Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 17
1 . Закономерности комплексообразования металлов с витамина ми и аминокислотами 18
2. Влияние витаминов на птицу и животных 23
2.1. Химические и биологические свойства витамина В2 25
2.2. Витамин В3 и родственные соединения 36
2.3. Химические и биологические свойства аскорбиновой кислоты (витамин С) 42
2.4. Влияние аминокислот на птицу и животных 53
2.5. у-Аминомасляная кислота 60
3. Биологическая эффективнорсть хелатных комплексов биометаллов в организме птицы и животных 70
Глава 2. Материалы и методы исследования 77
2.1. Материалы исследования 77
2.2. Методы исследований 78
2.3. Методики исследований 79
2.4. Методы изучения биологических свойств полученных соединений 83
2.5. Методы исследования комплексных соединений металлов с витаминами и аминокислотами на животных 88
Часть 3. Результаты собственных следований 91
3.1.1. Синтез, строение и физико-химические свойства смешанноли-гандных соединений биогенных металлов с аминокислотами и витаминами 91
3.1.2. Синтез, строение и свойства соединений а-, Р- и у-аминокислот с неорганическими солями 98
3.1.3. Изучение термодинамических свойств комплексных соединений металлов с а, Р" и у-аминокислотами и неорганическими кислотами 102
3.1.4. Синтез и свойства молекулярных соединений у-аминомас-ляной кислоты с солями органических кислот 107
3.1.5. Молекулярные соединения кальция с аскорбиновой кислотой и аминокислотами 112
3.1.6. Хелатные соединения металлов с витаминами, их производными и аминокислотами 114
3.1.7. Константы диссоциации ГАМК и ее производных 114
3.1.8. Смешаннолигандные комплексы металлов с аскорбиновой кислотой и аминокислотами 116
3.1.9. Смешаннолигандные комплексы металлов с рибофлавином и аминокислотами 124 3.1.10. .Координационные соединения металлов с пантотеновой кислотой и родственными лигандами 128
3.1.11. у-Аминомасляная кислота и ее комплексные соединения 134
3.2. Биологические свойства смешаннолигандных соедине ний металлов с некоторыми витаминами и аминокислотами соединений металлов с витаминами и аминокислотами 147
3.2.1. Антигипоксические свойства комплексных соединений металлов с витаминами, их производными и аминокислотами 149
3.2.2. Противогипер- и противогипотермические свойства комплексного соединения железа с витаминами В3 и С 156
3.2.3. Витаминная активность комплексных соединений металлов с пантотеновой кислотой и аминокислотами 158
3.2.4. Антибактериальная активность комплексного препарата меди с ятреном 161
3.2.5. Изучение нейротропной активности комплексных соединений металлов с витамином Вз и у-аминомасляной кислотой 163
3.3. Применение смешаннолигандных комплексов биоген ных металлов с аминокислотами и витаминами в живот новодстве и птицеводстве 172
3.3.1. Применение комплексного соединения железа с вита минами В3 и С в условиях теплового стресса в птицеводстве 172
3.3.1.1. Влияние на сохранность, яйценоскость и качество яиц 172
3.3.1.2. Влияние комплексного соединения железа с витаминами Вз и С на гематологические и биохимические показатели крови 180
3.3.1.3. Влияние на переваримость и использование питательных и минеральных веществ корма 186
3.3.2. Влияние комплексного соединения железа с витаминами В3 и С на рост и развитие телят-молочников 197
3.3.3. Применение комплексных соединений биометаллов с рибофлавином и а-аминокислотами при выращивании цыплят-бройлеров 196
3.3.3.1. Влияние на продуктивность и конверсию корма 196
3.3.3.2. Влияние на переваримость и использование питательных и минеральных веществ корма 202
3.3.3.3. Влияние на аминокислотное, белковое и минеральное питание цыплят-бройлеров 206
3.3.3.4. Влияние на мясные качества цыплят-бройлеров 227
3.3.3.5. Изучение влияния комплексных соединений биометаллов с рибофлавином и аминокислотами на факторы естественной резистентности организма цыплят-бройлеров 239
3.3.4. Результаты применения комплексных соединений биометаллов с рибофлавином и у-аминомасляной кислотой при выращивании ремонтного молодняка кур-несушек 244
Обсуждение результатов 251
Выводы 259
Предложения производству 264
Библиографический указатель использованной литературы
- Закономерности комплексообразования металлов с витамина ми и аминокислотами
- Витамин В3 и родственные соединения
- Методы изучения биологических свойств полученных соединений
- Синтез, строение и свойства соединений а-, Р- и у-аминокислот с неорганическими солями
Введение к работе
1.1. Актуальность темы. В настоящее время возрос интерес к хелатным соединениям биогенных элементов с органическими лиган-дами, проявляющими разные виды биологической активности. Особый интерес из таких комплексов представляют смешаннолигандные соединения металлов с витаминами и аминокислотами, которые представляют собой новый класс биологически активных соединений, содержащих в своем составе различные по своей химической природе и биологическому действию вещества.
В отличие от обычных комплексных соединений, такие соединения содержат в своем составе, кроме микроэлемента, разные витамины или витамин и аминокислоту. При образовании соединений витаминов и аминокислот с неорганическими веществами изменяются их химические и биологические свойства. Во многих случаях витамины, находясь в составе таких соединений, обнаруживают биологическую активность, не свойственную витаминам в свободном состоянии. С другой стороны, ионы металлов в сочетании с витаминами и аминокислотами приобретают новые химические и биологические свойства. Они становятся менее токсичными и приобретают способность катализировать различные биохимические процессы. Поэтому на основе соединений витаминов и аминокислот с биометаллами и их солями возможно создание новых коферментных препаратов и биокатализаторов, новых лекарственных средств и биологически активных добавок.
С развитием интенсивных технологий выращивания и откорма сельскохозяйственной птицы и молодняка крупного рогатого скота большое внимание уделяется их полноценному питанию, причем не только наличию питательных веществ в рационе, но и обращается особое внимание на уровень минеральных веществ и содержание витаминов, а также других биологически активных веществ. Такой ком плексный подход требует глубоких научных исследований системы их применения, совместимости, влияния на состояние обменных процессов в организме, продуктивность и качество продукции.
Отечественными и зарубежными учеными внесен большой вклад в получение новых биологически активных соединений на основе хелатных комплексов металлов и изучение их биологических свойств, а также эффективности их применения в животноводстве, влияния этих веществ на продуктивные качества и обменные процессы в организме животных (Яцимирский К., Фридман Я., Хакимов X., Крисе Е., Метцлер Д., Бъеррум Я., Бек М., Анненков В., Вальдман А., Георгиевский В., Григорьев Н., Егоров И., Емелина Н., Казаков X., Кальницкий Б., Кармолиев Р., Клейменов Н., Ковальский Б., Крюков В., Кузнецов А., Кузнецов С, Лапшин С, Маслиев И., Маслиева О., Околелова Т., Петрухин И., Раецкая И., Самохин В., Тэн Э., Хенниг А., Шевелев Н. и др.).
Однако, как правило, такие исследования проводились воздействием на организм одного, редко двух видов биологически активных веществ. Комплексное их воздействие на животных и влияние на обменные процессы в их организме изучено недостаточно, особенно в условиях промышленного содержания.
Так как этот вопрос мало изучен, а иногда и отсутствуют научные сведения по синтезу, изучению физико-химических и биологических свойств комплексных соединений биометаллов с витаминами и аминокислотами, а также применению их в птицеводстве и животноводстве, то необходимость в выполнении такой работы является очевидной, а изучение влияния таких соединений на продуктивность и обменные процессы в организме при добавке их в рацион животных является перспективным и актуальным.
Тема диссертации выполнена в соответствии с программой Госагропрома РФ по решению задания О.С.-Х. 41, п. 03.02. ДМ «Изу чение и внедрение новых продуктов и препаратов биологически активных веществ микробиологического и химического синтеза, обеспечивающих повышение эффективности использования питательных веществ кормов и рационов» и планом научно-исследовательской работы Костромской государственной сельскохозяйственной академии по комплексной проблеме «Изучение кормовых добавок и биологически активных веществ, повышающих питательность рационов и продуктивность сельскохозяйственных животных». Номер государственной регистрации 01860125233.
1.2. Цель и задачи исследований. Целью работы являлось получение смешаннолигандных соединений биогенных металлов с аминокислотами и некоторыми витаминами, изучение их физико-химических и биологических свойств, влияния на обменные процессы в организме животных при введении их в рацион.
В задачи исследования входило:
- разработать методики и синтезировать смешаннолигандные комплексы биогенных металлов (медь, цинк, кобальт, никель, железо, марганец, кальций) с некоторыми аминокислотами и витаминами (С, Вг, В3, U); установить состав и строение этих комплексов;
- изучить физико-химические и биологические свойства полученных соединений (антибактериальные, противогипоксические, ней- ротропные, противоотечные, витаминные, противогипертермические);
- выявить взаимосвязь между физико-химическими и биологическими свойствами смешаннолигандных комплексов биогенных металлов с аминокислотами и витаминами;
- установить дозу в рационе и влияние комплекса железа с витаминами Вз и С на кур-несушек в условиях теплового стресса (яйценоскость, сохранность, конверсию корма, качество яиц, гематологические и биохимические показатели крови и ее сыворотки, переваримость и использование питательных и минеральных веществ корма);
- изучить влияние комплекса железа с витаминами В3 иС на прирост живой массы и сохранность телят-молочников, гематологические и биохимические показатели крови и ее сыворотки;
- определить оптимальную дозу введения в рацион цыплят-бройлеров и влияние комплексных соединений биометаллов с витамином В2 и а-аминокислотами на продуктивность, сохранность, конверсию корма, переваримость и использование минеральных и питательных веществ корма, показатели аминокислотного, белкового и минерального обмена в организме цыплят-бройлеров, их мясные качества и факторы естественной резистентности;
- выяснить эффективность применения комплексов биометаллов с витамином В2 и у-аминомасляной кислотой при выращивании ремонтного молодняка кур-несушек.
1.3. Научная новизна исследований. Впервые получен ряд смешаннолигандных комплексов биогенных металлов с аминокислотами и витаминами (С, В2, В3, U). На некоторые из этих соединений получены авторские свидетельства и патенты.
Исследованы их физико-химические свойства и предложены структурные формулы полученных соединений. Изучены биологические свойства полученных смешаннолигандных комплексов (антибактериальные, противогипоксические, нейротропные, противогипертер-мические, витаминные, противоотечные). Выявлены закономерности влияния смешаннолигандного комплексообразования на устойчивость и биологические свойства соединений. Установлена взаимосвязь между окислительно-восстановительными потенциалами и биологическими свойствами комплексных соединений.
Впервые проведены комплексные исследования по влиянию нового класса биологически активных веществ - комплексных соединений биометаллов с витаминами и аминокислотами - на кур-несушек, молодняк, цыплят-бройлеров и телят-молочников.
Установлено положительное влияние комплексов биометаллов с витаминами и аминокислотами на сохранность, прирост живой массы, конверсию корма, переваримость и использование питательных и минеральных веществ в организме птицы. Выявлено влияние этих комплексов на процессы аминокислотного, белкового и минерального обмена в организме цыплят-бройлеров.
Экспериментально доказано действие комплексных соединений биометаллов с витаминами и аминокислотами на морфологический и биохимический состав крови птицы и телят, а следовательно, на функциональную активность костного мозга (кроветворных органов).
Впервые выявлено влияние химической природы биометаллов и аминокислот в составе комплексов с витамином В2 и аминокислотами на продуктивные качества, обменные процессы и другие показатели при выращивании цыплят-бройлеров и ремонтного молодняка кур-несушек.
1.4. Теоретическая и практическая значимость работы. Получен новый класс биологически активных соединений, представляющий собой смешаннолигандные комплексы биогенных металлов с аминокислотами и витаминами (С, В2, Вз, U), изучены их физико-химические и биологические свойства. На некоторые из соединений получены авторские свидетельства и патенты. Установлены взаимосвязи между физико-химическими и биологическими свойствами комплексных соединений. Теоретически и экспериментально доказана эффективность введения в рацион кур-несушек комплекса железа с витаминами В3 и С в условиях теплового стресса, а также при выращивании телят-молочников. При этом наблюдается максимальный прирост живой массы, увеличение сохранности поголовья и конверсии корма, улучшается качество яиц, а также мясные качества и биохимические показатели крови животных и ее сыворотки.
Введение в рацион цыплят-бройлеров и ремонтного молодняка кур-несушек комплексов биометаллов с рибофлавином и аминокислотами из расчета 10 мг/кг корма приводит к повышению сохранности, естественной резистентности, интенсивности роста, конверсии корма и мясных качеств цыплят.
1.5. Апробация работы. Основные результаты исследований доложены и одобрены на симпозиуме «Биохимия, фармакология и медицинское применение производных витаминов и других предшественников коферментов» (Иркутск, 1983), всесоюзной конференции «Химия и технология редких, цветных металлов и солей» (Фрунзе, 1986), XVI всесоюзном Чугаевском совещании по химии комплексных соединений (Красноярск, 1987), конференции «Экология окружающей среды» (Ташкент, 1990), XI всесоюзной конференции «Микроэлементы в биологии и их применение в сельском хозяйстве и медицине» (Самарканд, 1990), 13 всесоюзном семинаре по химии пор-фиринов и их аналогов (Самарканд, 1991), 18 выездной секции по бионеорганической химии Научного Совета по неорганической химии АН СССР (Бишкек, 1991), ежегодных научно-практических конференциях профессорско-преподавательского состава Костромской ГСХА (1995-2005 гг.), межвузовской научно-методической конференции (Ярославль, 1994, 1995), научно-практической конференции «Актуальные проблемы науки в сельскохозяйственном производстве» (Иваново, 1995), научной конференции «Теория и практика использования биологически активных веществ в животноводстве» (Киров, 1998), международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции» (Москва, 1995), 8-й межгосударственной межвузовской научно-практической конференции «Новые фармакологические средства в ветеринарии» (Санкт-Петербург, 1996), международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветери нарной медицины и биологии» (Оренбург, 2003), международной научно-практической конференции «Достижения зоотехнической науки и практики - основа развития производства продукции животноводства» (Волгоград, 2005), 55, 56 и 57-й международных научно-практических конференциях «Актуальные проблемы науки в агропромышленном комплексе» (Кострома, 2004,2005,2006).
1.6. Публикации. Всего опубликовано 98 научных и методических работ, непосредственно по теме диссертационной работы 58 публикаций. Из них 12 статей в рецензируемых журналах. Доля автора в опубликованных работах 80,8%.
В опубликованных работах достаточно полно изложены основные положения диссертации. Диссертация посвящена получению новых биологически активных соединений на основе смешаннолиганд-ных комплексов биогенных металлов с витаминами и аминокислотами, изучению их биологических свойств и влиянию комплексов биометаллов с витаминами и аминокислотами на продуктивность и обменные процессы в организме животных.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Закономерности образования нового класса биологически активных соединений на основе смешаннолигандных комплексов биогенных металлов с аминокислотами и некоторыми витаминами (С, В2, Вз, U) и их биологические свойства (антигипоксические, антибактериальные, противогипертермические, нейротропные, противоотечные).
2. Взаимосвязь между физико-химическими и биологическими свойствами полученных смешаннолигандных комплексов.
3. Влияние комплекса железа с витаминами В3 и С на сохранность, яйценоскость, качество яиц, переваримость, использование и конверсию питательных веществ рациона, морфологические и биохимические показатели крови кур-несушек в условиях теплового стрес са, а также эффективность применения этого комплекса при выращивании молодняка крупного рогатого скота.
4. Влияние комплексных соединений биометаллов с витамином В2 и а-аминокислотами на продуктивность, переваримость, использование и конверсию корма, аминокислотное, белковое и минеральное питание цыплят-бройлеров и их мясные качества.
5. Действие комплексных соединений биометаллов с витамином В2 и у-аминомасляной кислотой на прирост живой массы, конверсию корма, химический состав мяса и показатели белкового и минерального обмена ремонтного молодняка кур-несушек.
1.8. Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, литературный обзор, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список использованной литературы, приложения.
Диссертация изложена на 329 с компьютерного текста, иллюстрирована 68 таблицами, 21 рисунками, 23 приложениями. Библиографический указатель использованной литературы включает 355 наименований, из них 104 на иностранных языках.
Закономерности комплексообразования металлов с витамина ми и аминокислотами
Большинство известных в настоящее время соединений витаминов с неорганическими веществами относятся к внутрисферным координационным соединениям типа [MBn]Xm, Kp[MBn], [МВт], где М ионы металлов; В - ионы и молекулы витаминов, К и X - внешне-сферные ионы, числа n, m, р - стехиометрические коэффициенты, в скобки заключены внутренние сферы комплексов. Широко распространены в природе и имеют большое значение смешаннолигандные соединения металлов, во внутренних сферах которых наряду с ионами и молекулами витаминов находятся другие лиганды неорганического и органического происхождения.
Ионы металлов жизни во многих биохимических процессах выполняют функции связующих звеньев между витаминами и субстратами, причем образуются смешаннолигандные соединения металлов с витаминами и аминокислотами, пуриновыми основаниями, пирими-динами, нуклеиновыми кислотами, углеводами, стероидами и другими субстратами (Уильяме Д., 1975).
Синтезированы и исследованы также некоторые соединения с двумя разными витаминами (Кебец Н., 2002). Их образование в природе служит одной из причин взаимного влияния витаминов при их совместном присутствии на физиологическую активность. На основе таких соединений возможно создание новых поливитаминных препаратов.
В настоящее время наиболее изучены бионеорганические соединения витаминов Bi (тиамин ), В2 (рибофлавин ), Вс (фолиевая кислота ), Вз (пантотеновая кислота), витамины группы В6 (пиридоксин, пиридоксаль, пиридоксамин), В)5 (пангамовая кислота), витамины группы РР (никотиновая кислота, никотинамид), аскорбиновая, п-аминобензойная кислота, биотип, витамин U (S-метилметионин), их производные и коферменты. Обстоятельно изучены кобаламины и корриноидные коферменты. Имеется мало данных о комплексообра-зующих свойствах ретинола (витамин А), кальций-ферролов, нафто-хиноновых и хромоновых витаминов (Фридман Я., Кебец Н., 1981-1990, Кебец Н., 1994-2006).
Витамины образуют более или менее устойчивые соединения со многими металлами. Наибольший интерес представляют соединения с металлами жизни (Уильяме Д., 1975). К числу этих металлов относятся щелочные металлы - калий и натрий; щелочно-земельные - кальций и магний, а также переходные металлы - медь, цинк, кобальт, марганец, железо, а также молибден. Имеются указания на жизненно важное значение также никеля, хрома и ванадия (Яцимирский К., 1975; Хакимов X., Татарская А., 1985).
Константы устойчивости комплексных соединений имеют большое практическое значение. С их помощью можно определить концентрационные условия существования определенных соединений в растворе, вычислить степень продвижения реакций комплексообра-зования или степень диссоциации соединений (Шлефер Г., 1964).
Константы устойчивости связаны с окислительно-восстановительными потенциалами комплексных соединений, константами кислотно-основных взаимодействий и других реакций (Бек М., 1973). Во многих случаях с константами устойчивости коррелируют биологические свойства соединений. В связи с этим большое значение имеют закономерности, прогнозирующие величину констант устойчивости соединений заданного состава (Бьерум Я., 1961).
В последние годы получила распространение и развитие концепция мягких и жестких кислот и оснований, на основе которой возможна количественная характеристика многих закономерностей ком-плексообразования (Фридман Я., 1975; Гарновский А., Сидименко А. и др., 1986). Все комплексообразователи и лиганды подразделяются на мягкие и жесткие в зависимости от их поляризуемости, окисляемо-сти, способности к образованию различных типов химической связи, их ковалентности и полярности. Мягкие комплексообразователи имеют тенденцию к соединению с мягкими лигандами, а жесткие - с жесткими согласно Я. Фридману (Фридман Я., 1975; 1985).
Витамин В3 и родственные соединения
Пантотеновая кислота - витамин В3 - представляет собой D(+)-а,у-диокси-Р,р-диметилбутирил-Р -аминопропионовую кислоту
Свойства и способы получения пантотеновой кислоты обстоятельно изучены и описаны в монографиях по химии витаминов и биологически активных природных соединений (Моисеенок А., 1989, Березовский В., 1975). 0(+)-пантотеновая кислота - светло-желтое вязкое маслообразное вещество. Она гигроскопична, хорошо растворима в воде, этиловом спирте, уксусной кислоте, этилацетате и диоксане, мало растворима в эфире и высших спиртах и практически нерастворима в хлороформе, бензоле и многих других органических растворителях. Константа диссоциации пантотеновой кислоты в воде равна 3,9-10"5. Природная 0(+)-пантотеновая кислота, обладающая витаминными свойствами, вращает плоскость поляризации вправо [oc]25D +37,5 (Н20). Левовращающая пантотеновая кислота не обладает витаминной активностью. Пантотеновая кислота, как следует из ее названия, широко распространена в природе. В природе встречается биологически активный гомолог пантотеновой кислоты - гомопантотеновая кислота.
Роль пантотеновой кислоты в процессах обмена веществ неоднократно освещалась в литературе (Ленинджер А., 1974; Аскаров А., 2003).
Установлено, что пантотеновая кислота является важнейшим биокатализатором реакций ацилирования. Она участвует в процессах ацилирования аминов, аминокислот, аминосахаров, холина, а также в биосинтезе терпенов и стероидов. Пантотеновая кислота внутри клеток находится в связанном состоянии в виде кофермента А, который представляет собой Р -(3фосфоаденозин-51-р2-0-пантотенил-р аминоэтилмаркаптан-4) дифосфат, пантотеинадениннуклеотиддифос-фат, К0А, KsKoA.
Считается, что фармакологическая активность пантотеновой кислоты и ее производных основана на увеличении тканевого фонда КоА (Моисеенок А., 1989).
В последние годы приобрели большое практическое значение природные производные и гомологи пантотеновой кислоты: пантоевая и гомопантотеновая кислоты.
Пантоевая кислота - а,у-днокси-р,Р-диметилмасляная кислота, СН2ОНС(СН3)2СНОНСООН, в свободном состоянии существует в форме пантолактона.
Гомопантотеновая кислота (GPant) - Д(+)-а,у-диокси-Р,р-диметилбутирил-Р-аминомасляная кислота - является высшим гомологом пантотеновой кислоты: HOCH2C(CH3)2CH(OH)CONHCH2CH2CH2COOH.
Ее кальциевая соль проявляет противосудорожное и противовоспалительное действие, пролонгирует действие наркотиков и применяется в медицине в качестве нейротропного средства под названием пантогам (Копелевич В., 1979)
Гомопантотенат кальция получают конденсацией пантолактона с у-аминобутиратом кальция в спиртовом растворе. Реакция легко происходит при комнатной температуре (Копелевич В. и др., 1981). Целевой продукт нерастворим в спирте и выделяется в осадок по мере получения. Гомопантотенат кальция представляют собой белый кристаллический порошок горького вкуса, темепратура плавления 155-165. Сама гомопантотеновая кислота является слабой (рК=4,52) и мало отличается по своим комплексообразующим свойствам от пантое-вой кислоты.
В литературе описаны многие способы получения солей пантотеновой кислоты (Березовский В., 1975).
При синтезе пантотеновой кислоты из пантолактона (а,у-диокси-р,Р - диметилбутиролактон) и свободного Р-аланина в присутствии вторичных или третичных аминов с последующим прибавлением оксида кальция или этилата натрия:
Методы изучения биологических свойств полученных соединений
Биологические свойства полученных соединений изучали в лаборатории фармакологии НПО "Витамины" и на кафедре фармакологии Киргизского мединститута.
Антигипоксическое действие веществ исследовали на моделях гипок-сической нормобарической, гемической и гистотоксической гипоксии. Ги-поксическая нормобарическая гипоксия вызывалась помещением мышей в герметически закрытые сосуды объемом 80 куб. см, гемическая - внутри-брюшинным введением нитрита натрия в дозе 400 мг/кг, гистотоксическая -внутрибрюшинным введением нитропруссида натрия в дозе 20 мг/кг. Наблюдения проводили до гибели животных.
Для выявления противосудорожного эффекта использовали модели судорожных состояний, вызываемых коразолом (100-110 мг/кг), а также тест максимального электрошока (Е. Swinyard, 1952).Судорожные агенты вводили подкожно в различные интервалы времени после применения изучаемых соединений.
Для изучения эффективности воздействия синтезированных соединений на физическую работоспособность крыс использовали метод регистрации времени плавания животных с грузом до полного утомления (B.C. Шаш-ков, 1972; Б.И. Любимов, 1977). Полученные результаты обрабатывали методом вариационной статистики с использованием критериев Стьюдента (М.Л. Беленький, 1963). Острую токсичность исследуемых соединений определяли при перо-ралыюм, внутримышечном и внутрибрюшинном способах введения интакт-ным животным массой 20±2 г.
Исследования проведены на 4850 белых беспородных мышах обоего пола и 310 взрослых крысах. Клинико-гематологические исследования
Гематологические исследования проводились для контроля за общим состоянием животных и для оценки состояния обменных процессов. В крови подопытных животных мы определяли количество эритроцитов и лейкоцитов в камере Горяева, содержание гемоглобина колориметрическим методом, щелочной резевр крови - методом Ван-Слайка ( П.Т. Лебедев, А.Т. Усович, 1976).
Биохимические исследования
Для общей оценки физиологического состояния организма животных изучали ряд показателей органического обмена с использованием соответствующих методов биохимического анализа.
В крови определяли общий белок рефрактометрическим методом, об-щии кальции - трилонометирческим методом с мурексидом, неорганический фосфор - фотоколориметрическим методом на приборе КФК-2, сахар - ме тодом Хагедорна-Иенсена, резервную щелочность - методом Ван-Слайка, каротин и витамин А - спектрофотометрически на СФ-16, железо определяли в крови с о-фенантролином фотоколориметрически на приборе КФК-2.
В кормах, кормовых остатках и кале определяли содержание общего азота методом Кьельдаля и сырого протеина расчетным путем, сырой клетчатки - методом Геннеберга и Штомна, сырого жира - методом Соксклета, сырой золы - путем прокаливания пробы в муфельной печи до постоянного веса, безазотистых экстрактивных веществ - расчетным путем.
Калориметрическое изучение комплексных соединений металлов с аминокислотами
С целью термохимической характеристики комплексных соединений металлов с аминокислотами определяли теплоты растворения в воде соединений хлоридов, нитратов и сульфатов цинка и меди с а-, 0- и у-аминокислотами и свободных аминокислот.
Тепловые эффекты растворения определяли в микрокалориметре с изотермической оболочкой (Д.У. Усубалиев, К.С. Алымкулова, 1987). Микрокалориметр и система термостатирования показаны на рис.3. Калориметрическим сосудом служит тонкостенный конусообразный стакан (4) из титана, помещенный в оболочку (5) из нержавеющей стали и удерживаемый в фиксированном положении при помощи текстолитового кольца (9). Оболочка закрывается снизу пластинкой (2) из нержавеющей стали, накидкой (1) и уплотняется резиновой прокладкой (3). Калориметрический сосуд закрывается крышкой (10) из текстолита при помощи накидной гайки.
В крышке сосуда имеется отверстие для мешалки (6), ампулодержателя (7), ампулоразбивателя (8), датчика температуры (14), нагревателя (15). Мешалка вращается на подшипниках (12). Для герметизации ввода мешалки в сосуд использован масляный затвор (11). Ввод ампулодержателя осуществляется через полиэтиленовый сифон с сальником. Погруженные в жидкость части мешалки (6), ампулодержателя (7) изготовлены из стекла, а непогруженные части указанных деталей - из нержавеющей стали.
Синтез, строение и свойства соединений а-, Р- и у-аминокислот с неорганическими солями
С целью характеристики молекулярных соединений у-аминомасляной кислоты, ее производных и других аминокислот с неорганическими солями нами синтезированы соединения хлоридов, нитратов и сульфатов цинка и меди с глицином, Р-аланином, у-аминомасляной кислотой и сс-окси-у-аминомасляной кислотами состава МХ2.пНА (X - СГ, N03 , S042"; п=1,2), исследовали их физико-химические свойства, установили строение на основе ИК-спектров, а также с помощью рентгеноструктурного анализа, определили теплоты растворения соединений в воде и соответствующие энтальпии образования соединений и энергии их кристаллических решеток.
Данные анализов приведены в табл. 4, из которой следует, что глицин образует соединения с солями металлов в молекулярном отношении 2:1, а Р-аланин, у-аминомасляная кислоты - в мольных отношениях 1:1. Состав соединений не зависит от молярных соотношений металлов и аминокислот в исходных растворах.
Все молекулярные соединения солей цинка и меди с а-, р- и у-аминокислотами являются кристаллическими веществами.
Дифрактограммы всех соединений солей металлов с аминокислотами отличаются от дифрактограмм свободных аминокислот и исходных солей металлов набором межплоскостных расстояний, что свидетельствует об их индивидуальности. Дифрактограммы сняты на дифрактометре марки Дрон-2 на Fe-излучении.
Все соединения цинка - бесцветные, соединения меди - различаются оттенками синего цвета. Температуры плавления и плотности соединений приведены в табл. 4. Соединения цинка хорошо растворимы в воде, растворимость больше 20%. Соединения меди мало растворимы в воде.
Для установления строения данных соединений были сняты ИК-спектры. В табл. 5 в качестве примера приведены некоторые характеристиче ские частоты ИК-спектров солей металлов с аминокислотами и свободных аминокислот, находящихся в цвитт ер-ионной форме.
В ИК-спектрах имеются полосы поглощения в области 3000 см"1, относящиеся к валентным колебаниям Ь1Нз+-группы, а также полосы поглощения в области 1570-1620 и 1400-1390 см", относящиеся к антисимметричным и симметричным колебаниям ионизированной карбоксильной группы. Полосы поглощения, относящиеся к Ш\) -группе в ИК-спектрах соединений смещаются в коротковолновую область, а полосы поглощения, относящиеся к ан-тисемметричным колебаниям СОО" группы - в длинноволновую область по сравнению с положением тех же полос в спектрах свободных аминокислот. Эти факты указывают на координацию ионами металлов аминокислот в цвиттер-ионной форме через карбоксильную группу.
Эти же факты подтверждаются и при рентгеноструктурном изучении полученных комплексных соединений (Сабиров В., Кебец Н., 1994).
Рентгеноструктурными исследованиями были установлены кристаллические структуры биядерных комплексов хлорида меди и нитрата меди с ГАМК (Сабиров В., Кебец Н., 1994). Исследования проводили на автодифрак-тометре Simens РЗ/РС (МоК0-излучение, графитовый монохроматор). Структуры расшифрованы прямым методом. Все расчеты проведены по программам SHELXTL-PLUS. Кристаллическая структура комплекса хлорида меди (11) с ГАМК построена из двухъядерных катионов
[Си2{ц-ООС(СН2)3 Шз}4С12] (рис.5), анионов СГ и кристаллизационных молекул воды, одна из которых разупорядочена по двум равновероятно заселенным позициям. Атомы меди связаны в двухъядерные катионы типа "китайского фонарика" бидентатными мостиковыми СОО-группами четырех ГАМК-лигандов; апикальные позиции при атомах Си заняты анионами СГ.
Установлено, что все четыре ГАМК-лиганда имеют цвиттер-ионную форму. Три из четырех ГАМК-лигандов имеют трансоидно-трансоидную конформацию, а четвертый ГАМК-лиганд - скошешю-трансоидную конфор-мацию. В данной структуре реализуется сложная и разветвленная система водородных связей, в которой участвуют атомы Н всех NH3-rpynn ГАМК-лигандов и пять из шести атомов Н трех кристаллизационных молекул воды.
Кристаллическая структура комплекса нитрата меди с ГАМК построена из биядерных катионных комплексов-фонариков [Cu2{u-OOC(CH2)3NH3}4(N03)(H20)]3+ (рис. 6), внешнесферных анионов ЫОз" и кристаллизационных молекул воды.
Оба атома меди имеют тетрагонально-пирамидальную координацию. Как и в предыдущем комплексе, в данном комплексе ГАМК-лиганды находятся в цвиттер-ионной форме - атомы азота аминогрупп протонированы, а карбоксилатные группы депротонированы.
Похожие диссертации на Синтез смешаннолигандных комплексов металлов с витаминами и аминокислотами и изучение их биологических свойств на животных
