Введение к работе
Актуальность темы.
Актуальность изучения фотосинтеза связана с тем, что этот процесс обеспечивает возможность существования жизни на Земле. Пигмент-белковые комплексы фотосинтезирующих организмов осуществляют поглощение и преобразование световой энергии в энергию химических связей продуктов фотосинтеза. Первичное преобразование энергии света происходит в реакционных центрах (РЦ) фотосинтеза. Реакционные центры фотосинтезирующих бактерий являются хорошей модельной системой для исследования первичных процессов разделения зарядов. РЦ пурпурной бактерии Rhodobacter (Rba.) sphaeroides представляет собой транс-мембранный пигмент-белковый комплекс, состоящий из трех белковых субъединиц (Н, М и L) и десяти кофакторов. Структура этого РЦ впервые была определена в 1984 г в лаборатории Michel, Германия, открыв возможности для исследования механизмов первичных процессов фотосинтеза. Известно, что процесс фотосинтетического разделения зарядов в РЦ - это чрезвычайно быстрый и эффективный процесс, квантовый выход которого близок к единице. Согласно современным представлениям, высокая эффективность функционирования РЦ определяется свойствами кофакторов, их взаимодействием друг с другом и с белковым окружением. Метод направленного мутагенеза позволяет селективно изменять аминокислотный состав в участках связывания хромофоров, влияя на их свойства. Сочетание этого метода с современными биохимическими и биофизическими методами является перспективным подходом к исследованию механизмов начальных стадий фотопереноса электрона в РЦ и изучению роли белка в этом процессе.
Цель работы и задачи исследования.
Целью работы было выяснение влияния белкового окружения вблизи молекул бактериохлорофиллов Рд и Вв на свойства и функциональную активность РЦ Rba. sphaeroides. В связи с поставленной целью были определены следующие задачи:
Внесение направленных мутаций в pu/L- и pufM- гены реакционного центра Rba. sphaeroides.
Подбор условий для выделения генетически модифицированных РЦ 1(Ы77)Н, H(L173)L+ I(L177)H и H(M182)L+ I(L177)H и их выделение.
Исследование влияния аминокислотных замещений в позициях L177, L173 и Ml82 на свойства генетически модифицированных РЦ 1(L177)H, H(L173)L+ I(L177)H и H(M182)L+ I(L177)H.
Научная новизна.
С помощью метода сайт-направленного мутагенеза были созданы новые комбинации аминокислотных замещений I(L177)H, H(L173)L+I(L177)H и H(M182)L+ I(L177)H в реакционном центре Rba. sphaeroides. Получены РІД І(И77)Н, в которых атом магния БХл Вв 6ти-коордшшрован. Показано, что в результате аминокислотного замещения fie—>His в РЦ I(L177)H и I(L177)H+H(M182)L произошло ковалентное связывание молекулы БХл и L-субъединицы. Получены РЦ двойного мутанта I(L177)H+H(M182)L, где лиганд атома магния молекулы БХл Вв расположен не с обычной, а- стороны, а с (5-стороны макроцикла тетрапиррольного кольца. Установлено, что в РЦ H(L173)L+I(L177)H, в отсутствие природного лиганда атома магния - гистидина L173, аминокислотный остаток гистидияа L177 лигандирует атом магния бактериохлорофилла Рд.
Апробация работы.
Материалы диссертации были представлены на 9-ой и 11-ой международных конференциях молодых ученых (Пущино, 2005; 2007), Международном биофизическом конгрессе (Франция, 2005), XVIII Пушинских чтениях по фотосинтезу и Всероссийской конференции «Преобразование энергии света при фотосинтезе (Пущино, 2005), Международной конференции «Фотосинтез в пост-геномную эру» (Пущино, 2006), Международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Япония, 2006), Международном симпозиуме по фотосинтетическим прокариотам (Франция, 2006), Международной конференции по тетрапиррольным фоторецепторам фотосинтетических организмов (Япония, 2007), Европейской биоэнергетической конференции (Ирландия, 2008), Международной конференции «Преобразование энергии света при фотосинтезе» (Пущино, 2008), на Гордоновских чтениях по фотосинтезу (США, 2008), на конференции «Фотохимия хлорофилла в модельных и природньк системах» (Пущино, 2009), и на XIII Европейской конференции по спектроскопии биологических молекул (Италия, 2009).
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 27 работ, из них одна статья в зарубежном журнале FEBS letters, три статьи в отечественном журнале Биохимия, 23 тезиса в материалах отечественных и международных конференций.
Связь с плапом научно-исследовательского института.
Тема диссертации является частью плановой темы института. Работа выполнялась при финансовой поддержке Федерального агентства по науке и инновациям Российской академии наук (02.512.11.2085; 02.740.11.0293), программами Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», «Экстремальные световые поля и их приложение», грантом Президента РФ (№ НШ-3277.2006.4; НШ-4525.2008.4) и РФФИ (03-04-48215; 06-04-48686; 09-04-00109).
Структура и объем работы.
