Содержание к диссертации
Стр.
ВВЕДЕНИЕ ' 6-II
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: ФЖШТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ
НАДФ4; И ПРОЦЕССЫ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ........... 12-47
1.1. Роль никотинамидных коферментов в метаболизме
клетки и их участие в процессах дифференцировки . . . 12-30
I.I.I. Функции НАД!; и МЩ? 12-16
ІД.2. HAjf и НАДФТ как регуляторы активности фермен
тов 16-18
I.I.3. Соотношение НАД!" и НАДФ~!" в клетках и его связь
с обменом веществ и дифференцировкой 18-30
1.2. НДД^киназа и ее функции 30-47
НАД^киназа и превращения никотинамидных коферментов 30-32
Роль НАД"!"киназы в дифференцировке и регуляции обмена веществ 32-47
Участие НАД!"киназы в процессах дифференцировки 32-37
НАД^киназа и гормональный контроль ..... 37-41
Роль НАД!"киназы в адаптации 41-43
1.2.3. Возможные механизмы регуляции активности HAjf-
киназы ... 43-47
ГЛАВА П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДУ 48-59
Объект исследования 48
Условия культивирования 49-50
Получение бесклеточного экстракта 50
Обработка гомогенатов N.crassa при определении внутриклеточной локализации HAjf киназы 50-51
Определение активности НАД^киназы 51-53
Определение концентрации белка 53
Энзим-электрофорез . . . 54
Определение молекулярной массы HAif киназы методом электрофореза в полиакриламидном геле 55
Определение молекулярной массы HAjf киназы методом гельфильтрации . . 55-56
Аналитическое изоэлектрическое фокусирование HAjOf-киназы на пластинах полиакриламидного геля 56-57
Препаративное изоэлектрическое фокусирование HAjf-киназы в гранулированном геле - ультродексе 57-58
Реактивы 58-59
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 6Q-I28
ГЛАВА Ш. СВОЙСТВА НАД^КИНАЗЫ neurospora crassa .... 6Q.-80
Внутриклеточная локализация HAjfкиназы N.crassa... 60-61
Оптимум рН и стабильность HAJJj киназы N. crassa при различных рН 62-64
Зависимость активности HAjf киназы N.crassa от природы фосфорильного донора и присутствия ионов металлов ... 64^68
Влияние сульфгидрильных реагентов на активность НАД^КИНаЗЫ N.crassa 68-72
Влияние солей на НАД!"киназную активность N. crassa. 72
Особенности поведения НАД4"киназы при хроматографии на голубой сефарозе 73-80
ГЛАВА ІУ. ОЧИСТКА НАД+КИНАЗЫ ИЗ КЛЕТОК N.CRASSA. ..... 81-93
Разработка подходов к очистке HAjf киназы из N. crassa 81-87
Получение очищенного препарата НАД^киназы из N.
crassa 87-90
4.3. Кинетические характеристики очищенного препарата
НАДІ"КИНазы N.crassa 9С&-93
4
. ГЛАВА У. HAjfMHASA В РЕГУЛЯЦИИ МЕТАБОЛИЗМ И
ОНТОГЕНЕЗА N. GRASS А . . . 94-112
Динамика удельной активности НАД* киназы в онтогенезе N.crassa ..... 94-100
Регуляция активности НАД^киназы N.crassa при фотостимуляции конидиогенеза и фотоиндукции каротиногенеза 100-105
Изменение удельной активности HAjf киназы в клетках N.crassa , помещенных в стрессовые условия .... 105-108
К вопросу о кальмодулин-зависимой регулящш НАД!"киназы N.crassa I0B-II2
ГЛАВА УІ. МНОЖЕСТВЕННЫЕ ФОРШ НАД+КИНАЗЫ N. CRASSA II3-I28
6.1. Обнаружение множественных форм ЕАД^киназы у и.
crassa . ........ . II3-II7
Множественные формы НАД^киназы как маркеры диффе-ренцировки у N.crassa '. II7-I23
Изменение активности множественных форм HAjf киназы при фотостимуляции конидиогенеза N.crassa ..... 123-128
ЗАКЛЮЧЕНИЕ . . . * 129-134
ВЫВОДЫ 135-136
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 138-169
Список принятых сокращений:
АМФ - аденозин-5»-монофосфат
АДФ - аденозин-5*-дифосфат
АТФ - аденозин-5»-трифосфат
АДФР - аденозиндифосфатрибоза
ДДТ - дихлордифенилтрихлорэтан
ДХФИФ - дихлорфенолиндофенол
НАД+ - никотинамидадениндинуклеотид
НАДН - восстановленная форма никотинамидадениндинуклеотида
НАДФ+ - шкотинамидадениндинуклеотидфосфат
НАДФН - восстановленная форма никотиншлидадениндинуклеотид-
фосфата
НМН - никотинамидмононуклеотид
НУК - нафтилуксусная кислота
ПХМБ - парахлормеркурибензоат
ФГА - фоофоглицериновый альдегид
ФШ - флавинмононуклеотид
ШС - феназинметосульфат
цАМФ - циклический аденозин-3',5'-монофосфат
*
ЭГТА - этиленгликоль бис/2-аминоэтиловый эфирА^-ЙЕГ-тетра-
ацетат
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат
ж - ЭМ -її -этилмалеимид
Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение молекулярных механизмов, лежащих в основе реализации программ индивидуального развития, является одним из актуальных вопросов современной биохимии. Проблема внутриклеточной координации различных метаболических путей, ведущих к дифференцировке, занимает сегодня одно из центральных мест наряду с такими широко разрабатываемыми аспектами клеточной дифференцировки как рецепция сигналов и их дальнейшее преобразование, селективные перестройки генетического материала, дифференциальная экспрессия генов и последовательность включения программ генной экспрессии faover ,1982).
Одним из ключевых ферментов, координирующих различные пути метаболизма, в том числе соотношение анаболических и катабо-лических путей обмена в клетке, является НАД^киназа. Реакция, катализируемая этим ферментом, служит единственным источником синтеза НАДф" в клетке. С деятельностью НАД^киназы связаны две важнейшие системы клетки - система никотинамидных коферментов и адениловая система. В литературе есть указания о том, что данный фермент занимает важное место в регуляции индивидуального развития животных, особенно на его ранних, пусковых этапах, однако они основаны на измерении активности НАД^киназы лишь на ограниченных отрезках онтогенеза.
Перспективным объектом для изучения процессов клеточной дифффенцировки на протяжении всего жизненного цикла являются микроорганизмы. Удобной моделью такого рода может служить бесполый ЖИЗНеННЫЙ ЦИКЛ ГрибОВ-аСКОМИЦИТОВ (Turian ,1975; Dahl-
berg,van Etten ,1982). В нем выделяют три стадии: прорастание конидий, вегетативный рост мицелия и конидиогенез. Преимущества данной модели дифференцировки хорошо представлены в цикле развития Neurospora crassa : отдельные фазы развития легко
различимы морфологически и их смена регулируется определенными факторами внешней среды (рис.1). Так, перенос конидий на ростовую среду инициирует их прорастание, истощение питательных веществ в среде служит сигналом для перехода от логарифмической фазы роста вегетативного мицелия к стационарной, а свет стимулирует КОНИДИОГенеЗ В МИЦеЛИИ (Siegel et ai.,1968).
Установлено, что в критические моменты дифференцировки гриба N.erassa происходит изменение относительного содержания НАДТ и НАДФ* в клетках этого организма (Крицкий и др. ,1977 б;
Schmit et al. ,I975;Schmit ,Brody ,1976; Schmit ,1981). В
связи с этим изучение поведения НАДТкйназы в процессе клеточной дифференцировки N.crassa представляет особый интерес.
Важным достоинством выбранного организма является то обстоятельство, что в опытах мог быть использован мутантний штамм E.crassa с полностью блокированным синтезом НАД(Ф)^гликогидро-лазы. Присутствие этого фермента в объекте сильно затрудняет изучение свойств НАДТкйназы.
Выбор гриба N.crassa в качестве объекта исследования был обусловлен также и тем, что в настоящее время в связи с решением проблемы биотехнологического производства НАДФ"!" ведется активный поиск организмов, обладающих высоким уровнем активности НАДТкйназы, а также оптимальных условий для проявления активности этого фермента. Среди изученных до сих пор объектов наибольшая активность НАДТкйназы обнарукена в клетках микроорганизмов. В то же время мицелиальные грибы в этом направлении вообще не были исследованы.
В связи с изучением регуляции активности НАДТкйназы в развитии приобретает особое значение вопрос о молекулярной организации этого фермента на различных этапах онтогенеза. Молекулярная организация и механизмы регуляции активности НАДТкйназы
атация
ь, If
POGTOBM
Макроконидии
Конидиогенез JV^
СВЕТ
!?_ "I ' .
Мицелий & стационарной Фазе
роста
Формирование ууЬки прорастай
ПИТАТЕЛЬНЫХ' ВЕЩЕСТВ
» і* 0 « , ». «і» ,
Мицелий & экспоненциальной (разе
роста
Рис. 1 Бесполый жизненный цикл Иеигозроґа. сґама.
9 сравнительно мало исследованы. В последнее время проводится изучение этого фермента из животных объектов в связи с обнаружением в них равновесной системы диссоциирующих олигомеров фермента (Инсарова,Телепнева,1977; Нгуен Ван Тхиет,Телепнева,1981; Buiygina , Teiepneva,I982), а также из растений в связи с разработкой подходов к раскрытию механизма участия света, кальмодули-
На И НАД^КИНаЗЫ В регуЛЯЦИИ метаболизма У ЭТИХ ОргаНИЗМОВ (Marine,Dieter ,1981;Cormier et al. ,1982; Muto ,1983). НАД^киназа микроорганизмов гораздо менее изучена, но ее физико-химические свойства, а также особенности структуры обнаруживают резкие различия по сравнению с НАД^киназами, выделенными из других источников.
Для некоторых растений и животных получены данные в пользу существования множественных форм НАД^киназы. У микроорганизмов установлен лишь один факт подобного рода для цитоплазматической
И МИТОХОНДриальнОЙ форм фермента Saccharomyces cerevisiae (Apps ,1970). Однако в литературе совершенно отсутствуют сведения о значении выявленной молекулярной гетерогенности НАД*кина-зы. Поэтому вопрос о возможности присутствия множественных молекулярных форм НАД*киназы в клетках n,сгassа и их роли в диффе-ренцировке гриба представляется исключительно важным.
Цель и задачи работы. Целью данной работы является изучение свойств и механизмов регуляции активности НАД^киназы в ходе онтогенеза N.crassa , а также их сопоставление с таковыми у этого фермента из других объектов. Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:
получение очищенного препарата фермента из Ecrassa характеристика его основных кинетических свойств;
исследование свойств НАД*киназы Kcrassa » & именно: ее внутриклеточной локализации, оптшлума рН и стабильности при раз-
личных рН, зависимости активности от природы фосфорильного донора, присутствия ионов металлов, сульфгидрильных реагентов и солей, а также особенностей структуры, выявляемых при изучении поведения фермента при хроматографии на голубой сефарозе;
выявление множественных форм НАД+киназы N.crassa и динамика их поведения в онтогенезе гриба;
изучение участия НАД*киназы в регуляции метаболизма и онтогенеза N.crassa, в частности:- рассмотрение динамики удельной активности НАД+киназы N.crassa при фотостимуляции конидиогенеза и фотоиндукции каротиногенеза, выявление уровня удельной активности фермента в клетках N.crassa, помещенных в стрессовые условия, выяснение вопроса о кальмодулин-зависимои регуляции данного фермента.
Научная новизна работы. Впервые изучена динамика изменений удельной активности НАД+киназы на протяжении всего жизненного цикла на примере мицелиального гриба N.crassa. Обнаружено присутствие множественных форм НАД+киназы в клетках этого организма. Выяснено, что определеннне молекулярные формы фермента можно рассматривать в качестве маркеров для разных стадий морфогенеза гриба. Выявлена возможность существования двух принципиально различных механизмов регуляции активности НАД+киназы светом: при фотоиндукции каротиногенеза в погруженной культуре и при фотостимуляции конидиогенеза в поверхностной культуре N.crassa . На основании полученных результатов высказано предположение об участий данного фермента в регуляции процессов онтогенеза и адаптации клеток гриба за счет коррекции соотношения катаболических и анаболических путей метаболизма.
Практическая ценность работы. Полученные в работе экспериментальные данные расширяют представления как о свойствах и механизмах регуляции активности НАД+киназы - одного из ключевых
ферментов метаболизма клетки, так и о биохимических превращениях, лежащих в основе клеточной дифференцировки. Учитывая сравнительно высокую удельную активность НДҐкиназн и. отсутствие НАДУЩ/+гликогидролазы у изученного штамма N.crassa, можно рассматривать подобные штаммы грибов как потенциальные продуценты НАДФ+. Выявлен ряд факторов, которые активируют НАД+киназу и дополнительно стимулируют образование НАДФ+,. что может представлять интерес для оптимизации микробиологических методов производства
