биологический эффект GC осуществляется посредством активации глюкокортикоидного рецептора (GR), хорошо изученного транскрипционного фактора. GR регулирует экспрессию генов по двум механизмам – транс-активационному и транс-репрессорному. Терапевтическое действие GC в основном реализуется через ДНК-независимую транс-репрессию – белок-белковое взаимодействие GR с факторами транскрипции (NF-B, AP-1 и пр.). Эти транскрипционные факторы являются эффекторами медиаторов воспаления, антиапоптотических генов и молекул клеточной адгезии. Под действием GC наблюдается снижение активности этих факторов и их эфферентных путей, что ведет к подавлению пролиферации опухолевых клеток. Развитие многих осложнений терапии GC, связано с транс-активацией, опосредованной взаимодействием гомодимера GR с палиндромными респонсивными элементами в промоторах и энхансерах генов, участвующих в регуляции метаболизма. Недавно были описаны селективные агонисты GR (SEGRA). Эти соединения связываются с GR, но активированный ими рецептор реализует свое действие в основном по транс-репрессорному механизму. Несколько соединений, обладающих подобными свойствами, в настоящее время проходят доклинические или клинические испытания в качестве противовоспалительных нестероидных препаратов со сниженными побочными эффектами. К этому типу соединений относится 2-(4-ацетоксифенил)-2-хлор-N-метилэтиламмоний хлорид, или CpdA, более стабильный аналог предшественника азиридина, выделенный из африканского растения Salsola tuberculatiformis Botschantzev. Для проведения данного исследования CpdA был предоставлен проф. И.В.Будуновой, университет Норсвестерн, Чикаго, США.
Применение SEGRA представляется наиболее целесообразным при лечении гемобластозов, однако антипролиферативные и проапоптотические эффекты этих соединений на клетки лейкозов и лимфом не изучены. Таким образом, изучение действия CpdA на клетки лейкозов в сравнении со стандартными GC, используемыми в клинической онкологии, представляет собой приоритетное перспективное исследование, направленное на усовершенствование химиотерапии гемобластозов.
В настоящее время при лечении онкологических заболеваний обычно применяется комбинированная химиотерапия, при которой одновременное использование двух и более препаратов позволяет снизить их дозы, и добиться их синергического или аддитивного эффектов. В частности, было продемонстрировано потенцирующее действие GC при лечении гемобластозов Винкристином, Адриамицином, Морфоланом и другими препаратами. Одним из самых перспективных современных противоопухолевых препаратов для химиотерапии гемобластозов является Бортезомиб (BZ), который начали использовать в США и Европе в 2003–2004 гг. Этот препарат активно применяется при терапии множественных миелом и лимфом, а также было продемонстрировано его успешное использование при лечении лейкозов. BZ относится к классу ингибиторов протеасом: он связывается с каталитическим доменом 26S протеасомы, предотвращая расщепление определенных клеточных белков, и, в частности, GR. Было установлено, что ингибиторы протеасом индуцируют апоптоз в опухолевых клетках, не влияя на нормальную ткань. При этом наблюдается подавление активности NF-kB, стресс эндоплазматического ретикулума и связанные с ним реакции. При сочетанном применении глюкокортикоидов и BZ был показан синергизм антипролиферативных и проапоптотических эффектов на клетках множественной миеломы, лимфом и лейкозов. Поскольку мы полагали, что СpdA активирует транс-репрессию, в частности снижает активность NF-kB, то была выдвинута гипотеза, что Бортезомиб может оказывать потенциирующее действие на эффекты данного селективного агониста GR. Это объясняет наш интерес к изучению совместного действия CpdA, модулятора GR, и BZ.
Таким образом, настоящая работа, посвященная исследованию эффектов нового нестероидного лиганда GR, CpdA, на клеточные линии гемобластозов, сравнению их с эффектами GC, а также оценке совместного действия CpdA и ингибитора протеасом Бортезомиба, представляет собой актуальную задачу современной экспериментальной онкологии и молекулярной биологии.
Основные цели и задачи исследования
Целью настоящей работы являлась оценка противоопухолевого потенциала нового модулятора GR, CpdA, в клетках лейкозов и лимфом, а также исследование совместного антипролиферативного и проапоптотического действия Бортезомиба и CpdA.
Для достижения поставленной цели были выдвинуты следующие задачи:
-
Охарактеризовать клеточные линии лейкозов СЕМ и К562, и лимфом NCEB, Granta и Jeko, по экспрессии и функциональной активности GR.
-
Изучить закономерности антипролиферативного и проапоптотического действия нестероидного аналога GC, CpdA, в клетках лейкозов и лимфом.
-
Оценить генотоксический эффект СpdA.
-
Определить транс-активационный и транс-репрессорный потенциал CpdA при его действии на клетки лейкозов и лимфом.
-
Оценить потенциальную способность CpdA вызывать развитие резистентности в сравнении с GC.
-
Изучить закономерности антипролиферативного и проапоптотического действия различных комбинаций BZ и CpdA.
-
Исследовать влияние BZ на способность CpdA избирательно активировать GR-опосредованную транс-репрессию.
Научная новизна и практическая значимость исследования
При выполнении данного исследования был получен ряд приоритетных данных. В частности, впервые было показано, что клеточные линии лейкозов СЕМ и К562, и лимфом NCEB, Granta и Jeko, широко используемые при изучении новых противоопухолевых препаратов, экспрессируют функционально активный GR, не несущий в себе полиморфизмов и мутаций. Используя данные клеточные линии в качестве модельной системы, было продемонстрировано антипролиферативное и проапототическое действие нового нестероидного лиганда GR, CpdA, на клетки лейкозов и лимфом. В то же время было показано, что длительное применение CpdA не вызывает уменьшения экспрессии GR и, как следствие, развития резистентности. Способность CpdA вызывать транс-репрессию ряда генов, но не запускать транс-активацию были продемонстрированы на клетках гемобластозов также впервые. Было показано, что механизм транс-репрессии, запускаемый CpdA, является GR-зависимым процессом. Важными приоритетными данными являются результаты, свидетельствующие о кооперативном антипролиферативном и проапоптотическом эффектах CpdA и Бортезомиба на клетки лейкозов и лимфом, а также о потенцирующем действии BZ на способность CpdA избирательно активировать GR-опосредованную транс-репрессию.
Апробация работы
Диссертация апробирована и рекомендована к защите 14 сентября 2011 года на совместной научной конференции отдела химического канцерогенеза, отдела трансформирующих генов опухоли, лаборатории механизмов прогрессии эпителиальных опухолей, лаборатории молекулярной эндокринологии, лаборатории онкогеномики, лаборатории цитогенетики НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 4 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата биологических наук.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста, содержит 36 рисунков, 4 таблицы, состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов», «Выводы», «Приложения», «Список литературы».Список литературы включает 273 источника, в том числе 8 публикаций в отечественных рецензируемых изданиях.
