Введение к работе
Актуальность проблемы. У нефотосинтезирующих организмов каротиноиды выполняют роль фотопротекторов и антиоксидантов. Кроме того, в биологических системах каротиноиды также выступают предшественниками сигнальных молекул, таких как витамин А у животных, абсцизовая кислота у растений и триспоровые кислоты у мукоровых грибов. Широкое применение каротиноидов в медицине и сельском хозяйстве, использование в качестве красителей и стабилизаторов пищевых продуктов и косметических средств делает актуальным исследованием функций этих соединений в живой клетке.
Способность синтезировать каротиноиды обнаружена у многих представителей царства грибов. Показано, что каротиногенез может стимулироваться условиями выращивания или химическими соединениями, повышающими уровень активных форм кислорода (АФК) в клетке, что указывает на важную роль каротиноидов в защите клетки от окислительного стресса и тесную связь их синтеза с процессами дифференцировки. Исследование функций каротиноидов в грибной клетке и их участие в системе антиоксидантной защиты является важным моментом в регуляции жизнедеятельности грибов.
Работа в основном выполнена на культуре гриба Blakeslea tnspora (промышленном продуценте (3-каротина), а также на каротиноидсинтези-рующем грибе Neurospora crassa и модельном объекте - бактерии E.coli со встроенной плазмидой, несущей гены синтеза Р-каротина.
Цели и задачи работы. Настоящая работа направлена на изучение функциональной активности каротиноидов и их роли в системе антиоксидантной защиты (АОЗ) грибной клетки при окислительном стрессе, а также на выявление причины феномена «сверхсинтеза» (3-каротина у B.trispora. В связи с этим в работе были поставлены следующие задачи:
Характеристика системы АОЗ у B.trispora - активность антиоксидантных ферментов супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы, содержание р-каротина у разных штаммов.
Сравнительный анализ реакции компонентов системы АОЗ на окислительный стресс у представителей разных классов грибов B.trispora и N.crassa.
Изучение участия Р-каротина в защите клетки от окислительного стресса на примере E.coli со встроенной плазмидой, несущей гены синтеза р-каротина.
Изучение начальных этапов синтеза триспоровых кислот (ТСК) из 0-
каротина у B.trispora. Связь синтеза. претпественников ТСК с
окислительным стрессом.
Научная новизна. При сравнении реакции компонентов системы АОЗ на окислительный стресс у представителей разных классов грибов B.trispora и N.crassa впервые было показано отсутствие Си,2п-СОД у В.trispora. У B.trispora каротиноиды выступали в роли основного активируемого компонента системы АОЗ, в отличие от N.crassa, у которой синтез каротиноидов происходил только в ответ на действие света. Впервые показано, что наличие р-каротина в клетке рекомбинантной бактерии E.coli предупреждало активацию СОД под действием редокс-медиаторов, что подтверждает участие каротиноидов в системе АОЗ in vivo. Впервые обнаружено, что под действием белковых препаратов, выделенных из мицелия гриба B.trispora, происходило окисление р-каротина по 4 углеродному атому Р-иононового кольца с образованием изокриптоксантина. Выявлено, что образующийся в результате окислительной деградации Р-каротина р-апо-13-каротинон является более предпочтительным субстратом для гидроксилирования Р-иононового кольца, чем р-каротин. Полученные данные позволяют предположить наличие двух путей синтеза ТСК в зависимости от стадии развития гриба. Апробация работы. Основные материалы диссертации были представлены на 5-ой Путинской конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2001г.), Международной конференции «Signaling systems of plant cell» (Москва, 2001г.), Международном симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2001г.), 3-ем съезде фотобиологов России (Воронеж, 2001г.), Международном симпозиуме «Plant under environmental stress» (Москва, 2001г.), 1-ом съезде микологов России (Москва, 2002г.), Международной конференции «Neurospora 2002» (Asilomar, California, USA, 2002г.), 6-ой международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2002г.), Международной конференции «Микология и альгология 2004» (Москва, 2004г.), 16-ой зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2004г.). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на ... страницах, включает в себя 16 рисунков, 8 таблиц и 1 схему. Список цитируемой литературы включает ... наименований.
