Содержание к диссертации
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
I. Расщепление белков под действием протеолитических ферментов в различных отделах желудочно-кишечного тракта 10
I.I. функционирование ферлентных систем, гидролизующих белки в начальных отделах желудочно-кишечного тракта 10
1.2. Участие протеолитических ферментов в гидролизе белков в тонком кишечнике 16
1.3. Роль микрофлоры толстого кишечника в разложении компонентов пищеварительных секретов. 23
2. Структура пищеварительио-транспортных процессов в тонкой кишке 25
2.1. Зона флокулярных гелевых структур 26 П. 2.2. Слой пристеночных слизистых наложений 32
2.3. Зона мембранного пищеварения 36
3. Протеолиз пищевых белковых антигенов в желудочно-кишечном тракте экспериментальных животных и человека. 38
4. Заключение к литературному обзору 43
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 45
I.I. Экспериментальные животные 45
1.2. Получение флокулярных гелевых структур 45
1.3. ипределение рН-зависимости активности трипсина и химотрипсина Е дуоденальном содержимом и его растворенных шлокулярных гелевых структурах 47
1.4. Получение препарата пристеночных слизистых наложений 47
2. Методы определения активности ферментоЕ 48 Ш. I.I. определение активности трипсина 48
2.2. определение активности химотрипсина. 48 Ш. 2.3. определение активности лейцинамино- пептидазы .49
2.4. определение активности катепсина D 50
2.5. определение активности катепсина В 51
3. Исследование распределения трипсина Б системах ін v'tiro , моделирующих гетерофазное полостное пищеварение 51
3.1. Получение пищевого субстрата (денатурированный яичный белок) 51
3.2. ипределение сорбции трипсина на пищевом субстрате ^яичный белок) при разных рН. 3.3. Исследование распределения трипсина Е системе: флокулярные гелевые структуры -
шдкая фаза 52
3.4. Исследование распределения трипсина в системе: агломерат пищевого субстрата с флоку-лярными гелевыми структурами-шщшя фаза. 53 Ш. 3.5.ипределение десорбции трипсина из флокул геля и структур агломерата: флокулы геля пищевой субстрат 53
3.6. Определение десорбции трипсина с поверхности пищевого субстрата 54
3.7. Исследование перераспределения трипсина между агломератом: флокулярные ГЄЛЄЕНЄ структуры-пищевой белок и жидкой фракцией при смене рН среды 54
4. Иммунохимические методы исследования 55
4.1. Получение иммуносорбентоЕ 55
4.2. Получение гипериммунной сыворотки к бычьему сывороточному альбумину ч БСА) 55
4.3. Еыделение моноспецифических к бычьему сывороточному альбумину антител 56
5. Получение бычьего сывороточного альбумина, меточенного изотопом I 56
6. Количественное определение степени расщепления бычьего сывороточного альбумина при воздействии на него ферментов полостного гетерофазного пищеварения
в опытах 57
7. Статистическая обработка полученных результа
тов 58
ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ 59
I. Сравнительная характеристика флокулярных геле-вых структур и жидкой фракции содержимого двенадцатиперстной кишки, взятого натощак, в зависимости от рН закислення 59
2.Влияние замораживания на ферментативную активность трипсина и химотрипсина в образцах дуоденально го содержимого, взятого натощак 59
3. Влияние лиофильного высушивания на активность трипсина и химотрипсина в образцах дуоденального со держимого и его флокулярных структурах
4. рН-зависимость активности трипсина и химотрипсина в дуоденальном содержимом и его растворенных флокулярных структурах 65
. 5. Влияние адсорбции трипсина на флокулах геля на его активность 65
6. Распределение панкреатического трипсина между компонентами агломерата ПИЩЄЕНХ частиц с флокулами геля и жидкой фракцией энтеральной среды 68
7. Исследование активности протеолитических ферментов в слое слизистых наложений 78
ІУ. 8. иценка эффективности протеолиза пищевого белкового антигена при воздействии на него ферлентов полостного гетерофазного пищеварения 81
РЕЗУЛЬТАТЫ 85
ВЫВОДЫ 100
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ІСВ
- Расщепление белков под действием протеолитических ферментов в различных отделах желудочно-кишечного тракта
- Экспериментальные животные
- Сравнительная характеристика флокулярных геле-вых структур и жидкой фракции содержимого двенадцатиперстной кишки, взятого натощак, в зависимости от рН закислення
Расщепление белков под действием протеолитических ферментов в различных отделах желудочно-кишечного тракта
Как известно, эффективность протеолиза белков в желудочно-кишечном тракте зависит от интегративного воздействия на них протеолитических ферментов, функционирующих на протяжении всего желудочно-кишечного тракта. Так, уже в секретах слюнных желез, в особенности подчелюстной, обнаруживаются трипсиноподобные ферменты: саливаин, гландулаин и калликреиподобная пептидаза (44). Содержание их невелико, но они активны в широком диапазоне рН (23). Указанные протеази начинают оказывать свое действие еще в ротовой полости и продолжают функционировать некоторое время в желудке до той поры, пока кислый желудочный сок не инактивирует их (32). Однако саливаин, проявляющий максимальную активность при рН 9,2 - 9,3, способен принимать участие в процессах протеолиза белков и в тонком кишечнике, что говорит об его устойчивости к действию желудочного сока (45). Такая предварительная обработка белков пищи секретом слюнных желез, по мнению Кадирова Ш.К., повышает их последующий гидролиз в желудке и тонком кишечнике. Б опытах \п vitro им продемонстрировано, что предварительная инкубация со слюной различных белков повышает их дальнейший гидролиз пепсином и особенно трипсином на 10$ и 26-37$ соответственно, в зависимости от пищевого субстрата ( 27, 31). Очевидно, этот факт может иглеть определенное значение для случаев, когда слюна в желудке длительное время остается функционально активной ( сниженная функция желудка, нейтрализация кислоты желудочного содержимого и тому подобные состояния).
Б желудке пища депонируется и подвергается воздействию кислых протеаз и соляной кислоты желудочного сока. При этом кислота не только создает оптимальные условия для функционирования желудочных ферментов, но и способствует денатурации белков, облегчая их последующую пищеварительную обработку. Однако решающая роль в начальных этапах гидролиза белков безусловно принадлежит кислым желудочным протеазам: пепсину, гастриксину, парапепсинам и реннину. Благодаря наличию указанных ферментов желудочный сок обладает высокой протеолитической активностью в широком диапазоне рН с наличием двух его оптимумов действия ( при рН 1,5 - 2,0 и рН 3,2 - 3,5).
Первый оптимум действия сока обусловлен присутствием в нем пепсина. Надо сказать, что под названием пепсина в настоящее время подразумевают не один фермент, а целую группу протеаз, обладающих протеолитической активностью при кислых значениях рН. Так, Free/nan обнаружил с помощью электрофореза в слизистой желудка 7 изоферментных форм пепсиногена, что соответствует 7 формам активного пепсина (III, 145). Собственно пепсином, или пепсином А, называют очищенный продукт, полученный из слизистой оболочки свиньи. По воздействию на белковые субстраты пепсин относится к эндопептидазам. Этот фермент гидро-лизует особенно хорошо те связи, которые образованы остатками ароматических аминокислот: тирозина и фенилаланина, а также лейцина, хотя, в целом, не обладает такой строгой субстратной специфичностью, как трипсин и химотрипсин (24). Предшественником пепсина является пепсиноген, образующийся в главных клет - 12 -ках желез желудка и способный активироваться при рН ниже 5,4 после последовательного отщепления от молекулы нескольких полипептидов. Один из таких компонентов играет роль ингибитора пепсина.
Б желудке животных и человека, согласно литературным данным, содержится несколько протеолитичеоких ферментов, отличающихся по своим свойствам от обычного пепсина ( 128, 146). Эти минорные протеолитические ферменты получили название парапеп-синов или пепсинов Б,С и D . Главное отличие их от пепсина А в tf-концевых аминокислотных остатках и в содержании фосфора. Бее три минорных пепсина присутствуют в содержимом желудка свиней, и каждому из них соответствует своя форма пепсиногена.
Экспериментальные животные
Исследования проводили на беспородных здоровых собаках, имеющих фистулу, вживленную в двенадцатиперстную кишку, непосредственно перед связкой Трейтца. Через другую фистулу, вживленную в желудок, перед началом проведения опыта осуществляли контроль за функциональным состоянием желудочных желез. Дополнительным сигналом готовности животных к опыту служили данные об исходном рН дуоденального содержимого: так дальнейшие эксперименты проводили только с дуоденальным содержимым, имеющим рН выше 6,5. Всего в опытах было использовано более 20 собак.
Получение флокулярных гелевых структур
У собак, в течение 18 часов не получавших пищи, через фистулу отбирали пробы дуоденального содержимого. Содержимое двенадцатиперстной кишки освобождали от механических примесей центрифугированием в течение 30 мин при 3000 об/мин. Полученный супернатант подкисляли 0,1 н соляной кислотой до рН 3,5 -4,5 для образования гелевых структур дуоденального содержимого. Последние отделяли от жидкой фазы центрифугированием в течение 15 мин. при 3000 об/мин \.см. схему на стр. 46 ). В специальной серии опытов проверяли влияние замораживания и лиофильного высушивания на трипсиновую и химотрипсиновуга активности содержимого двенадцатиперстной кишки.
Сравнительная характеристика флокулярных геле-вых структур и жидкой фракции содержимого двенадцатиперстной кишки, взятого натощак, в зависимости от рН закислення
Как видно из таблицы J6 I, масса образующихся флокулярных структур увеличивается с понижением рН от 4,5 до 3,5 почти в 2,5 раза. Б то же время даже при рН 3,5 она составляет менее двух процентов от общей массы системы.
Бо флокулах геля обнаруживается трипсиновая и химотрипси-новая активности, которые также существенно нарастают с понижением рН закислення ( см табл. J& 2). Поэтому, как видно из табл. ,№ 3, удельная активность трипсина во флокулах превышает таковую в дуоденальном содержимом в 15-40 раз ( в зависимости от рН закислення) и удельную активность в жидкой фазе в 25-500 раз. Удельная активность химотрипсина в гелевых структурах выше в 50-500 раз, чем в жидкой фракции.
