Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 4
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
НЕКОТОРЫЕ АСПЖТЫ МЕТАБОЛИЗМА РНК В ПРОРАСТАЮЩИХ СЕМЕНАХ 7
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ . . . .' 40
Материал 40
Условия прорастания 40
Определение поглощения воды 40
Постановка опытов с мечеными предшественниками .... 41
Обработка меченых семядолей 42
Определение радиоактивности в ТХУ-осаждаемом и ТХУ-растворимом материале 44
Дифференциальное центрифугирование гомогената и выделение рибосом 45
Седиментационный анализ рибосом в сахарозном градиенте 49
Определение кислотонерастворимой радиоактивности
во фракциях сахарозного градиента 50
Анализ рибосом в градиенте плотности CsCI 50
ДСН-диск-электрофорез в полиакриламидном геле и радиоавтография 51
Определение содержания белка 53
Определение содержания РНК 54
Выделение рибосомных белков 56
Фракционирование РНК рибосомной фракции методом сорбции на нитроцеллюлозных фильтрах 56
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 58
I. Исследование условий и времени возобновления синтеза
РНК в семядолях набухающих зародышей гороха 58
I.I. Выбор экспериментального материала для исследования синтеза РНК на начальных стадиях набухания . .58
Использование меченого уридина для регистрации синтеза РНК 63
Условия и время обнаружения синтеза РЖ 67
2. Характеристика цитошіазматической высокомолекулярной
РЖ, синтезированной на ранних стадиях прорастания . . 73
2.1. Локализация вновь синтезированной РЖ
в цитоплазме 73
2.2. Характеристика полисомосвязанной новообра
зованной РЖ 82
2.2.1. Идентификация новообразованной мРЖ
в рибосомнок фракции семядолей 82
2.2.2. Идентификация новообразованной рРЖ
в рибосомнок фракции семядолей 89
2.2.3. Корреляция синтеза рРЖ и
рибосомных белков 93
3. Связь транскрипции и трансляции в клетках семядолей
на ранних стадиях прорастания 103
Зависимость транскрипции от трансляции 103
Роль транскрипции в раннем синтезе белка
в семядолях III
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 123
ВЫВОДЫ 128
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 131
Введение к работе
Прорастание семян - сложный биологический процесс, в результате которого зародыш превращается в активно растущий и развивающийся организм.Совокупность и последовательность всех молекулярных событий, делающих возможным прорастание семени, все еще остаются неизвестными. Фундаментальная перестройка метаболизма, происходящая при прорастании, подразумевает изменения в соотношении активированных и репрессированных генов, изменения в качестве и количестве транслируемых мРНК и синтезируемых белков. Происходят ли эти изменения в активности генов во время самого набухания зародыша или же совершаются в период эмбрионального развития, а новая информация, предназначенная для перестройки метаболизма, сохраняется нереализованной в сухих семенах и затем используется при прорастании - пока не вполне ясно. Неизвестно также, различаются ли в этом отношении растущие и запасающие ткани зародыша. Все современные данные, полученные, главным образом, на растущих частях зародыша, говорят о том, что транскрипция при прорастании возобновляется очень рано и что на начальных этапах в зародыше наряду с преформированными мРНК функционируют и новообразованные мРНК. Характер их взаимоотношений и роль в синтезе белка и в прорастании все еще остаются неясными. Для решения этих актуальных задач необходимо детальное и всестороннее исследование белково-нуклеинового метаболизма на ранних этапах прорастания. С другой стороны, прорастание представляет собой критическую стадию в жизненном цикле растения, и такие показатели качества семян, как их жизнеспособность и сила, коррелируют со скоростью синтеза белка и РНК в начальный период прорастания. Очевидно, что для понимания молекулярных механизмов ухудшения качества семян необходимы сведения о закономерностях развития трансляционной и транскрипционной актив-
'ностей при прорастании. Таким образом, необходимость детальной биохимической характеристики процесса прорастания определяется теоретическими задачами, связанными с проблемой дифференцированной экспрессии генов, и практическими задачами, связанными с проблемами семеноводства - основы продуктивного земледелия. В связи с этим, в настоящее время интенсивно исследуются молекулярные события, происходящие в растущих частях зародыша в период, предшествующий началу видимого прорастания. События, происходящие в этот же период в запасающих органах зародыша, таких как семядоля, предназначенных для поддержания роста проростка на более поздних стадиях развития и непосредственно не связанных с самим прорастанием, пока остаются в тени.
Семядоли в семенах бобовых растений представляют собой специализированную запасающую ткань зародыша, где в период формирования семени синтезируются и накапливаются в большом количестве запасные вещества, главным образом, белки. Этот процесс сопровождается значительным увеличением содержания РНК и ДНК в клетках семядолей. Характерной особенностью развития семядолей при прорастании является отсутствие в них клеточных делений и формирование в старых клетках новых метаболических систем, обеспечивающих растущие части зародыша питательными веществами за счет деградации запасных отложений. Хорошо известно, что функционирование семядолей как органов запаса при прорастании зависит от синтеза новых белков и требует развития не только деградативных, но и синтетических путей метаболизма. Однако синтез РНК и роль транскрипции в метаболизме семядолей при прорастании исследованы очень мало, особенно на ранних стадиях прорастания, при переходе зародыша от состояния вынужденного покоя, вызванного обезвоживанием, к активному метаболизму при гидратации.
Ко времени начала нашей работы имелись лишь единичные данные
'о состоянии аппарата транскрипции в клетках семядолей на начальных стадиях прорастаниями практически полностью отсутствовали сведения о локализации в цитоплазме и функции продуктов ранней транскрипции, а также о характере взаимоотношений транскрипции и трансляции в этот период.
В связи с этим представляло интерес исследовать характер развития РНК-синтезирующей активности в запасающих тканях семян бобовых на ранних стадиях прорастания, то есть в период, предшествующий видимому прорастанию.
Целью нашей работы явилось изучение in vivo синтеза РНК и его связи с синтезом белка в клетках запасающей паренхимы семядолей гороха на начальных стадиях прорастания. В работе были поставлены следующие задачи: I) выбрать экспериментальный материал и способ регистрации синтеза РНК в семядолях на начальных стадиях набухания; 2) определить условия и оценить время возобновления транскрипции в клетках семядолей; 3) проследить за судьбой новообразованной РЖ и определить время ее появления и локализацию в цитоплазме; 4) охарактеризовать виды новообразованной цитоплазмати-ческой РНК и их отношение к трансляционному аппарату; 5) определить характер зависимости ранней транскрипции от синтеза белка; 6) с помощью ингибиторного анализа оценить роль новообразованных РНК в ранней трансляции.
В обзоре литературы мы рассмотрим в общих чертах современное состояние исследований по биосинтезу РНК в прорастающих семенах и роли преформированных и новообразованных мРНК в синтезе белка при прорастании.
