Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы
1.1 Патогенетические механизмы развития распространенного перитонита .
1.2 Принципы фармакологической коррекции распространенного перитонита .
1.3 Теоретические предпосылки использования антиоксидантов при экспериментальном гнойном перитоните
1.3.1 Принципы фармакологической коррекции распространенного перитонита препаратом Мексикор
1.3.2 Принципы фармакологической коррекции распространенного перитонита дигидрокверцетином .
1.4 Теоретические предпосылки использования иммуномодуляторов при экспериментальном гнойном перитоните
Глава 2 Материалы и методы исследования
2.1 Объект исследований .
2.2 Обоснование доз исследуемых препаратов
2.3 Измерение микроциркуляторных показателей .
2.4 Определение биохимических и иммунологических показателей в сыворотке крови крыс .
2.5 Морфологические исследования
2.6 Статистическая обработка результатов исследований .
Глава 3 Результаты собственных исследований
3.1 Исследование флоуметрических, биохимических, иммунологических и морфологических изменений при моделировании распространенного перитонита у крыс
3.2 Исследование флоуметрических, биохимических, иммунологических и морфологических изменений при моделировании распространенного перитонита у крыс, получавших дигидрокверцетин
3.3 Исследование флоуметрических, биохимических, иммунологических и морфологических изменений при моделировании распространенного перитонита у крыс, получавших препарат Мексикор
3.4 Исследование флоуметрических, биохимических, иммунологических и морфологических изменений при моделировании распространенного перитонита у крыс, получавших препарат Галавит
3.5 Исследование флоуметрических, биохимических, иммунологических и морфологических изменений при моделировании распространенного перитонита у крыс, получавших комбинацию дигидрокверцетина и препарата Галавит .
3.6 Исследование флоуметрических, биохимических, иммунологических и морфологических изменений при моделировании распространенного перитонита у крыс, получавших комбинацию препаратов Мексикор и Галавит
Заключение
Выводы
Практические предложения
Список литературы
- Принципы фармакологической коррекции распространенного перитонита
- Принципы фармакологической коррекции распространенного перитонита дигидрокверцетином
- Определение биохимических и иммунологических показателей в сыворотке крови крыс
- Исследование флоуметрических, биохимических, иммунологических и морфологических изменений при моделировании распространенного перитонита у крыс, получавших дигидрокверцетин
Введение к работе
Актуальность исследования. Согласно современным исследованиям тяжелый распространенный перитонит сопровождается развитием системной воспалительной реакции, а также активацией целого ряда факторов, влияющих на характер течения и исход заболевания, важное значение среди которых имеют активация процессов свободнорадикального окисления, нарушение синтеза оксида азота, выброс значительного количества медиаторов воспаления, повреждение сосудистого эндотелия, нарушения микроциркуляции (Савельев В.С., Петухов В.А., 2012; Ермола Ю.А., Кубышкин А.В., 2012; Ашрафов Р.А., Лычкова А.Э., 2012; Блинков Ю.Ю., 2012; Суковатых Б.С. и др., 2011; Фролова О.Г, 2011). Возникающий дисбаланс усиливает деструктивные процессы в паренхиматозных органах и, как следствие, приводит к прогрессированию полиорганной недостаточности.
Выполненные на сегодняшний день клинические исследования не позволяют сделать однозначные выводы о целесообразности применения в комплексной терапии распространенного перитонита только лекарственных средств с антиоксидантным действием. Последние десятилетия ведутся поиски природных веществ, связывающих активные формы кислорода. Перспективным представителем данного направления является дигидрокверцетин (3,5,7,3',4'-пента-гидроксифлаванон), антиоксидант из лиственницы, антиоксидантная активность которого превосходит антиоксидантный эффект кверцетина, рутина и бета-каротина (Потапович А.И., Костюк В.А., 2003; Кравченко Л.В. и др., 2005; Бабкин В.Н., 2011). Прямая антирадикальная активность ДГК осуществляется преимущественно за счет взаимодействия с липидными радикалами или супероксидными анионами. В результате многоплановых исследований с использованием различных модельных систем установлено, что ДГК ингибирует свободнорадикальное окисление как водорастворимых (люминол), так и жирорастворимых субстратов (липиды липосомальных и микросомальных мембран). При этом, ДГК может действовать как ловушка активных форм кислорода, хелатор металлов с переменной валентностью или обрывающий цепь агент (Щукина О.Г. и др., 2008; Бабкин В.А., 2011; Deng W., Fang X., Wu J., 1997).
В настоящее время опубликованы работы, свидетельствующие о том, что на всех стадиях перитонит протекает на фоне иммунодефицита, а в терминальной стадии (полиорганной недостаточности) этот дефицит наиболее выражен, возможность выведения из которого в значительной степени определяет успех их лечения (Станулис А. И., Гришина Т.И. и др. 2002; Сухоруков А.Л., 2005; Алешин Д.А., 2009). Учитывая это, одной из важных задач экспериментальных исследований является изучение комбинированного применения дигидрокверцетина и отечественного синтетического иммуномодулятора Галавита. Галавит является 5-амино-1,2,3,4-тетрагидрофталазин-1,4-диона натриевой солью, которая известна в качестве противовоспалительного и иммуномодулирующего препарата (Добрица В.П., Ботерашвили Н.М. и др., 2001; Донцов В.И., Подколзин А.А., 2001; Коробкова Л.И., Вельшер Л.З. и др., 2004).
Таким образом, наиболее актуальным в настоящее время является внедрение эффективных и патогенетически обоснованных методов антиоксидантной терапии и иммунокоррекции при распространенном перитоните. В этой связи определенный интерес может представлять изучение возможности коррекции системной воспалительной реакции при перитоните путем применения антиоксиданта из лиственницы – дигидрокверцетина и иммуномодулятора Галавита в качестве дополнения к стандартной терапии при распространенном перитоните.
Цель исследования. Изучение антиоксидантного и иммунобиологи-ческого статуса у животных при распространенном перитоните на фоне применения природного антиоксиданта дигидрокверцетина.
Задачи исследования.
1. Оценить изменение параметров оксидантно-антиоксидантного статуса, уровня провоспалительных цитокинов и конечных стабильных метаболитов оксида азота на фоне введения природного антиоксиданта дигидрокверцетина, антиоксидантного препарата Мексикор, иммуномодулятора Галавит и комбинаций дигидрокверцетина с Галавитом, Мексикора с Галавитом при моделировании распространенного перитонита.
2. Дать оценку иммунобиологического статуса при моделировании распространенного перитонита у крыс на фоне применения природного антиоксиданта дигидрокверцетина, антиоксидантного препарата Мексикор, иммуномодулятора Галавит и комбинаций дигидрокверцетина с Галавитом, Мексикора с Галавитом.
3. Изучить эффективность применения природного антиоксиданта дигидрокверцетина, антиоксидантного препарата Мексикор, иммуномодулятора Галавит и комбинаций дигидрокверцетина с Галавитом, Мексикора с Галавитом при микроциркуляторных нарушениях в стенке тонкой кишки крыс, вызванных моделированием распространенного перитонита.
4. Изучить органопротективную активность природного антиоксиданта дигидрокверцетина, антиоксидантного препарата Мексикор, иммуномодулятора Галавит и комбинаций дигидрокверцетина с Галавитом, Мексикора с Галавитом по результатам морфологических исследований при моделировании распространенного перитонита.
5. Оценить влияние природного антиоксиданта дигидрокверцетина, антиоксидантного препарата Мексикор, иммуномодулятора Галавит и комбинаций дигидрокверцетина с Галавитом, Мексикора с Галавитом на показатель общей летальности крыс при моделировании распространенного перитонита.
Научная новизна. На основании комплексных исследований впервые изучен антиоксидантный и иммунобиологический статус при моделировании распространенного перитонита у крыс на фоне применения природного антиоксиданта дигидрокверцетина, антиоксидантного препарата Мексикор, иммуномодулятора Галавит и комбинаций дигидрокверцетина с Галавитом, Мексикора с Галавитом.
Впервые экспериментально обосновано применение природного антиоксиданта дигидрокверцетина 7,7 мг/кг в качестве дополнения к стандартной терапии распространенного перитонита. Монотерапия дигидрокверцетином способствовала эффективному повышению уровня регионарного кровотока в стенке тонкой кишки крыс, нормализации биохимических маркеров свободнорадикального окисления, снижению провоспалительных цитокинов, повышению антиоксидантной системы защиты и иммунобиологического статуса, а также восстановлению NO-продуцирующей функции эндотелия. В ходе проведенного исследования выявлена органопротективная активность дигидрокверцетина 7,7 мг/кг в сторону регресса гистоморфологических изменений изучаемых внутренних органов и признаки стимуляции лимфоидной ткани в кишечнике и селезенке.
В работе впервые предложен эффективный способ комбинированного лечения экспериментального распространенного перитонита с использованием природного антиоксиданта дигидрокверцетина 7,7 мг/кг с иммуномодулятором Галавит 8,6 мг/кг и антиоксидантного препарата Мексикор 60 мг/кг с иммуномодулятором Галавит 8,6 мг/кг. Изучение оксидантно-антиоксидантного, иммунобиологического и цитокинового статуса,
NО-продуцирующей функции эндотелия, а также уровня микроциркуляции в стенке тонкой кишки и морфологических изменений внутренних органов крыс обнаружили выраженный сопоставимый фармакологический эффект исследуемых комбинаций. Применение комбинаций способствовало более раннему восстановлению нарушенных биохимических показателей и микроциркуляции до уровня интактных животных по сравнению с монотерапией дигидрокверцетином 7,7 мг/кг.
Эффективность проводимой терапии была подтверждена результатом оценки уровня общей летальности экспериментальных животных. Впервые отмечено снижение общей летальности с 62% в группе с распространенным перитонитом до 26% на фоне введения комбинации дигидрокверцетин 7,7 мг/кг + Галавит 8,6 мг/кг; до 32 % на фоне введения дигидрокверцетина 7,7 мг/кг и до 34% на фоне введения комбинации Мексикор 60 мг/кг + Галавит 8,6 мг/кг.
Теоретическая и практическая значимость. В работе обоснована эффективность фармакологической коррекции распространенного перитонита природным антиоксидантом дигидрокверцетином, антиоксидантным препаратом Мексикор, а также комбинациями дигидрокверцетина с иммуномодулятором Галавит и препарата Мексикор с иммуномодулятором Галавит. При этом преимущество дигидрокверцетина перед препаратом Мексикор выявлялось как при монотерапии, так и в комбинации с иммуномодулятором Галавит.
По результатам исследования нами получено, что наибольшему снижению процента общей летальности крыс сопутствовала более эффективная коррекция оксидантно-антиоксидантного, иммунобиологического и цитокинового статуса, NO-продуцирующей функции эндотелия, восстановление микроциркуляторных нарушений в стенке тонкой кишки и морфологических изменений, развившихся на фоне моделирования распространенного перитонита.
С практической точки зрения результаты настоящего исследования свидетельствуют о том, что из числа испытанных препаратов предпочтение следует отдавать тем препаратам и комбинациям, которые оказали существенное влияние на снижение общей летальности крыс в ходе выполненного эксперимента.
Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные доклинические и клинические испытания природного антиоксиданта дигидрокверцетина, а также комбинаций дигидрокверцетина с иммуномодулятором Галавит и антиоксидантного препарата Мексикор с иммуномодулятором Галавит в качестве дополнительной терапии к общепринятым хирургическим и фармакологическим методам лечения распространенного перитонита.
Внедрение результатов научных исследований. Материалы диссертационного исследования, касающиеся обоснования эффективности фармакологической коррекции природным антиоксидантом дигидрокверцетином оксидантно-антиоксидантного статуса, уровня провоспалительных цитокинов и NO-продуцирующей функции эндотелия включены в состав документов, поданных на регистрацию в ФБУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора. Получено свидетельство о государственной регистрации на биологически активную добавку к пище, содержащую 257,0±25,0 мг/мл дигидрокверцетина в глицерине № RU.77.99.11.003.Е.003227.04.13 от 24.04.2013 г.
Результаты работы используются в лекционных курсах кафедры терапии и акушерства ФГБОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова», в лекционных курсах кафедры фармакологии, клинической фармакологии и при выполнении экспериментальных исследований в НИИ экологической медицины ГБОУ ВПО КГМУ.
Положения, выносимые на защиту.
1. Дигидрокверцетин 7,7 мг/кг/сут, препараты Мексикор 60 мг/кг/сут и Галавит 8,6 мг/кг/сут оказывают корригирующее действие на показатели оксидантно-антиоксидантного статуса, провоспалительных цитокинов и NO-продуцирующую функцию эндотелия на фоне моделирования распространенного перитонита, наиболее выраженный протективный эффект получен при комбинированном введении дигидрокверцетина с Галавитом и препарата Мексикор с Галавитом.
2. Применение комбинаций дигидрокверцетина 7,7 мг/кг + Галавит 8,6 мг/кг и Мексикор 60 мг/кг + Галавит 8,6 мг/кг, а также монотерапия препаратом Галавит и монотерапия дигидрокверцетином оказывает стимулирующее влияние на гуморальное звено иммунной системы крыс при моделировании распространенного перитонита.
3. Дигидрокверцетин 7,7 мг/кг/сут, препараты Мексикор 60 мг/кг/сут и Галавит 8,6 мг/кг/сут оказывают протективное действие на коррекцию морфологических изменений, а также повышают уровень регионарного кровотока в стенке тонкой кишки относительно контрольной группы животных с моделированием распространенного перитонита, при этом, дигидрокверцетин проявлял более выраженный эффект, сопоставимый с комбинированным введением дигидрокверцетина с Галавитом и препарата Мексикор с Галавитом.
4. Оценка общей летальности экспериментальных животных при моделировании распространенного перитонита представляет эффективность фармакологического действия исследуемых антиоксидантов и иммуномодулятора, а также их комбинаций в следующей последовательности:
ДГК+Галавит > ДГК > Мексикор+Галавит > Мексикор > Галавит.
5. Дигидрокверцетин 7,7 мг/кг/сут проявляет более выраженную эффективность при лечении распространенного перитонита по сравнению с препаратом Мексикор 60 мг/кг/сут при оценке оксидантно-антиоксидантного, иммунобиологического и цитокинового статуса, NO-продуцирующей функции эндотелия, микроциркуляции в стенке тонкой кишки крыс, морфологических изменений и общей летальности экспериментальных животных.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены на 3 научных конференциях:
– Международной научно-производственной конференции «Проблемы и перспективы инновационного развития животноводства» (15-16 мая 2013 г.) – Белгород, 2013;
– Международной научно-практической конференции «Научният потенциал на света» (17-25 сентября 2013 г.) – София, 2013;
– Международной научно-практической конференции «Научное обеспечение агропромышленного производства» (29-31 января 2014 г.) – Курск, 2014.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных статей, в том числе 3 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов экспериментальных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка используемой литературы, включающего 215 источников, из них 184 отечественных и 31 зарубежного автора. Диссертация изложена на
159 страницах машинописного текста, содержит 25 таблиц и 46 рисунков.
Принципы фармакологической коррекции распространенного перитонита
Анализ литературы показывает, что положительный результат лечения больного с распространенным перитонитом на 80% зависит от оптимальной хирургической тактики, в первую очередь от адекватной санации брюшной полости, и лишь на 20% — от антибактериальной и интенсивной терапии [5].
В настоящее время успех лечения распространенного перитонита определяют три основных постулата: 1) оптимальная хирургическая тактика; 2) рациональная антибактериальная терапия; 3) адекватная интенсивная терапия [175].
Основными задачами оперативного вмешательства являются: 1) устранение источника перитонита; 2) интраоперационная санация; 3) декомпрессия паретичного кишечника; 4) создание условий для пролонгированной санации брюшной полости в послеоперационном периоде [173].
У хирургов на сегодняшний день не вызывает разногласий вопрос о выборе наименее травматичного и технически легко выполнимого способа, который будет надежно ликвидировать источник перитонита [142].
Статистика летальности не имеет тенденции к снижению, несмотря на современные достижения в анестезиологии и хирургии [148, 187]. Также высокое количество послеоперационных осложнений, включая такие, как послеоперационные вентральные грыжи, спаечная болезнь. Проблема перитонита усугубляется неуклонным ростом антибиотикорезистентности возбудителей [28, 63], да и обычные сроки антибиотикотерапии составляют от 5 до 10 дней. Более длительная антибактериальная терапия нежелательна из-за развития возможных осложнений лечения риска селекции резистентных штаммов и развития суперинфекции [10, 64].
Синдром кишечной недостаточности есть основная часть патогенеза абдоминального сепсиса при распространенном перитоните, который подразумевает острые нарушения двигательной, секреторной, всасывательной и барьерной функций кишечника [115, 179]. Синдром кишечной недостаточности, возникший ещё на дооперационном этапе оказания помощи, приобретает самостоятельное значение. Он отягощает течение основного заболевания и в значительной степени снижает эффективность хирургической составляющей в лечебной программе больных распространенным перитонитом [32].
Главным звеном патогенеза абдоминального сепсиса при распространенном перитоните является синдром кишечной недостаточности, который возникает при гипоксии как общего, так и регионального характера, и сопровождается реперфузионным синдромом.
Можно сделать вывод, что основную роль в лечении комплексного перитонита должно отводиться целенаправленной коррекции синдрома кишечной недостаточности, которую можно разделить на: 1.Поддержание нормального биоценоза кишечника; 2. Коррекция нарушений функции кишечника. Учитывая все вышесказанное, одно из основных мест в комплексном лечении перитонита будет приходиться на целенаправленную коррекцию синдрома кишечной недостаточности, которая представляет собой стабилизацию естественного биоценоза кишечника и исправление нарушений работы кишечника, а также нормализацию транспорта кислорода с изменением метаболического дистресс-синдрома, микроциркуляторных и гипоксических нарушений (использование антигипоксантов, облегчающих или невелирующих гипоксические нарушения при помощи стабилизации и увеличения энергопродукции в комплексе окислительного фосфорилирования; нефармакологическая коррекция гипоксических состояний) [173].
Стабилизация естественного биоценоза кишечника включает селективную контаминацию и оптимизированную схему антибиотикотерапии [66, 79, 172, 185, 191, 214].
Сокращение функциональных нарушений пищеварительного канала имеет место быть при внутрипросветной энтеральной оксигенации перфтораном [180, 204]. Используют при помощи назоинтестинального зонда лаваж тонкой кишки озонированным физиологическим раствором. Часто применяются интестинальные лекарственные смеси (сочетание пектинов, реополиглюкина, энтеросорбента, иммуномодулятора) исходя из стадии перитонита [37, 108].
Последним временем в комплекс интенсивной терапии синдрома кишечной недостаточности при перитонитах входят эссенциальные нутриенты, выполняющие роль не тоько питательных субстратов, но и фармакологических агентов, динамично стимулирующих органные метаболические процессы непосредственно в кишечнике [176].
Коррекция гипоксических и микроциркуляторных изменений при распространенном перитоните осуществляется при помощи фармакологических и нефармакологических методов. Нефармакологическая коррекция объединяет весь комплекс методов экстракорпоральной детоксикации, ультрафиолетовое и лазерное облучение крови, методы непрямого электрохимического окисления крови [173]. Несмотря на хорошую результативность, вышеперечисленные методы из-за выраженных водно-электролитных нарушений, нестабильности гемодинамики у больных с распространенным перитонитом, развивающейся гипопротеинемии имеют узкую возможность применения [49, 149, 164, 166, 184]. Состояние высокого белкового катаболизма, присутствие анемии при синдроме эндогенной интоксикации в ряде случаев представляет собой противопоказание для методов непрямого электрохимического окисления крови [166, 173].
В результате многочисленных исследований получены убедительные данные о необходимости включения антиоксидантной и иммунотерапии в состав интенсивной терапии перитонита и сепсиса [158]. В настоящее время существует большое количество исследований, публикаций и рекомендаций, посвященных иммунотерапии и иммуномодуляции [144]. Область применения наибольшего количества иммуномодуляторов ближе к амбулаторной практике, которые улучшают реабилитационные процессы. Пациенты с острым перитонитом в составе интенсивной терапии и без того получают весомое количество препаратов для поддержания жизненно важных функций организма [150]. Поэтому применение каждого дополнительного препарата без доказанной эффективности в этих условиях может принести больше вреда, чем пользы.
Исходя из приведенных данных можно сделать вывод, что наиболее актуальным является внедрение в клиническую практику эффективных и патогенетически обоснованных методов антиоксидантной терапии и иммунокоррекции у больных с распространенным острым перитонитом, после тщательной апробации в экспериментальных исследованиях [145].
Принципы фармакологической коррекции распространенного перитонита дигидрокверцетином
Большинство антиоксидантов, применяемых в насотящее время в медицинской практике, являются липофильными соединениями (витамин Е, -каротин, пробукол и др.). Число известных водорастворимых форм не велико. К тому же сейчас предсталяют несомненный интерес, в плане создания препаратов повышающих устойчивость организма к неблагоприятным факторам окружающей среды, водорастворимые антиоксиданты, обладающие высокой биологической доступностью [122].
Перспективным направлением, разрабатываемым в последние годы, является использование природных соединений, обладающих широким спектром действия и лишенных ряда недостатков, присущих искусственно синтезированным химическим веществам [24, 94].
Одним из старейших методов терапии в медицине, является использование лекарств растительного происхождения, основанном на традициях народного врачевания. Низкая токсичность фитопрепаратов и невысокая их стоимость делает лекарственные растения и сборы из них наиболее доступными лекарственными препаратами [155]. Наиболее широко в клинической практике применяются водные извлечения - настои и отвары, они вызывают практический интерес фармакологического действия биологически активных соединений, растворимых в воде. Гликозиды флавоноидов являются одной из групп таких фармакологически активных веществ, извлекаемых водой. Согласно литературным данным флавоноиды оказывают капилляропротекторное и выраженное антиоксидантное действие [46, 81, 89].
Как объект изучения нами был выбран дигидрокверцетин (ДГК) -официальный препарат на основе комплекса фитофлавоноидов, выделенных из измельченной древесины лиственницы даурской и лиственницы сибирской, содержащий большое количество флавоноидов и имеющий значительную сырьевую базу в Центральном регионе России. Он является по химическому строению гидрированным по гетероциклическому фрагменту аналогом кверцетина, оказывающему капилляропротекторное и антиоксидантное действие [65].
Он является биофлавоноидом с широким спектром биологического действия: оказывает положительное влияние на функциональное состояние практически всех внутренних органов организма, регулирует метаболические процессы, создает механизмы защиты здоровых клеток организма от патологий, вызываемых химическими отравлениями, воздействием электромагнитного излучения и радиации, путем нейтрализации радикальной активности [19, 125]. Дигидрокверцетин является природным витамином Р, признан как эталонный антиоксидант, который невозможно получить синтетическим путем, и широко применяется в медицине и пищевой промышленности [19, 168].
Дигидрокверцетин очень необходим для животных и птицы, особенно при ведении животноводства в техногенных по тяжелым металлам и радионуклидам зонам России [117]. При проведении полного фармакологического скрининга установлено наличие у ДГК антиоксидантных и капилляропротекторных свойств в сочетании с противовоспалительным, гастро-: гепатопротекторным, гиполипидемическим и диуретическим действием [126, 134, 169]. Изучая безопасность ДГК, установлено, что он не обладает тератогенными и эмбриотоксическими свойствами,у него не обнаружено токсического и аллергизирующего действия. ДГК не обладает мутагенными свойствами в отличие от некоторых других биофлавоноидов [57]. Особое внимание заслуживают данные о радиопротекторном действии ДГК [12, 102, 117]. На основании фармакологических исследований сделан вывод, что ДГК защищает печень от различных видов поражения, а также выполняет протекторную роль в отношении развития кардиосклероза, особенно при наличии сердечной недостаточности или инфаркта миокарда. Также он оказывает стимулирующее действие на тканевый кровоток, стабилизирует барьерную функцию микрососудов, снижает проницаемость стенок капилляров и тем самым способствует снижению застойных явлений в микроциркуляторном русле [110].
М.И. Балаболкин с соавт. (2006) в ходе исследования установили, что при применении диквертина происходит снижение риска прогрессирования диабетических ангиопатий, улучшается гликемический контроль и чувствительность к инсулину [93]. Исследуя антиоксидантную активность ДГК, установлено, что он сопоставим с известным антиоксидантом а-токоферолом и вдвое более активен, чем Р-каротин. Предположено, что механизм антиокислительного действия ДГК заключается в перехвате липидных радикалов [12, 117]. О.Г. Круглова с соавт. (2011), выявили, что введение дигидрокверцетина приводит к снижению уровней продуктов перекисного окисления липидов (диеновых конъюгатов, гидроперекисей, малонового диальдегида) в крови и гомогенате печени животных, на которых осуществлялось холодовое воздействие [24]. Ю.С. Ландышев с соавт. (2011), выявили положительные эффекты длительного использования дигидрокверцетина у крыс с экспериментальной хронической почечной недостаточностью, выражающиеся в замедлении темпов прогрессирования патологических процессов в бронхолегочной системе [103]. В.Г. Новоженов с соавт. (1999) указывают, что у больных острой пневмонией, получавших комплексную терапию в сочетании с дигидрокверцетином, быстрее исчезали признаки легочного воспаления, содержание продуктов свободнорадикального окисления липидов в сыворотке крови было ниже по сравнению с аналогичными показателями у больных [80]. Н.И. Афанасьева с соавт. (2010) при местном применении дигидрокверцетиновой мази (2,5%) удалось стабилизировать структурные повреждения кератиноцитов, уменьшить реактивные явления со стороны микроциркуляторного русла дермы [15]. У Л.С. Корнеевой с соавт. (2009) применение дигидрокверцетина на фоне экспериментальной гипергликемии вызывало снижение глюкозы крови, уменьшение уровня реакции перекисного окисления липидов и повышение содержания витамина Е в периферической крови и ткани легкого, а также привело к положительной динамике структурных изменений в островках поджелудочной железы [181]. С.В. Петров с соавт. (2008) указывают, что ДГК при курсовом применении обладает вазотропным действием на микрососуды и позитивно влияет на нормализацию микроциркуляции у больных хронической венозной недостаточностью. Он оказывает стимулирующее влияние на тканевый кровоток, а также стабилизирует барьерную функцию микрососудов и несколько снижает проницаемость стенки капилляров. Пациенты после лечения отмечали улучшение самочувствия, исчезновение отеков, чувства тяжести и усталости в ногах [141]. Исследования А.В Дурнева с соавт. (2008) показали, что однократное введение данного препарата в дозах 1,5 и 150 мг/кг и 5-кратное введение в дозе 1,5 мг/кг не оказывало влияния на уровень хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей [71]. А.А. Кубатиев с соавт. (1999) установили, что тромбининдуцированное образование малонового диальдегида (МДА) тромбоцитами уменьшалось под влиянием ДГК. Снижение синтеза МДА активированными тромбоцитами в присутствии ДГК, по-видимому, обусловлено подавлением ДГК активности тромбоксан-синтетазы тромбоцитов. Наличие выраженной антиагрегационной активности ДГК позволяет рассматривать его как перспективное антитромбоцитарное средство [78]. ДГК применяют и в пищевой промышленности, в качестве антиоксиданта по отношению к животным жирам, сухому молоку, растительным маслам и жиросодержащим кондитерским изделиям. Добавка ДГК продлевает срок годности пищевых продуктов в 2-2,5 раза, улучшает качество продуктов за счет снижения содержания продуктов окисления. Доказан лечебно-профилактический эффект пищевых продуктов с добавкой Диквертина. Также разработан ряд биологически активных добавок к пище на базе ДГК, позволяющих ощутимо повысить качество питания населения, проживающего в экологически неблагоприятных условиях [117].
Определение биохимических и иммунологических показателей в сыворотке крови крыс
Забор крови для биохимического исследования осуществлялся после торакотомии, путем пункции перикарда на 1, 2, 3, 4, 5, 7 и 10-е сутки. Объем крови составлял 5-6 мл. Исследовались показатели оксидантно-антиоксидантного статуса (малоновый диальдегид, супероксиддисмутаза, общая антиокислительная активность, каталаза), эндотелиальной дисфункции (оксид азота) и маркеры воспаления (интерлейкин-6 и фактор некроза опухола-альфа).
Выраженность перекисного окисления липидов в крови животных оценивали по содержанию малонового диальдегида [18, 36]. Кроме того, определяли активность каталазы [91], супероксиддисмутазы и общую антиокислительную активность сыворотки крови крыс [86]. Уровень метаболитов оксида азота (суммарную концентрацию нитратов и нитритов, NOx) определяли колориметрическим методом по развитию окраски в реакции диазотирования нитритом сульфаниламида, входящим в состав реактива Грисса [114].
Количественное содержание ИЛ-6, ФНО- определяли с помощью ИФА наборов для крыс «Rat TNF- Platinum ELISA» фирмы «eBioscience», Австрия. Метод определения основан на «сэндвич» варианте твердофазного иммуноферментного анализа с применением биотин-конъюгированных поликлональных антител против крысиных ФНО- и биотин-конъюгированных моноклональных антител против крысиных ИЛ-6.
Концентрацию иммуноглобулинов IgG, IgM и IgA в сыворотке крови крыс определяли на 3-и, 5-е и 10-е сутки эксперимента иммунотурбидиметрическим методом на автоматическом анализаторе для биохимического и иммунотурбидиметрического анализа Vitalit 1000 (Италия) в соответствии с программами, разработанными фирмой-производителем, с использованием наборов «Иммуноглобулин G-Витал», «Иммуноглобулин М-Витал» и «Иммуноглобулин А-Витал».
При вскрытии животных обращали внимание на общий вид внутренних органов, наличие и отсутствие жидкостей в серозных полостях.
Для морфологического подтверждения развития моделируемой патологии и в комплексной оценке эффективности препаратов проводили гистологическое исследование тонкого и толстого кишечника, печени, почек, легкого и селезенки интактных, контрольных крыс и крыс, получавших исследуемые препараты. С этой целью кусочки данных органов фиксировали в растворе 10% нейтрального формалина и заливали в парафин по общепринятым методикам [113]. Парафиновые срезы толщиной 8-10 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Проводили морфометрию.
Последовательность выполняемых действий в исследуемых группах представлена в протоколе исследования. Протокол исследования: 1. Наркоз (внутрибрюшинно) хлоралгидрат в дозе 300 мг/кг массы животного; 2. Лапаротомия и моделирование РГП; 3. Введение исследуемых препаратов в соответствующих дозах, ежедневно с 1-х по 10-е сутки эксперимента; 4. Повторная релапаротомия через 48 часов от начала эксперимента и санация брюшной полости; 5. Измерение уровня микроциркуляции в стенке тонкой кишки с помощью ЛДФ-метрии; 6. Выполнение торакотомии и забор крови путем пункции сердца для биохимического и иммунологического анализов; 7. Эвтаназия путем передозировки наркоза; 8. Забор материала для морфологического исследования. Достоверность наблюдавшихся при действии исследованных препаратов изменений параметров, как абсолютных, так и в процентах от исходного уровня, определяли путем расчета средней арифметической (М), ошибки средней арифметической (±m) и оценки достоверности различий сравниваемых параметров между группами с использованием test для групп с разными дисперсиями, достоверными считались различия сравниваемых параметров при р 0,05.
Для подтверждения развития и моделирования распространенного перитонита использовали следующие критерии: динамика показателей уровня микроциркуляции в стенке тонкой кишки, гистологические исследования, оценка биохимических, иммунологических показателей и уровень летальности в каждой группе.
Животных выводили из эксперимента на 1, 2, 3, 4, 5, 7 и 10 сутки, после моделирования патологии, передозировкой средством для наркоза – хлоралгидратом и осуществляли забор тканей из области повреждения для морфологического исследования и кровь для оценки биохимических и иммунологических показателей.
Исследование флоуметрических, биохимических, иммунологических и морфологических изменений при моделировании распространенного перитонита у крыс, получавших дигидрокверцетин
Согласно дизайну исследования животным на фоне моделирования распространенного перитонита ежедневно перорально вводили дигидрокверцетин (ДГК) в дозе 7,7 мг/кг/сут в течение 10 дней.
Для определения эффективности лечения дигидрокверцетином использовали те же критерии, что и в контрольной группе: динамика показателей уровня микроциркуляции в стенке тонкой кишки, гистологические исследования, оценка биохимических, иммунологических показателей и уровень летальности в группе.
Животных выводили из эксперимента на 1, 2, 3, 4, 5, 7 и 10 сутки после моделирования патологии передозировкой средством для наркоза – хлоралгидратом и осуществляли забор тканей из области повреждения для морфологического исследования и крови для оценки биохимических и иммунологических показателей.
Динамика флоуметрических изменений при моделировании распространенного перитонита у крыс, получавших дигидрокверцетин
При оценке уровня микроциркуляции в опытной группе было выявлено, что введение экспериментальным животным дигидрокверцетина в качестве монотерапии приводит к эффективному повышению уровня регионарного кровотока в стенке тонкой кишки (таблица 6).
На вторые сутки эксперимента уровень микроциркуляции был на 33,9 % выше по сравнению с контрольной группой животных. В дальнейшем на 3-и, 4-е, 5-е и 7-е сутки отмечалось прогрессирующее повышение показателей микроциркуляции на 48,3 %, 122,6 %, 67,7 % и 103,7 %, соответственно (р 0,05). К десятым суткам эксперимента у исследуемых животных, получавших дигидрокверцетин, микроциркуляция в стенке тонкой кишки полностью восстановилась до уровня интактных животных, в то время как у крыс, не получавших лечения, оставалась на достоверно низком уровне (рисунок 20).
Анализ концентрации МДА в сыворотке крови крыс показал, что в контрольной группе животных на фоне моделирования распространенного перитонита происходит прогрессирующее нарастание данного показателя. Введение экспериментальным животным дигидрокверцетина в дозе 7,7 мг/кг/сут оказывало существенное влияние на снижение уровня МДА на протяжении всего эксперимента. Дегидрокверцетин снижал значения МДА на 28,4% (2-е сут), 47,2 % (3-и сут), 45,8 % (4-е сут), 44,0 % (5-е сут), 49,5 % (7-е сут) и 43,0% (10-е сут), приближая их к показателям интактной группы животных (р 0,05) (таблица 7).
В ходе исследования нами получено, что в контрольной группе отмечалось уменьшение активности одного из основных ферментов антиоксидантной защиты – каталазы, при введении дигидрокверцетина не происходило снижения данного показателя по сравнению с контрольной группой (р 0,05) и имело место более выраженное его компенсаторное повышение на 18,6 % (р 0,05) относительно контрольной группы животных на 2-е сутки эксперимента. В дальнейшем с 3-их по 7-е сутки сохранялся достоверно высокий уровень данного показателя как по отношению к контрольной, так и интактной группам (р 0,05), который к 10-м суткам снижался до уровня интактных животных (р 0,05) (таблица 7).
Установлено, что в контрольной группе животных отмечалось достоверное снижение показателя СОД на всех сроках исследования. Напротив, при использовании дигидрокверцетина достоверно повышалась активность СОД в 2 раза на 3-и, 4-е и 5-е сутки. При этом, на 7-е и 10-е сутки после моделирования патологии в сыворотке крови крыс активность СОД достигала максимума и превышала значения интактной группы на 25,9 % и 47,0 %, соответственно (р 0,05) (таблица 7).
В условиях патологии дигидрокверцетин в дозе 7,7 мг/кг/сут, начиная со 2-х суток эксперимента, статистически достоверно повышал ОАА относительно уровня, определяемого в контрольной группе, приближая их к показателям интактной группы животных (р 0,05). Следует отметить, что уровень интактных животных всё же достигался на 5-е и 7-е сутки (р 0,05). В то время как развитие экспериментального перитонита сопровождалось стойким снижением общей антиокислительной активности, которая была в 2 раза ниже по сравнению с интактными животными вплоть до окончания исследования (таблица 7).
На 3-и сутки после моделирования перитонита на фоне применения дигидрокверцетина концентрация иммуноглобулинов IgG и IgМ соответсвовала значениям интактных животных (р 0,05), однако, была достоверно ниже значений в контрольной группе (р 0,05). На 5-е и 10-е сутки в контрольной группе уровень IgG одинаково снижался в 1,7 раза, а IgМ – в 1,7 и 2 раза, соответственно, по сравнению с показателями интактной группы. Введение дигидрокверцетина приводило к восстановлению концентрации иммуноглобулинов IgG и IgМ на 5-е и 10-е сутки исследования до нормальных значений интактных животных (таблица 8).
Напротив, концентрация иммуноглобулина IgA в контрольной группе снижалась более, чем в 2 раза на 3-и, 5-е и 10-е сутки эксперимента относительно интактных крыс, а введение дигидрокверцетина способствовало повышению концентрации IgA до уровня здоровых животных на всех сроках исследования (таблица 8). При оценке динамики изменения концентрации конечных стабильных метаболитов оксида азота на фоне моделирования патологии выявлено повышение значений данного показателя, максимальный подъем которого в 4,2 раза зафиксирован на 3-и сутки эксперимента, по сравнению с интактными животными. При анализе влияния дигидрокверцетина на уровень NOx в сыворотке крови крыс видно, что препарат уже с первых суток достоверно снижал, а начиная с 5-х суток восстанавливал концентрацию NOx до уровня интактной группы (р 0,05) (таблица 7).
Важно отметить, что в результате введения дигидрокверцетина уже с 3-х суток эксперимента отмечается значительное уменьшение провоспалительных цитокинов (р 0,05), а на 10-е сутки исследования уровень ИЛ-6 и ФНО- снижался в 6 раз и 3,7 раза, соответственно, и достигал уровня интактных животных (р 0,05). Модель перитонита приводила к прогрессирующему повышению провоспалительных цитокинов ИЛ-6 и ФНО- на всех сутках эксперимента (р 0,05) по сравнению с интактной группой (таблица 7). Таким образом, в условиях распространенного перитонита нами выявлено антиоксидантное, иммуномодулирующее и противовоспалительное действие дигидрокверцетина в дозе 7,7 мг/кг/сут, заключающееся в нормализации показателей антиоксидантного, иммунобиологического и цитокинового статуса, а также в восстановлении NO-продуцирующей функции организма.
Динамика морфологических изменений при моделировании распространенного перитонита у крыс, получавших дигидрокверцетин
Париетальная брюшина – на 2 сутки после моделирования перитонита на фоне введения ДГК в париетальной брюшине, как и при нелеченном перитоните, отмечается очаговая невыраженная воспалительная инфильтрация (рисунок 21).
Тонкий и толстый кишечник – на 4-10 сутки воспалительные изменения в слизистой и подслизистой оболочке выражены заметно слабее, чем у крыс контрольной группы (рисунок 22), а на 10-е сутки патологические изменения в толстом кишечнике не выявляются.
Рисунок 21 – Перитонит на фоне введения ДГК. 2 сутки. Слабая воспалительная инфильтрация в брюшной стенке. Окраска гематок-силином и эозином. Х 280. Рисунок 22 – Перитонит на фоне введения ДГК, 4 сутки. Воспалительная инфильтрация ворсин тонкого кишечника с их заметным утолщением, язв нет. Окраска гематоксилином и эозином. Х 56.
Печень – на 2 сутки общая архитектоника долек аналогичная таковой у крыс контрольной группы, за исколючением отсутствия колоний микробов в синусоидах. На 4 сутки в гепатоцитах выявляется картина очаговой жировой дистрофии (рисунок 23), которая к 10-м суткам исчезает, в гепатоцитах обнаруживается лишь зернистая дистрофия. Воспалительные изменения и микробная инвазия в печени отсутствуют на всех этапах эксперимента.
Почки – на 2-4 сутки изменения в клубочках почки и межканальцевой строме аналогичны таковым у крыс контрольной группы, однако на 10-е сутки патологические изменения в почках в виде дистрофических изменений эпителия канальцев и интерстициального нефрита уже не обнаруживаются (рисунок 24).
В группе животных, получавших дигидрокверцетин в дозе 7,7 мг/кг/сут, за первые сутки погибло 6 крыс, что составило 12% летальности. На вторые сутки эксперимента летальность составила 8%. На 3-и сутки, после выполненной лапаротомии через 48 часов после моделирования патологии с целью санации брюшной полости антисептическим раствором, летальность снижалась до 4%. На 4-е сутки количество павших животных не изменилось, летальность составила также 4%. На 5-е и 6-е сутки количество павших животных уменьшилось, при этом летальность составила по 2%, а с 7-х по 10-е сутки полностью отсутствовала. К концу эксперимента на 10-е сутки общее количество павших животных составляло – 16 крыс. Таким образом, из представленных выше данных получено, что общая летальность в группе животных, получавших лечение дигидрокверцетином в дозе 7,7 мг/кг/сут на фоне моделирования распространенного перитонита, составила 32%.
