Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Структура и функциональная активность рецептора интерлейкина -6
1.1. Общая характеристика рецептора интерлейкина-6 9
1.2. Структура внеклеточных доменов рецептора IL-6 и механизм передачи цитокинового сигнала 12
Глава 2. Материалы и методы 37
2.1. Материалы 37
2.2. Характеристика клинического материала 39
Глава 3. Результаты исследования 54
3.1. Функциональные особенности внеклеточных доменов gp130 и IL-6R субъединиц рецептора IL-6 54
3.2. Экспрессия рецептора IL-6 у больных множественной миеломой 78
Глава 4. Обсуждение результатов 105
4.1. Иммунологическая оценка экспрессии и активации рецептора IL-6 105
4.2. Клинико-иммунологические характеристики множественной миеломы и экспрессия рецептора IL-6 110
Выводы 126
Список сокращений 127
Список литературы 128
- Структура внеклеточных доменов рецептора IL-6 и механизм передачи цитокинового сигнала
- Характеристика клинического материала
- Экспрессия рецептора IL-6 у больных множественной миеломой
- Клинико-иммунологические характеристики множественной миеломы и экспрессия рецептора IL-6
Введение к работе
Актуальность темы
Воздействие цитокинов на пролиферацию и дифференцировку клеток костного мозга является мощным фактором гемопоэза и играет центральную роль в опухолевой прогрессии. Так, для многих В-клеточных неоплазий показано резкое повышение уровня основного фактора дифференцировки В-клеток интерлейкина-6 (IL-6). При этом клетки определенных типов опухолей требуют для пролиферации наличия высокой концентрации экзогенного IL-6, то есть являются IL-6-зависимыми. К таким опухолям относится множественная миелома. Показано, что при множественной миеломе передача сигнала с участием IL-6 является центральным механизмом опухолевой прогрессии. Выработка IL-6 при множественной миеломе поддерживается как функционированием аутокринной петли на опухолевых плазматических клетках, так и стромальным микроокружением костного мозга.
Действие IL-6 на клетки опосредуется образованием рецепторного комплекса с участием трансмембранных молекул – лиганд-связывающей молекулы IL-6R (CD126, gp80, -цепь) и трансдуцерной молекулы gp130 (CD130, -цепь), которые образуют рецептор интерлейкина-6. Исследовательскими группами получены несколько десятков моноклональных антител к внеклеточным доменам IL-6R и gp130 и описаны функциональные свойства соответствующих им специфических эпитопов. Методология использования широкого спектра моноклональных антител послужила мощным инструментом для изучения структуры рецептора и передачи им сигнала в живых клетках. Несмотря на это, данные об экспрессии IL-6R и gp130 на мембране клеток множественной миеломы, а также об особенностях регуляции опухолевого роста рецептором интерлейкина-6, остаются малочисленными. Основную сложность в получении этих сведений составляют гетерогенность и широкий диапазон уровня экспрессии рецептора интерлейкина-6 на различных экспериментальных клеточных линиях множественной миеломы, а также на опухолевых клетках больных множественной миеломой. Существенно различаются по уровню экспрессии рецептора интерлейкина-6 также опухолевые клетки, присутствующие в одном образце костного мозга больного. Кроме того, уровень экспрессии молекул рецептора интерлейкина-6 во многих случаях очень низкий. Таким образом, несмотря на непосредственное участие рецептора интерлейкина-6 в передаче пролиферативного и антиапоптотического сигналов опухолевыми клетками множественной миеломы, на настоящий момент не было проведено значимых систематических исследований взаимосвязи рецептора интерлейкина-6 с аберрантными характеристиками плазматических клеток.
Комплексное исследование значения рецептора интерлейкина-6 на мембране опухолевых клеток при множественной миеломе, а также оценка взаимосвязей клинических проявлений этого заболевания с экспрессией рецептора интерлейкина-6 представляют на сегодняшний день актуальное направление как в клиническом, так и в молекулярно-биологическом аспектах, и ведут к более глубокому пониманию факторов опухолевой прогрессии множественной миеломы.
Цель исследования
Изучить значение рецептора интерлейкина-6 на опухолевых клетках множественной миеломы.
Задачи исследования
-
Изучить с помощью моноклональных антител активационные состояния цепей рецептора интерлейкина-6 gp130 и IL-6R.
-
Дать количественную оценку компонентам рецепторного комплекса на клетках модельных миеломных культур.
-
Описать влияние IL-6 на компоненты рецепторного комплекса gp130 и IL-6R на экспериментальных моделях, а также на опухолевых клетках больных множественной миеломой.
-
Определить частоту и уровни экспрессии рецептора интерлейкина-6 на опухолевых клетках больных множественной миеломой.
-
Охарактеризовать взаимосвязь экспрессии рецептора интерлейкина-6 с аберрантным иммунофенотипом плазматических клеток.
-
Исследовать взаимосвязь наличия ДНК вируса HHV-8 в клетках костного мозга больных и экспрессии рецептора интерлейкина-6 на опухолевых плазматических клетках.
Научная новизна
Впервые подробно описан на клеточных линиях множественной миеломы, а также воспроизведен на клетках костного мозга больных множественной миеломой селективный механизм обратимого подавления интерлейкином-6 экспрессии его рецептора. Этот механизм проясняет способ функционирования IL-6 на опухолевых клетках в качестве фактора роста.
Впервые изучены уровень и характер экспрессии IL-6R на клетках больных множественной миеломой во взаимосвязи с иммунологическими и морфологическими
характеристиками опухолевого субстрата; выявлены новые закономерности на уровне клинической картины и иммунофенотипа. Показано, что уровень экспрессии CD126 коррелирует с количеством проплазмоцитов в составе опухоли, ассоциирован с выраженностью плазмоцитоза, и не коррелирует с аберрантной экспрессией CD45 и CD56.
Впервые дифференцированно рассмотрены особенности экспрессии рецептора IL-6 на клетках с наличием и отсутствием на мембране специфического плазмоклеточного антигена CD138 (синдекана-1). Показано существенное различие уровней CD126 на этих двух субпопуляциях опухолевых клеток. Экспрессия CD126 на клетках CD138+ более интенсивная; наличие CD126 на этих клетках взаимосвязано с увеличением количества клеток CD45- и CD56+. Уровень CD126 на клетках CD138- коррелирует с аберрантной экспрессией CD19.
Показано, что инфицированность вирусом герпеса человека 8 типа связана с усилением экспрессии CD126 на мембране опухолевых плазматических клеток.
Научно-практическая значимость работы
Основную научно-практическую значимость настоящей работы составляют 4 аспекта.
-
Методологический: представлен комплексный способ оценки слабой экспрессии рецептора IL-6 на мембране, применимый в анализе клинических данных, а также в исследованиях других слабо экспрессированных молекул. На линиях множественной миеломы показана возможность иммунологического разграничения активированного (димеризованного) и неактивированного состояний рецепторов IL-6.
-
Фундаментальный: выявлен и подтвержден на клиническом материале механизм селективной обратной регуляции интерлейкином-6 экспрессии рецептора интерлейкина-6 на клетках множественной миеломы.
-
Экспериментальный: полученные в работе результаты анализа иммунофенотипа клеток линий множественной миеломы являются платформой для экспериментального изучения особенностей неопластических плазматических клеток.
-
Клинический: обоснована необходимость дифференцированного рассмотрения CD138+ и CD138- субпопуляций плазматических клеток, различающихся в отношении экспрессии рецептора IL-6, иммунологических параметров опухоли и взаимосвязей с характеристиками клинической картины. Учет данных субпопуляций опухолевых клеток как новой клинической категории может применяться для оценки прогноза и выбора стратегии противоопухолевого лечения.
Основные положения, выносимые на защиту
-
При использовании моноклональных антител к внеклеточным доменам цепей рецептора IL-6 (gp130 и IL-6R) возможно иммунологическое цитофлуориметрическое разграничение эффектов, связанных с активацией рецептора, его ресинтезом и интернализацией.
-
На опухолевых клетках множественной миеломы имеет место эффект обратной регуляции экспрессии цепей рецептора IL-6R и gp130 интерлейкином-6.
-
Уровень экспрессии CD126 на опухолевых плазматических клетках является преимущественно низким, строго коррелирует с долей проплазмоцитов в костном мозге, а также ассоциирован с выраженностью плазмоцитоза.
-
Наличие экспрессии CD126 на мембране плазматических клеток сопутствует проявлению аберрантных иммунологических характеристик: увеличению доли клеток с CD45-, CD19-, CD56+. В то же время отсутствует линейная зависимость уровней экспрессии CD126 и аберрантных маркеров.
-
Существует статистически достоверное различие экспрессии CD126 на клетках субпопуляций CD138+ и CD138-: клетки CD138- экспрессируют CD126 в меньшей степени (в отношении частоты экспрессии, р=0,001 и по уровню экспрессии, р=0,003).
-
Значение рецептора IL-6 на мембране клеток CD138+ и CD138- различается: только для клеток CD138+ показана взаимосвязь между присутствием CD126 на мембране и высокими уровнями плазмоцитоза, проплазмоцитов, высокой экспрессией CD56, низкой экспрессией CD45 и наличием аберрантного иммунофенотипа плазматических клеток CD45-/CD19-/CD56+.
-
Наличие на мембране рецептора IL-6 ассоциировано с иммуноморфологическими параметрами костного мозга в большей степени, чем уровень его экспрессии.
-
Инфицированность клеток костного мозга вирусом HHV-8 ассоциирована с усилением экспрессии CD126 на опухолевых плазматических клетках (р<0,05).
Апробация диссертации
Апробация диссертации состоялась 21 января 2014 года на совместной конференции отделения химиотерапии гемобластозов, лаборатории клинической иммунологии опухолей, лаборатории иммунологии гемопоэза НИИ клинической онкологии, отделения химиотерапии гемобластозов НИИ детской онкологии и гематологии, лаборатории механизмов регуляции иммунитета, лаборатории генетики опухолевых клеток НИИ канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН, кафедры онкологии, кафедры детской онкологии РМАПО.
Публикации по теме диссертации
По теме диссертации опубликовано 3 статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК РФ, и 4 сообщения на российских и международных конференциях.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста, состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Список литературы содержит 160 источников, из которых 6 отечественных и 154 иностранных. Работа иллюстрирована 24 рисунками и 21 таблицей.
Структура внеклеточных доменов рецептора IL-6 и механизм передачи цитокинового сигнала
Строение трансдуцерной молекулы gp130 изучалось с середины 1990-х годов [Bazan, 1990; Cosman, 1993; Bravo et al., 1998] и на данный момент описано подробнейшим образом [Wang et al., 2009]. Молекула gp130 представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 130 кДа с длиной полипептидной цепи 918 остатков; цитоплазматический домен содержит 277, трансмембранный – 22, внеклеточный - 619 аминокислотных остатков. N-концевая внеклеточная часть gp130 образована: a) дистальным по отношению к мембране иммуноглобулин-подобным доменом (D1, IgD); б) цитокин-связывающим доменом (CHR, цитокин-связывающий гомологичный район), консервативным для всех рецепторов класса гемопоэтинов; он состоит из двух фибронектиновых доменов III типа (D2, D3), один из которых (D2) характеризуется наличием двух цистеиновых мостиков, а другой (D3) – также консервативным для этой группы цитокиновых рецепторов мотивом WSXWS и в) еще тремя фибронектиновыми доменами III типа (D4, D5, D6), образующими длинную «ножку» рецептора (рисунок 1.1 А). Международная база данных структур белков и нуклеиновых кислот Protein Data Bank (PDB) представляет 10 кристаллических структур с участием молекулы gp130: фосфорилированный в положении Y757 цитоплазматический домен в комплексе с SOCS3 (2HMH, 2BBU); гексамер, образуемый экстрацеллюлярными доменами gp130 D1, D2, D3 c IL-6R и IL-6 (1P9M); тетрамер вирусного интерлейкина-6 и доменов D2, D3 gp130 (1I1R); LIF, связанный с D2, D3 gp130 (1PVH); N-концевой домен D3 gp130 (1BJ8), цитокин-связывающий центр gp130 – домены D2-D3 (1BQU); мембранно-проксимальная «ножка» рецептора gp130 – домены D4-D5-D6 (3L5I, 3L5J). Нативные молекулы gp130 человека могут быть не только мембранно-ассоциироваными, но также присутствуют во внеклеточном пространстве в растворимой форме. Это гликопротеины с молекулярной массой 100 кДа, фактически являющиеся свободными от трансмембранной и внутриклеточной части молекулами gp130, которые образуются по различным данным [Diamant et al., 1997; Narazaki et al., 1993; Mullberg et al., 1993] либо в результате протеолиза мембранных молекул gp130, либо альтернативного сплайсинга его мРНК. Наличие альтернативной формы gp130, обладающей цитокин-связывающим, но не трансдуцерным свойством, может трактоваться как одно из проявлений антагонистической регуляции передачи сигнала, однако существуют предположения [Gaillard et al., 1999], что gp130 может содержать дополнительные регуляторные участки и самостоятельно связывать не только молекулы комплексов цитокинов с их –цепями, но и сами -цепи или другие молекулы.
Рекомбинантный gp130, представляющий собой внеклеточную часть трансдуцерной молекулы, получают с помощью бакуловирусной экспрессионной системы в клетках насекомых или экспрессируют в клетках CHO и выделяют из надклеточного супернатанта иммунопреципитацией на анти-gp130 моноклональных антителах; он имеет молекулярную массу 65 кДа, не является гликопротеином, но сохраняет цитокин-связывающие свойства [Hibi et al., 1990; Muller-Newen et al., 1998; Liautard et al., 1997]. 1.2.2. Структура IL-6R кДНК -цепи рецептора IL-6 кодирует 468 аминокислот, включая сигнальный пептид (19 остатков), внеклеточный, трансмембранный и короткий внутриклеточный домены (339, 28, 82 аминокислотных остатков соответственно). Молекулярная масса нативного гликозилированного рецептора 80 кДа; его расчетный вес без учета альтернативного сплайсинга и гликозилирования 50 кДа. Клонирование IL-6R впервые описано группой японских ученых, открывших обе цепи рецептора IL-6 – gp130 и IL-6R [Yamasaki et al., 1988]. Рентгеноструктурное исследование молекулы IL-6R [Varghese et al., 2002] выполнено с использованием рекомбинантного не гликозилированного белка, экспрессированного в клетках СНО. Внеклеточная часть молекулы IL-6R построена по тому же принципу, что и gpl30. В его основе лежат доменная структура, а также присутствие консервативных для цитокиновых рецепторов I класса элементов: WSXWS-мотива, двух консервативных цистеинов и насыщенного пролином участка между цитокин-связывающими доменами. IL-6R содержит N-концевой Ig-подобный домен (D1) и 2 домена фибронектинового типа (D2 и D3), образующие цитокин-связывающий центр (рисунок 1.1 Б). D1 не участвует в непосредственном распознавании лиганда и инициации сигнала, однако он поддерживает стабильность структуры за счет дисульфидной связи с доменом D2 и способствует интернализации рецептора в клетку [Ozbek et ah, 1998]. Трансмембранный и цитоплазматический домены не участвуют в передаче сигнала, в то время как эктодомен IL-6R может проявлять самостоятельную биологическую активность в виде растворимого IL-6R (sIL-6R). Растворимый sIL-6R активно участвует в инициации сигнала IL-6 во всех тканях организма, поскольку он наравне с мембранным аналогом связывает IL-6 и активирует повсеместно экспрессированный gpl30. Роль этого белка в опухолевых IL-6-зависимых процессах интенсивно изучается и будет подробно рассмотрена ниже.
В международной базе данных PDB -цепь рецептора IL-6 представлена тремя кристаллическими структурами: это описанная выше внеклеточная часть (1N26); мембранно-проксимальный домен D3 (2ARW); IL-6R в составе гексамера (IL-6)2/(IL-6R)2/(gp 130)2 - (1Р9М). Две молекулы IL6R, располагающиеся в гексамере рядом, ориентированы по принципу «голова-хвост» и, вероятно, представляют пространственную организацию рецепторного комплекса в физиологических условиях.
Характеристика клинического материала
Для проведения работы с культурами клеток использовали стерильные боксы с ламинарной подачей воздуха БОВ-001-АМС (вариант «СЛШ») и NuAire Labgard Class II, СО2-инкубатор (NuAire, Франция), центрифуги ОС-6М (для микропланшет и вкладышей-фильтров CYTOSET), ELMI СМ-6М, автоматический гематологический анализатор ABX Micros 60 (Horiba ABX, Франция). ПЦР проводили на амплификаторе «Терцик», Россия. Микроскопический анализ клеточных культур и флуоресцентных препаратов проводили с помощью флуоресцентного микроскопа Axioplan 2 (увел. х400) и инвертированного микроскопа (увел. х200) Сarl Zeizz (Германия).
Трехцветная проточная цитометрия выполнена на приборах FACScan (Becton Dickinson, США) и EPIC XL-MCL (Becton Coulter, США) c использованием коммерческих растворов и рекомендуемых методик. Анализ данных проводили на персональном компьютере с использованием программ WinMDI 2.8 и FCS3.
В работе использовали стерильные одноразовые пипетки и культуральные флаконы (25см2), вкладыши-фильтры для приготовления цитоцентрифужных препаратов CYTOSET (MPW, Польша), а также полистироловые круглодонные 96-луночные планшеты (Медполимер, Россия), полистироловые и полипропиленовые пробирки объемом 10, 15 мл (Sarstedt, Германия), микропробирки объемом 1,7 мл и 2 мл (Costar Corning, США).
В настоящее исследование включены образцы костного мозга 27 больных множественной миеломой, проходивших лечение в отделениях химиотерапии гемобластозов, трансплантации костного мозга, ФГБУ «Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина» РАМН с 2010 по 2013 годы. Среди больных было 15 мужчин, 12 женщин; медиана возраста на момент исследования составила 61 год. Уровень плазмоцитоза костного мозга составлял 0,6 - 49% клеток плазмоцитарного ряда от общего количества миелокариоцитов (медиана 15,2%).
Для установления диагноза у больных выполнялись рентгенологическое обследование костей, биохимический анализ крови и мочи, морфо-цитохимическое исследование пунктата костного мозга, а также иммунофенотипирование плазматических клеток костного мозга методом проточной цитометрии. Клинический диагноз множественной миеломы устанавливался согласно Международной классификации ММ, разработанной в 2005 году Международной рабочей группой по изучению ММ (International Myeloma Foundation, IMF). Биопсию и пункцию костного мозга подвздошной кости осуществляли стандартным методом. Объем аспирата составлял 0,5 – 1,5 мл. Исключали наличие разбавления пунктата периферической кровью морфологически по уровню клеточности и по составу костного мозга. Биопсийный материал подвергали исследованию в течение 1-7 часов после его получения из подвздошной кости.
Морфо-цитохимическая часть исследования, являющаяся рутинным этапом диагностической работы и включающая подсчет миелограммы, была выполнена в морфоцитохимической группе лаборатории иммунологии гемопоэза (рук. проф., д.м.н. М.А. Френкель). Препараты мазков костного мозга, окрашенные по методу Романовского, исследовали с помощью иммерсионной микроскопии (увел. х 1000). Подсчет лимфоцитов по 250 клеток проводился независимо двумя специалистами для каждого препарата.
Клетки множественной миеломы линий RPMI8226 и IM9 культивировали в питательной среде RPMI-1640, содержащей 2мМ L-глутамин, 10% телячью эмбриональную сыворотку и 0,1 мг/мл гентамицин, в стерильных культуральных флаконах 25см2 при 37С во влажной атмосфере с содержанием 5% СО2. Пересевали клетки каждые 2-4 дня по мере достижения ими плотности 1х106 кл/мл. Для этого отбирали 1-2 мл клеточной суспензии, вносили ее в культуральный флакон и затем добавляли 8-9 мл свежей культуральной среды. Для всех экспериментов использовали клетки в логарифмической фазе роста.
Клетки линий XG-1 и XG-2 (IL-6-зависимые), XG-2PA (B1+I2-зависимые), BAF130/190 (LIF-зависимые) культивировали в описанных выше условиях, но с добавлением в среду при пересеве необходимых ростовых факторов: IL-6 5 пМ (0,1 нг/мл), B1 и I2 по 0,5 мкг/мл каждое, LIF 10 пМ, соответственно.
В основу изучения функциональных особенностей внеклеточных доменов субъединиц рецептора IL-6 gp130 и IL-6R был положен принцип оценки количеств отдельных эпитопов gp130 и IL-6R методом проточной цитометрии с непрямой детекцией с помощью соответствующих панелей анти-gp130 и анти- IL-6R МКА. Клетки линий RPMI8226, IM9, XG-1, XG-2, XG-2PA, BAF130/190, находящиеся в логарифмической фазе роста, переносили в пробирки типа «эппендорф», центрифугировали при комнатной температуре 7 мин со скоростью 1000 об/мин и отбирали супернатант, содержащий отработанную ростовую среду. Клетки осторожно ресуспендировали в 500 мкл холодного буферного фосфатного раствора, pH=7,4. В лунки круглодонного 96-луночного планшета вносили на льду по 0,3-0,5 млн. клеток. Добавляли 50 мкл 0,5 мкг/мкл (25 мкг) определенного МКА в PBS, содержащем 0.02% NaN3, хорошо перемешивали и оставляли при +4С на 30 мин. Затем на льду добавляли PBS до полного объема лунки, аккуратно ресуспендировали, центрифугировали 7 мин при 1000 об/мин и сразу после окончания центрифугирования стряхивали супернатант. Промывку затем повторяли дважды, после чего проявляли связавшиеся МКА с помощью F(ab )2-FITC, так же, как описано в разделе (метод непрямой иммунофлуоресценции). Данную методику применяли в экспериментах по димеризации и интернализации субъединиц рецептора с вариациями, затрагивающими температуру и время инкубации клеток с МКА.
Влияние на эпитопы gp130 и IL-6R функционально неактивного аналога IL-6 – суперантагониста IL-6 SANT5 также изучали в рамках описанного метода, в котором связыванию специфических МКА предшествовала стадия преинкубации клеток с аналогом цитокина. Реакции проводили при +4С при концентрации SANT5 5 пг/мл (0,25 нМ). Промывку клеток перед добавлением анти-gp130 и анти-IL6R МКА не проводили.
Экспрессия рецептора IL-6 у больных множественной миеломой
Экспрессия -цепи рецептора интерлейкина-6 на мембране плазматических клеток костного мозга больных ММ была охарактеризована цитофлуориметрически на клиническом материале аспиратов костного мозга 27 больных при наличии значительного количества опухолевого субстрата – плазматических клеток в костном мозге. Основываясь на литературных данных, относящихся к клеточным линиям множественной миеломы, а также на данных клинических исследований, проведенных ранее и рассмотренных в главе «Обзор литературы», мы предполагали показать экспрессию IL-6R в широком диапазоне интенсивности, в том числе яркую при прогрессии заболевания. Для достижения наилучших показателей чувствительности мы использовали конъюгированное с РЕ анти-IL-6R (CD126) МКА, имеющее преимущество перед аналогичным FITC-мечеными МКА.
Обнаруженный нами уровень экспрессии IL-6R на плазматических клетках, гейтированных в координатах SSCLow/CD38++, был преимущественно очень низким, за исключением нескольких случаев (табл. 3.2.1). Тем не менее, тщательный анализ цитофлуориметрических данных в большинстве наблюдений демонстрировал четкое положительное различие между экспрессией CD126 и контрольным отрицательным маркером CD3. Методология численного представления данных при слабой экспрессии белков отлична от рассмотрения ярко экспрессируемых молекул, поскольку классические параметры доли позитивных клеток и категории high/dim/low в данном случае не применимы [Rawstron et al., 2000]. Наиболее пригодны два метода описания низких значений экспрессии рецептора: анализ соотношения (MFR, mean fluorescence ratio) средних значений интенсивности флуоресценции MFI (mean fluorescence intensity) рецептора и контрольного маркера MFR = MFICD126/MFICD3 [Jego et al., 2001, Perez-Andres et al., 2009] и непараметрический анализ гистограмм распределения В некоторых работах [Kovacs, 2006] используют также характеристику смещения среднего геометрического исследуемого распределения от контроля интенсивности флуоресценции рецептора и контроля по Колмогорову-Смирнову [Young, 1977]. Графическая иллюстрация теста Колмогорова-Смирнова представлена на рисунке 3.2.1. В этом методе логическим основанием перехода от непараметрического коэффициента D (K-S) к уровню экспрессии является доказанная строгая корреляция экспрессии молекул на мембране клетки со степенью различия форм исследуемого и контрольного распределений [Shinjo et al., 1997]; при этом значение D (K-S) может варьировать от 0 (отсутствие различий между экспериментальным и контрольным распределением, полное отсутствие экспрессии) до 1 (ярко выраженное наличие экспрессии).
Таким образом, мы представили все значения экспрессии IL-6R (CD126) в виде характеристик а) классической доли рецептор-позитивных клеток %CD126+, б) соотношения средних значений интенсивности сигнала и шума (контроля) MFR(I) = Gmean (CD126+)/ Gmean (CD3), и в) коэффициента Колмогорова-Смирнова D (K-S), рассчитанного в программе CellQuest с использованием непосредственно исходной базы цитофлуориметрических данных.
Доля CD126+ 74% 76% 81% 44% (СD126++) В рамках получения клинических данных мы оценили основные метрологические характеристики метода с использованием рабочего анти-IL-6R МКА: точность, правильность, прецизионность (повторяемость и воспроизводимость) с использованием двух дополнительных анти-IL-6R-PE (разные лоты другого производителя), анти-IL-6R M-91-биотин, а также различных титров рабочего МКА - в начале и в середине сбора клинических данных. Проведенные эксперименты позволили нам убедиться в методологической адекватности детекции уровня экспрессии CD126 на плазмоцитах. Анализ показал, что отклонение в повторах не превышало 2%; уровень экспрессии, измеренный с МКА двух фирм-производителей не различался более чем на 10%; использование двойного окрашивания для детекции CD126 выявило сходимость как значений уровня, так и характера экспрессии наблюдаемого маркера.
Исходя из представленных в таблице 3.2.1 значений для каждой из описанных выше характеристик экспрессии CD126, мы ввели категории наличия либо отсутствия экспрессии рецептора на мембране клеток. В случае процентного выражения уровня антиген-позитивных клеток условием наличия экспрессии явилась положительная разность между средними геометрическими значениями уровней флуоресценции CD126 и контроля (CD3), т.е. разница сигнал-шум. Аналогично, с помощью соотношения сигнал/шум описано наличие экспрессии для категории MFR(I). Разграничение же наличия и отсутствия экспрессии, описанной в статистических значениях D (K-S), потребовало определенной математической обработки данных индивидуально по каждому пациенту. Методика подобной оценки предложена [Young, 1977] и критически обсуждена в ряде работ [Lampariello, 2000; Watson, 2001] и состоит в проверке нулевой гипотезы теста при сравнении расчетного коэффициента D (K-S) со значением
Нижняя часть таблицы 3.2.1 показывает обобщенные характеристики экспрессии CD126, которые демонстрируют сходимость результатов анализа уровня экспрессии с помощью параметров %CD126+, MFR(I), D (K-S): 70-80% пациентов характеризуются наличием CD126 на мембране опухолевых клеток, при этом количество рецептор-положительных клеток мало (около 5%), так же как мала и яркость наблюдаемой экспрессии (медиана соотношения сигнал/шум = 1,21). Доля случаев, при которых %CD126+ 10%, составила 37% от общего числа пациентов и 50% от случаев с наличием CD126 на мембране.
Медиана уровня яркой экспрессии CD126 (в случае ее наличия) составила 4,85, то есть данная популяция клеток экспрессирует CD126 сильнее основной популяции не более, чем на одну единицу в логарифмической шкале. Медиана доли CD126++ клеток составила 2% от общего числа флуоресцентно окрашенных плазмоцитов. Этот показатель, как мы видим, не ниже экспериментальной погрешности, кроме того, для избежания ошибочного включения неспецифического сигнала в расчеты в каждом случае данная популяция клеток была внимательно изучена в сравнении с популяцией, детектируемой маркером отрицательного контроля (CD3). Поскольку, согласно данным литературы [Rawstron et al, 2000], CD126 может быть по-разному экспрессирован на клетках одного образца, мы сочли важным учет и изучение популяций опухолевых плазмоцитов с высоким уровнем экспрессии рецептора интерлейкина-6.
Клинико-иммунологические характеристики множественной миеломы и экспрессия рецептора IL-6
Обширная часть настоящего исследования основана на анализе взаимосвязей экспрессии лиганд-связывающей компоненты рецептора интрелейкина-6 – его -цепи, или IL-6R (CD126) с клиническими параметрами ММ. IL-6R отвечает за IL-6 сигнализацию и экспрессируется, в отличие от -цепи рецептора (gp130), на определенных типах клеток, в том числе, на трансформированных плазматических клетках при ММ. Уровень экспрессии CD126 на мембране опухолевых клеток больных в большинстве случаев очень низкий, в отличие от экспрессии рецептора на стандартных миеломных клеточных линиях, что сложно согласовать с фактом ведущей регуляторной роли IL-6 в пролиферации и выживании клеток при множественной миеломе. Высказываются предположения, что сигнализацию IL-6 модулирует растворимая форма рецептора sIL-6R, либо существуют механизмы регуляции экспрессии CD126, активизирующиеся при антиапоптотическом и пролиферативном ответе опухолевых клеток на внешние условия. CD126 экспрессирован, как правило, мономорфно; редко присутствует ярко выраженная небольшая популяция клеток с интенсивной экспрессией – CD126++, которая может иметь собственное функциональное значение [Rawstron et al., 2000]. При оценке взаимосвязей характеристик опухолевых клеток мы параллельно использовали значения экспрессии CD126, полученные тремя расчетными методами обработки цитофлуориметрических данных. Эти значения в тесте Пирсона показали высоко достоверную корреляцию между собой (р 0,001), что позволило нам оперировать в категориях близких к достоверным закономерностей и дополнительно отслеживать воспроизводимость полученных статистических коэффициентов, несмотря на низкое соотношение сигнал/шум экспрессии CD126. Дополнительно мы использовали более жесткий критерий – CD126 10%, позволяющий четко разграничить и охарактеризовать наличие и отсутствие эффекта CD126.
Важную информацию о механизмах малигнизации плазматических клеток может дать изучение влияния вирусного интерлейкина-6 на экспрессию CD126 опухолевыми клетками при ММ. В группе пациентов, инфицированных вирусом герпеса 8 типа и cодержащих мРНК гена вирусного интерлейкина-6 в клетках костного мозга, мы установили статистически достоверную прямую взаимосвязь (p 0,03) между наличием гена vIL-6 и уровнем экспрессии CD126 на всех опухолевых клетках при ММ (таблица 3.4.2). Однако эта взаимосвязь не может быть интерпретирована как прямое воздействие vIL-6 на рецептор ввиду описанного нами механизма обратной регуляции уровня CD126 интерлейкином-6. Наличие гена вирусного IL-6 высоко достоверно ассоциировано также с наличием проплазмоцитов (р=0,006). Исходя из этого, а также из прямой корреляции уровней CD126 и проплазмоцитов (р 0,001 для корреляции Пирсона), очевидно, что вирусный цитокин активирует продукцию CD126 на опухолевых клетках по механизму, осуществляемому проплазмоцитами. Источником вирусного цитокина могут являться сами проплазмоциты, принимая во внимание, что ранее уже высказывались предположения [Широков, 2006] о персистенции вируса HHV-8 именно в этом типе клеток при ММ. В последнее время большую актуальность получили исследования, связанные с различиями экспрессии синдекана-1, или CD138, на клетках опухолевого клона при ММ. Показано, что в большинстве клинических случаев [Paiva et al., 2013; Hosen et al., 2012], а также стандартных клеточных линий ММ [Fuhler et al., 2010; Jakubikova et al., 2011] опухолевые клетки представлены совокупностью CD138+ и CD138- субпопуляций, причем обе они являются клоногенными [Matsui et al., 2004; Van Valckenborgh et al., 2012, Hosen, 2013] и играют роль в патогенезе ММ. Клетки CD138+ зрелые, долгоживущие, составляют, как правило, основную опухолевую массу и проявляют высокий клоногенный и опухоле-инициирующий потенциал, поэтому изначально именно эту субпопуляцию рассматривали при изучении неопластических клеток ММ. В отличие от них, клетки CD138-, слабо экспрессирующие синдекан-1 и имеющие незрелый фенотип [Reid et al., 2010; Kawano et al., 2012], устойчивы к терапевтическим агентам, таким как мелфалан и леналидомид [Van Valckenborgh et al., 2012; Kawano et al., 2012], отражают степень прогрессии ММ, а также апоптотический индекс (как спонтанный, так и индуцированный химиотерапией) [Bataille, et al., 2006]. Более того, наличие существенной популяции CD138-клеток ассоциировано с плохим прогнозом, высокой вероятностью рецидива и со способностью к быстрому метастатическому росту [Kawano et al., 2012; Aref et al., 2003]. Появление этой субпопуляции происходит вследствие утери синдекана-1 при его протеолитическом высвобождении в межклеточное пространство [Dhodapkar et al., 1999; Sanderson et al., 2008, Grigoriadis et al., 2010] и сопровождается изменениями профиля экспрессии генов (в том числе XBP-1, IRF-4, BMP-1) [Jacak et al., 2013; Kawano et al., 2012; Van Valckenborgh et al., 2012] и параметров иммунофенотипа. Так, на клетках CD138- может увеличиваться экспрессия CD45 [Reid et al., 2010]. Белковая основа молекулы синдекана-1 обычно модифицирована гепарансульфатом, который служит якорем в межклеточном матриксе, а также резервуаром для IL-6 и других факторов роста [Jourdan et al., 1998; Mummery et al., 2000; Sanderson et al., 2002]. При расщеплении и утере синдекана-1 c поверхности клетки ростовые факторы высвобождаются и обеспечивают метастатическую активность и антиапоптотическое действие [Wu et al., 2012]. Показано также, что этот процесс не зависит от исходной активации gp130 [Jourdan et al., 1998]. Кроме того, предполагается, что устойчивость CD138- клеток к STAT3-апоптозиндуцирующим химиотерапевтическим агентам обуславливается ключевой ролью IL-6 сигнализации [Van Valckenborgh et al., 2012]. Несмотря на то, что в некоторых работах оспаривались клоногенность [Chiron et al., 2012] и наличие в костном мозге опухолевых клеток CD138-, в том числе, с отнесением их появления к апоптотическим артефактам при пробоподготовке и хранении аспиратов костного мозга [Jourdan et al., 1998; Zhuang et al., 2005; Christensen et al., 2012], в последние годы убедительно доказана существенная роль клеток CD138- в прогрессии заболевания. Подробно описана соответствующая популяция клеток и на нормальных плазматических клетках [Cocco et al., 2012]. Учитывая представленные выше характеристики CD138 на плазматических клетках при ММ и центральное значение IL-6 в модуляции CD138-опосредованного туморогенеза, представляется важным дифференцировать экспрессию рецептора IL-6 на клетках CD138+ и CD138-. Это позволит провести для двух описанных субпопуляций анализ взаимосвязей экспрессии рецептора IL-6 с иммуноморфологическими параметрами опухолевых клеток и описать молекулярные закономерности опухолевой прогрессии.
Дифференцированная обработка цитофлуориметрических данных клинических препаратов костного мозга больных ММ в гейтах CD38+/CD138+ и CD38+/CD138- позволила установить, что экспрессия CD126 достоверно различается на клетках CD138+ и CD138-: в отсутствие синдекана-1 уровень экспрессии CD126 ниже (р=0,003), на таких клетках не формируются популяции с яркой экспрессией CD126++, однако линейная связь между уровнем экспрессии CD126 и объемом популяции CD138- отсутствует. По данным корреляционного анализа (таблица 3.2.4) для всех плазматических клеткок, как CD138+, так и CD138-, характерна статистически достоверная корреляция уровня экспрессии CD126 с количеством морфологически незрелых форм плазмоцитов в костном мозге; в то же время менее зрелые CD138- клетки проявляют более яркую взаимосвязь уровня CD126 с количеством проплазмоцитов, а также обнаруживают корреляцию уровня CD126 c уровнем плазмоцитоза и с экспрессией СD19. Учитывая статистически достоверное снижение количества морфологически незрелых форм опухолевых клеток при образовании CD138-популяции (р 0,03), мы можем предположить экспрессию CD126 в опухолевом пуле клеток преимущественно на проплазмоцитах, что требует дальнейшего иммунологического подтверждения, поскольку маркеры CD38 и CD138 демонстрируют мономорфное распределение между морфологически зрелыми и незрелыми опухолевыми клетками. Такое предположение согласуется с литературными данными о том, что CD126 ассоциирован с менее зрелым фенотипом опухолевых клеток [Rawstron et al., 2000]. Следует отметить, что популяции морфологически незрелых клеток (проплазмоцитов) и иммунологически незрелых клеток (CD138-) оказываются в реципрокной взаимосвязи, что говорит о существенном различии механизмов, определяющих появление этих популяций. Уровень экспрессии CD126, согласно нашим данным, модулируется именно проплазмоцитами.
