Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. (Обзор литературы) Современные представления о механизмах влияния прерывистой нормобарической гипоксии на сердечно-сосудистую систему
1.1. Основные закономерности реакции организма на гипоксическую гипоксию 11
1.2. Физиологические изменения в оганизме здорового человека при воздействии прерывистой нормобарической гипоксии 17
1.3. Реакции эндотелия на воздействие гипоксии 24
1.4 Клеточные механизмы ответа на гипоксию 31
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 42
2.1. Объекты исследования 42
2.2. Воздействие 43
2.2.1. Прерывистая нормобарическая гипоксия здоровых добровольцев 43
2.2.2. Прерывистая нормобарическая гипоксия в культуре эндотелиоцитов микрососудов легких человека 46
2.3. Функциональные методы обследования добровольцев 48
2.3.1. Исследование артериального давления и частоты сердечных сокращений 48
2.3.2. Биомикроскопия конънюктивальных сосудов 49
2.4. Схема лабораторного обследования здоровых добровольцев 51
2.5. Лабораторные методы обследования здоровых добровольцев 52
2.5.1. Измерение показателей оксидантного статуса организма 52
2.5.2. Определение активности антиоксидантных ферментов 54
2.5.3. Измерение концентрации большого эндотелина и васкулярного эндотелиального фактора роста в сыворотке крови 57
2.5.4. Определение уровня эндотелиальных микрочастиц в плазме крови 57
2.6. Методы исследования в культуре эндотелиальных клеток микрососудов легких человека 58
2.6.1. Определение тиобарбитуратреактивных продуктов в лизате эндотелиальных клеток микрососудов легких человека 58
2.6.2. Определение образования активных форм кислорода 59
2.6.3. Измерение концентрации васкулярного эндотелиального фактора роста в клеточной среде 61
2.6.4. Оценка проницаемости монослоя культуры эндотелиальных клеток микрососудов легких человека 61
2.6.5. Определение концентрации индуцируемых гипоксией факторов HIF-la, HIF-2a в лизате культуры эндотелиоцитов микрососудов легких человека 64
2.7. Статистическая обработка результатов 66
Результаты исследований и их обсуждение 67
ГЛАВА 3 . Исследование влияния курса прерывистой нормобарической гипоксии на биохимические маркеры повреждения и активации процессов регенерации эндотелия у здоровых людей 67
ГЛАВА 4. Исследование влияния курса прерывистой нормобарической гипоксии на показатели метаболизма активных форм кислорода у здоровых людей 77
ГЛАВА 5. Исследование влияния прерывистой нормобарической гипоксии на культуру эндотелиоцитов 82
5.1. Исследование изменений межклеточных контактов в культуре эндотелиоцитов при воздействии прерывистой нормобарической гипоксии 84
5.2. Исследование влияния прерывистой нормобарической гипоксии на продукцию активных форм кислорода и перекисное окисление липидов в культуре эндотелиоцитов 87
5.3. Влияние активных форм кислорода на показатели состояния межклеточных контактов эндотелиоцитов при прерывистой нормобарической гипоксии 89
5.4. Исследование влияния прерывистой нормобарической гипоксии на продукцию васкулярного эндотелиального фактора роста сосудов в культуре эндотелиоцитов 92
5.5. Влияние прерывистой нормобарической гипоксии на содержание индуцируемых гипоксией факторов HIF-la и HIF-2a в эндотелиоцитах микрососудов легких человека 94
Заключение 99
Выводы 112
Список литературы 113
- Основные закономерности реакции организма на гипоксическую гипоксию
- Прерывистая нормобарическая гипоксия здоровых добровольцев
- Определение тиобарбитуратреактивных продуктов в лизате эндотелиальных клеток микрососудов легких человека
- Влияние активных форм кислорода на показатели состояния межклеточных контактов эндотелиоцитов при прерывистой нормобарической гипоксии
Введение к работе
Актуальность темы. Общепризнано, что продуцируемые эндотелием биологически активные вещества играют ведущую роль в регуляции функциональной активности, пролиферации и апоптоза клеток сосудистой стенки, ее взаимодействии с форменными элементами и компонентами плазмы крови (Pohlman Т.Н., Harlan J.M., 2000; Galley H.F., Webster N.R., 2004; Marti H.H., 2005). Скорость синтеза и секреции эндотелиальных факторов, в свою очередь, регулируются множеством вазоактивных сигнальных молекул - ацетилхолином, брадикинином, ангиотензином II и другими, а также локальными изменениями скорости кровотока (Karimova A., Pinsky D.J., 2001; Michiels С, 2003). Одним из мощных факторов, модулирующих метаболизм эндотелиоцитов, является гипоксия (Faller D.V., 1999; Michiels С. et al., 2000; Li J.M., Shah A.M., 2004; Jernigan N.L. et al., 2004; Fike CD. et al., 2005).
Воздействие разными вариантами гипоксии и, в частности, прерывистой нормобарической гипоксией (ПНГ) уже долгие годы используется для профилактики и лечения многих хронических заболеваний, повышения неспецифической резистентности организма (Меерсон Ф.З., 1973; Караш Ю.М. и др., 1988; Стрелков Р.Б., Чижов А.Я., 2001). Установлено, что под влиянием курса ПНГ у здоровых людей развивается комплекс адаптивных изменений в различных системах организма, включающий возрастание потребления и эффективности использования кислорода, увеличение кислородной емкости крови, уменьшение реактивности симпатоадреналовой системы (Горанчук В.В. и др., 2003; Кривощеков С.Г. и др., 2004; Serebrovskaya T.V. et al., 2005).
Показано изменение артериального давления, частоты сердечных сокращений, тонуса резистивных сосудов при ПНГ у здоровых людей, а
также возможность коррекции с использованием ПНГ дисфункции эндотелия, нарушений гемодинамики у больных с артериальной гипертензией и ишемической болезнью сердца (Стрелков Р.Б., Чижов А.Я., 2001; Ельчанинова С.А. и др., 2002, 2005; Потиевская В.И., 2005). Анализ данных литературы позволил нам предположить, что механизмы адаптивных преобразований сердечно-сосудистой системы под воздействием ПНГ включают изменения функционирования эндотелия, его активацию с развитием устойчивости к действию повреждающих факторов.
Цель работы: Изучить роль эндотелия кровеносных сосудов в механизмах ответа на прерывистую нормобарическую гипоксию.
Задачи исследования:
Исследовать влияние курса прерывистой нормобарической гипоксии на биохимические маркеры повреждения и активации процессов регенерации эндотелия у здоровых людей — концентрацию в крови эндотелиальных микрочастиц CD31+, большого эндотелина-1 1-38, васкулярного эндотелиального фактора роста.
Изучить влияние курса прерывистой нормобарической гипоксии на показатели окислительного стресса и активность внутриклеточных антиоксиданти ых ферментов — супероксиддисмутазы, катал азы, глутатионпероксидазы — у здоровых людей.
В первичной культуре эндотелиальных клеток человека оценить воздействие прерывистой нормобарической гипоксии на показатели состояния межклеточных контактов, участие в их изменениях активных форм кислорода.
Исследовать изменение продукции активных форм кислорода, накопления тиобарбитуратреактивных продуктов в первичной культуре эндотелиоцитов при воздействии прерывистой нормобарической гипоксии.
Изучить динамику концентрации васкулярного эндотелиального фактора роста в клеточной среде первичной культуры эндотелиоцитов при воздействии прерывистой нормобарической гипоксии.
Оценить влияние прерывистой нормобарической гипоксии на содержание индуцируемых гипоксией факторов - HIF-la и HIF-2a, в клетках первичной культуры эндотелиоцитов человека.
Научная новизна.
Впервые показано, что механизм воздействия ПНГ (20 ежедневных одночасовых сеансов чередования вдыхания воздуха с вдыханием гипоксической газовой смеси, содержащей 10-12 об.% кислорода) у здоровых людей включает снижение концентрации в крови маркеров повреждения эндотелия на фоне повышения концентрации васкулярного эндотелиального фактора роста, активности внутриклеточных антиоксидантных ферментов и снижения концентрации продуктов перекисного окисления липидов.
На культуре эндотелиоцитов человека впервые показано, что ПНГ оказывает прямое влияние на эндотелиоциты: приводит к опосредованному активными формами кислорода кратковременному ослаблению межклеточных контактов эндотелиоцитов с их укреплением к третьему сеансу гипоксии, возрастанию продукции васкулярного эндотелиального фактора роста, накоплению в эндотелиоцитах индуцируемых гипоксией факторов транскрипции HIF-la и HIF-2a.
Теоретическая и практическая значимость.
Результаты работы свидетельствуют об участии эндотелия в механизмах адаптации к прерывистой нормобарической гипоксии, о возможности формирования не опосредованного системными регуляторными факторами ответа эндотелиоцитов на это воздействие.
Установленные закономерности указывают на перспективность исследования применения ПНГ для первичной профилактики артериальной гипертензии и атеросклероза - заболеваний сердечно-сосудистой системы, центральным звеном патогенеза которых является дисфункция эндотелия.
Положения, выносимые на защиту.
У здоровых людей курс прерывистой нормобарической гипоксии вызывает транзиторную активацию эндотелия, которая проявляется увеличением в крови концентрации эндотелиальных CD31+ микрочастиц, большого эндотелина-1 1-38, концентрации васкулярного эндотелиального фактора роста и сопровождается кратковременным усилением окислительного стресса и повышением активности супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы.
В первичной культуре эндотелиоцитов микрососудов легких человека прерывистая нормобарическая гипоксия (3 одночасовых сеанса чередования воздуха с гипоксической газовой смесью, содержащей 1 об.% кислорода с одночасовым перерывом, между сеансами) вызывает формирование не опосредованных системными регуляторами приспособительных реакций эндотелиоцитов, включающих зависимое от активных форм кислорода кратковременное ослабление межклеточных контактов эндотелиоцитов с их укреплением к третьему сеансу гипоксии, ослабление индуцированного гипоксией окислительного стресса, прогрессивное возрастание продукции васкулярного эндотелиального фактора роста.
Механизм реализации эффектов прерывистой нормобарической гипоксии на эндотелиоциты включает активацию системы индуцируемых гипоксией факторов транскрипции HIF-la и HIF-2a.
Апробация работы. Результаты исследования доложены и обсуждены на III научной конференции «Белки-маркеры патологических
состояний» (Астрахань-Москва, 2003), VI научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь-Барнаулу» (Барнаул, 2004), VII научно-практической конференции «Молодежь-Барнаулу» (Барнаул, 2005), XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006), VIII Международном конгрессе по адаптационной медицине (Москва, 2006), совместном заседании кафедр биохимии и физиологии (Барнаул, 2009), проблемной комиссии по физиологии и патофизиологии сердечнососудистой системы ГОУВПО «Алтайский государственный медицинский университет Росздрава» (Барнаул, 2009).
Публикации: По материалам диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоргг из введения, -
обзора литературы, главы с описанием материала и методов исследования,
четырех глав с результатами собственного исследования, их обсуждения,
выводов и списка литературы. Работа изложена на 137 страницах,
иллюстрирована 15 рисунками и 9 таблицами. Список литературы включает /
224 литературных источников, из них 65 - на русском языке и 159 - на иностранных.
Основные закономерности реакции организма на гипоксическую гипоксию
Повышенный интерес к изучению влияния на организм гипоксии наблюдается в течение многих десятилетий. Нарушение в кислородном обеспечении органов и тканей считается основным патогенетическим звеном развития многих заболеваний (Чарный A.M., 1961; Меерсон Ф.З., 1973). Такое понимание сформировало широко распространенное представление о гипоксии, как патологическом состоянии, наступающем в организме при неадекватном снабжении тканей и органов кислородом или при нарушении его утилизации в процессе биологического окисления (Чарный А.М., 1961).
Однако, на протяжении жизни человека кислородное обеспечение организма часто меняется, например, в момент рождения, крика, кашля, при физических и психоэмоциональных нагрузках, восхождении в горы и т. д., что позволяет рассматривать гипоксию, как важный физиологический фактор (Агаджанян Н.А., 1972; Меерсон Ф.З., 1973; Войткевич В.И. 1973; Стрелков Р.Б., Чижов А.Я., 1988; Колчинская А.З., 1992; Леутин В.П. и др., 1999). Более того, с середины прошлого столетия стало известно, что прекондиционирование гипоксией является эффективным фактором адаптации системы кровообращения и других систем организма к неблагоприятным воздействиям внешней среды и патологическим сдвигам гомеостаза (Меерсон Ф.З., 1973; Агаджанян Н.А. и др., 1987; Колчинская А.З., 1992; Стрелков Р.Б., Чижов А.Я., 2001).
Многообразие проявлений, а также причин гипоксии потребовало создания ее классификации. До недавнего времени наибольшей популярностью пользовалась классификация Баркрофта-Петерса-ван Слайка (Van Slyke D.D., 1957), которая включает четыре типа гипоксии: гипоксическую, гемическую, застойную (циркуляторную) и гистотоксическую гипоксию. Недостаток классификации Баркофта-Петерса-ван Слайка состоит в том, что в ней не дифференцируются гипоксические состояния, возникающие в результате патологических состояний и у здоровых людей. Эту проблему решает классификация А.З. Колчинской (1981), основанная на системном подходе к пониманию гипоксии. Согласно этой классификации выделяют шесть видов гипоксии: 1 - гипоксическая гипоксия, развивающаяся в результате снижения парциального давления кислорода (рСЬ) во вдыхаемом воздухе; 2 - респираторная гипоксия, сопровождающаяся снижением рСЬ в альвеолярном воздухе и артериальной крови при нормальном рОг во вдыхаемом воздухе; 3 — гемическая; 4 -циркуляторная; 5 - первичная тканевая гипоксия (соответствующая гистотоксической в классификации Баркофта-Петерса-ван Слайка); 6 — гипоксия нагрузки, которая развивается в результате снижения рСЬ в тканях вследствие увеличения потребления 02 активно метабол изирующими клетками (Колчинская А.З., 1981; Колчинская А.З. и др., 1983).
Ранние реакции организма человека на гипоксию в значительной мере зависят от интенсивности гипоксического воздействия, которая в первую очередь определяется р02 во вдыхаемом и альвеолярном воздухе, т.е. степенью гипоксии. Согласно Колчинской А.З. (1973, 1983) принято различать гипоксическую гипоксию 1-й степени - скрытую (латентную); 2-й — компенсированную; 3-й — субкомпенсированную; 4-й декомпенсированную и 5-й - терминальную гипоксию (рис. 1).
При воздействии гипоксией нередко наблюдается несоответствие эффективности анаэробного получения энергии метаболическим запросам организма, что способствует формированию комплекса приспособительных механизмов и реакций (Меерсон Ф.З., 1973; Агаджанян Н.А. и др., 1987; Гаркави Л.Х. и др., 1990; Boron W.F., Boulpaep EX., 2000). При этом следует отметить, что в определенных условиях эволюционно сложившиеся адаптационные реакции могут приводить к опасным для организма последствиям - повреждению органов и тканей (Crawford D.W., Blankenhorn D.H., 1991; Menger M.D. et al, 1991; Eckardt K.U. et al, 2005; Shpargel K.B., 2008). декомпенсированная. Штрихом обозначены каскады р02, сплошной линией - каскады поэтапной скорости доставки О2 (чОг). I - вдыхаемый воздух, А - альвеолярный воздух, а - артериальная, V - смешанная венозная кровь (Колчинская A3., 1992)
Очевидно, что процессы адаптации и повреждения находятся в определенной связи, протекают дискретно и сопровождаются определенными структурными и функциональными изменениями. В 1974 году Гаркави Л.Х. с соавторами предложили концепцию развития общих адаптационных реакций организма, основанную на качественно-количественном принципе, согласно которой на действие слабых раздражителей независимо от их качества развивается физиологическая адаптационная реакция (реакция тренировки), на действие раздражителей средней силы — реакция активации (Гаркави Л.Х. и др., 1990). При этом стресс-реакция, о которой писал Г. Селье, возникает при действии наиболее сильного раздражителя. Эта триада функционально связана и развивается дискретно, при увеличении силы раздражителя происходит скачкообразный переход в другую зону приспособительных реакций. Эти взгляды согласуются с общепринятым мнением о том, что процессы адаптации формируются через транзиторную мобилизацию, активацию, а в некоторых случаях и слабовыраженное повреждение компонентов функциональной системы, которая доминирует в адаптации к данному конкретному фактору (Меерсон Ф.З., Пшенникова М.Г., 1988).
Прерывистая нормобарическая гипоксия здоровых добровольцев
В соответствие с целью и задачами работы в исследовании приняли участие 30 здоровых добровольцев (10 мужчин и 20 женщин) в возрасте от 31 до 35 лет (средний возраст 33±2 лет). При включении добровольцев в исследование использовали данные анамнеза, документированные в их амбулаторных картах. Критериями невключения в исследование был список заболеваний и патологических состояний, используемый для получения референтных величин для здоровых (Alstrom et al., 1975).
Для исследования эффектов ПНГ in vitro была использована первичная культура клеток эндотелия микрососудов легких человека (ЭМСЛЧ, HMVE-L), полученная от Lonza Walkersville, Inc. (США)1. Выбор этого типа эндотелиоцитов обусловлен их фенотипически высокой чувствительностью к изменению напряжения кислорода. Известно, что ЭМСЛЧ значительно реже других типов эндотелиальных клеток испытывают периоды выраженной гипоксии, в связи с чем, по нашему мнению, являются наиболее удобным объектом для исследований эффектов интермиттирующей гипоксии.Культура ЭМСЛЧ выращивалась в пластиковых чашках Петри (диаметр 100 мм) с использованием стандартной жидкой среды для эндотелиоцитов Clonetics EGM-2-MV BulletKit (Lonza Walkersville, Inc., США) на основе базисной среды 2 для эндотелиальных клеток (Endothelial
Эксперименты в культуре эндотелиоцитов выполнены при содействии . . гранта государственного фонда США имени сенатора J.W. Fulbright. Автор выражает благодарность профессору Prabhakar N., докторам Nanduri J., Ying-Jie N. и другим сотрудникам лаборатории прерывистой гипоксии Центра системной биологии университета Чикаго за помощь в освоении технологии работы с культурой клеток. Basic Media 2), содержащей hEGF, гентамицин, амфотерицин-В, гидрокортизон, эмбриональную телячью сыворотку, VEGF, hFGF-B, IGF-1 и аскорбиновую кислоту. Клетки выращивались в атмосфере, содержащей 21 об.% кислорода, 5 об.% углекислого газа и 74 об.% азота. Для оценки эффектов ПНГ были использованы ЭМСЛЧ седьмого-девятого пассажа, достигшие 80-100 % конфлюентности (площадь чашки Петри, покрытая адгезированными клетками). Обработка клеток была различной в зависимости от последующего метода исследования.
Для проведения прерывистой нормобарической гипоксии использовали гипоксикатор "Био-Нова-204" ("Горный воздух"), который позволял проводить сеанс одновременно с четырьмя людьми (рис. 4). Создаваемая установкой гипоксическая газовая смесь (ГГС) содержала кислорода 10-12 об.% и поступала к каждому добровольцу через маску с клапаном вдоха и выдоха в объеме не менее 9 л/мин. Установка позволяла идивидуально выбирать одну из четырех возможных программ сеанса, различающихся длительностью периодов дыхания ГГС и атмосферным воздухом.
Гипоксикатор состоит из трех блоков: газоразделительного блока, компрессора и терминала пациентов, которые обеспечивают выработку азотно-кислородной газовой смеси с уменьшенным, по сравнению с атмосферным воздухом содержанием кислорода, подачу газовой смеси и визуализацию индивидуальной программы дыхания. Рис. 4. Гипоксикатор «Био-Нова-204» и добровольцы во время сеанса прерывистой нормобарической гипоксии
Сжатый компрессором воздух подавался через фильтр на газоразделительный блок, содержащий полупроницаемые мембраны, задерживающие кислород. Обедненный кислородом воздух поступал к терминалам добровольцев. Курс ПНГ состоял из 20 ежедневных одночасовых сеансов, состоящих из десятиминутных циклов. В цикле дыхание добровольцем через маску ГГС, содержащей 10-12 об.% кислорода, чередовалось с дыханием атмосферным воздухом. Длительность дыхания ГГС в цикле постепенно увеличивалась день ото дня в первые дни курса от 1 мин до 5 мин (табл. 1). Воздействие ПНГ проводили сертифицированные на этот вид медицинской деятельности врачи отделения гипокситерапии отделенческой клинической больницы ст. Барнаул и санатория «Барнаульский» (г. Барнаул) при участии к.м.н. Л.И. Павловской.
Основанием для такой схемы воздействия послужили данные исследований Караш Ю.М. и соавт. (1988). Согласно этим данным, дыхание ГГС, содержащей 10-12 об.% кислорода, на протяжении 5 мин приводит к развитию во всех тканях организма умеренной гипоксии, оказывающей оптимальное адаптивное воздействие. При этом установлено, что циклический режим дыхания ГГС, а, следовательно, и тканевой гипоксии, более эффективен для развития комплексной неспецифической адаптации, чем гипоксия в постоянном режиме. Немаловажно, что именно такой режим имитирует биоритм изменений парциального давления кислорода в матке и ткани плода, выявление которого в свое время и послужило идейной основой для разработки схем воздействия ПНГ. последующие Согласно рекомендациям Минздрава СССР, длительность дыхания гипоксической газовой смесью в первые сеансы ПНГ назначали в зависимости от результатов пробы Штанге - продолжительности задержки дыхания на вдохе (Стрелков Р.Б. и др., 1985). Постепенное удлинение дыхания ГГС в цикле в первые дни курса ПНГ рекомендовано для успешной адаптации организма к 5-ти минутным эпизодам дыхания ГГС. У всех участников исследования длительность задержки дыхания составляла не менее 25 секунд (от 32 до 61 секунд), поэтому в первые сеансы назначали длительность дыхания ГГС по 2 мин в цикле.
Воздействие прерывистой нормобарической гипоксией in vitro проводили с использованием инкубатора "Steri-Cult 200 Incubator" (Thermo Scientific, США), в которую помещали герметичную пластиковую камеру размером 20x25x15 см. Чашки с культурой ЭМСЛЧ располагали на сетке в центре камеры, для увлажнения атмосферы под сеткой размещали емкости с теплой дистиллированной водой. Во время сеанса нагретая до 37С газовая смесь постоянно поступала в камеру, отработанная смесь через выводящий клапан выводилась наружу. Объем и скорость поступления газовой смеси в камеру осуществлялась соленоидными клапанами автоматического дозатора газов «Flowmeter». Попеременно использовали готовые газовые смеси: нормоксическую (20 об.% 02, 5 об.% С02, 75 об.% N2) и гипоксическую (1 об.% 02, 5 об.% С02, 94 об.% N2). Измерение содержания кислорода в гипоксическои камере при ПНГ мониторировали с помощью сенсорных электродов оксиметра (Lazar Research Laboratories Inc., США).
Воздействие включало три одночасовых сеанса интермиттирующей гипоксии, каждый из которых состоял из 6 циклов чередования 5-минутной нормоксии и 5-минутной гипоксии. Повтор сеанса проводили после одночасового периода нормоксии. Динамика содержания кислорода в гипоксическои камере во время тренировочного цикла ПНГ показана на рис. 5А. A) Изменение парциального давления содержания кислорода в гипоксической камере (А) и культуральной среде (Б) во время сеанса ПНГ в культуре эндотелиоцитов микрососудов легких человека При разработке схемы воздействия ПНГ in vitro ставилась задача максимально приблизить ее параметры к схеме гипоксическои тренировки in vivo. В конце периода вдыхания гипоксическои газовой смеси в капиллярной крови здоровых участников нашего исследования парциальное давление кислорода, которое измеряли с использованием анализатора газов крови ABL-5 (Radiometer Copenhagen, Дания), снижалось от 83-108 до 35-45 мм рт. ст., что согласуется с данными А.Я. Чижова и Р.Б. Стрелкова (2001). Yuan G. et al. (2004) показано, что при интермиттирующей гипоксии, после гипоксического воздействия на протяжении одной минуты (1 об% СЬ, в культуре клеток линии PC-12) максимальное падение парциального давления кислорода в культуральной среде достигает 20-22%. В наших исследованиях в культуральной среде в процессе ПНГ парциальное давление кислорода в течение 5 минут пропускания гипоксическои смеси через камеру снижалась от 80 до 35-45 мм рт ст. (см. рис. 5Б).
Определение тиобарбитуратреактивных продуктов в лизате эндотелиальных клеток микрососудов легких человека
Из чашек Петри с ЭМСЛЧ, достигшими конфлюентности близкой к 100%, клеточную среду аспирировали с помощью вакуумного насоса, затем в течение 5 секунд чашки промывали холодным фосфатным буфером. После удаления буфера клетки немедленно замораживали в жидком азоте и помещали в морозильную камеру с температурой -80С, где они хранились до момента исследования. Определение ТБРП в лизате эндотелиальных клеток микрососудов легких человека проводили фотометрически по интенсивности окраски комплекса с тиобарбитуровой кислотой. Реактивы-. 1) 0,8% раствор ТБК; 2) 20% раствор ТХУ; 3) 8,1% раствор додецилсульфат натрия (ДСН); 4) 20 мМ фосфатный буфер, рН 7,4. Ход анализа: В чашку Петри с ЭМСЛЧ, помещенную на лед, добавляли 60,0 мкл фосфатного буфера, клетки отделяли от поверхности чашки с помощью шпателя. Суспензию клеток в фосфатном буфере переносили в микроцентрифужную пробирку и подвергали воздействию пяти коротких импульсов ультразвука. Клеточный лизат центрифугировали при 1000 g. В опытную пробирку вносили 25,0 мкл лизата, 13,5 мкл 8,1% ДСН, 94,0 мкл 20% ТХУ, 94,0 мкл 0,8% ТБК, тщательно перемешивали. В контрольную вместо лизата добавляли воду. После инкубации при 100С в течение 60 мин пробы охлаждали, центрифугировали и измеряли оптическую плотность против контрольной пробы при 532 нм. Расчет проводили и нормализовали согласно концентрации белка в лизате по формуле: ТБРП (мкМ/мг белка) = Ех9 -, где Е - экстинкция опытной пробы, 3,0 х 10 - коэффициент молярной экстинкции, 9,0 - разведение лизата, С — концентрация белка в лизате в мг/мл. Концентрацию белка в среде определяли методом Брэдфорда (Bradford М., 1976), реагентами Bio-Rad Inc. (США). Для исследования образования активных форм кислорода ЭМСЛЧ выращивали в специальной восьмилуночной культуральной системе Labech II Chamberslide (NUNC, Дания) с использованием стандартной клеточной среды. Размеры лунок составляли 80x80x100 мм, количество среды в каждой лунки было 400 мкл. При достижении клетками 80-85% конфлюэнтности проводили ПНГ. Интенсивность формирования АФК в ЭМСЛЧ осуществляли с использованием 10 мМ раствора диацетодикарбоксиметилового эфира б-карбокси-2 ,7 дихлордигидрофлюоресцина (ДАДХФ), который был получен от фирмы Molecular Probes (США). Известно, что под действием эндогенных эстераз в цитоплазме клеток происходит разрушение сложноэфирной связи в молекулах ДАДХФ с образованием свободного б-карбокси-2 ,7 -дихлордигидрофлюоресцина, который ( после взаимодействия с АФК приобретает способность флюоресцировать при облучении светом с длиной волны 490 нм.
Реактивы: 1) 10,0 мМ раствор ДАДХФ (Molecular Probes, США); 2) базисная среда 2 для эндотелиальных клеток (Lonza Walkersville, Inc., США); 3) 20 мМ фосфатный буфер, рН 7,4. Ход анализа: Для получения рабочего 1,0 мМ раствора ДАДХФ в пробирку вносили 9,9 мл базисной среды 2 для эндотелиальных клеток и 0,1 мл 10,0 мМ раствора ДАДХФ. За 30 мин до окончания ПНГ в среду добавляли 4 мкл рабочего раствора ДАДХФ. После окончания ПНГ среду аспирировали, лунки дважды промывали фосфатным буфером температурой 36С и немедленно проводили микроскопию. Флюоресцентную микроскопию проводили с использованием микроскопа Nikon Eclipse ТЕ 300 (Nikon, ЮКР) с возбуждающей и излучающей длинами волн 490 и 530 нм соответственно. Изображения получали с помощью видеокамеры Sony DKC 5000 (Sony, Япония), количественный анализ интенсивности флюоресценции клеток проводили с использованием программы Scion Image (National Institute of Health, США). Полученные данные были нормализованы к базальному уровню . продукции АФК в контрольной лунке с ЭМСЛЧ по формуле: АФК(%)= — хЮО FK где F о — усредненная интенсивность флюоресценции смеси клеток (не менее 50) из опытных лунок, F к - усредненная интенсивность флюоресценции смеси клеток (не менее 50) контрольных лунок. Измерения концентрации VEGF в клеточной среде проводили с использованием тест-системы и по протоколам фирмы Santa Cruse Ltd (США). При достижении клетками 90-95% конфлюентности в чашках Петри производили замену стандартной среды на базисную среду 2. Опытную чашку помещали в камеру и подвергали ПНГ, после чего среду из опытной и контрольной чашек аспирировали. Концентрацию VEGF рассчитывали в пикограммах на миллиграмм белка культуральной среды. Для оценки проницаемости монослоя, образованного ЭМСЛЧ, применяли методику динамического измерения импеданса клеток (ECIS), разработанную P. Mitra., C.R.Keese, I. Giaever (1991). Монослой клеток формировали на микроэлектродах (Applied Biophysics, США) (рис. 7), через которые пропускали переменный ток менее одного микроампера (рис. 8).
Влияние активных форм кислорода на показатели состояния межклеточных контактов эндотелиоцитов при прерывистой нормобарической гипоксии
Как следовало из результатов исследования, представленных в главе 6.2., ПНГ оказывает влияние на метаболизм АФК в эндотелиоцитах. Поэтому нами была проверена возможность непосредственного участия АФК в изменении проницаемости монослоя эндотелиоцитов при ПНГ. Для этого клетки были предварительно обработаны миметиком СОД - пентахлорида тетракис (1-метил-4-пиридил)-порфирина марганца III (ПТПМ). Примечание. Уровень значимости различий по критерию Уилкоксона: р - с результатом до ПНГ, р - с результатом после первого сеанса ПНГ, р - с результатом после второго сеанса ПНГ Уровень значимости различий по критерию Ньюмена-Кейлса: pi - с результатами до ПНГ; pi - с результатом после первого сеанса ПНГ, р - с результатом после второго сеанса ПНГ. Для оптимального накопления антиоксиданта клетками обработку культуры ЭМСЛЧ 50 мкМ раствором ПТПМ проводили за 30 мин до первого сеанса ПНГ. Следует отметить, что обработка эндотелиоцитов ПТПМ не оказывала существенного влияния на изменение проницаемости в контрольной культуре клеток, содержащихся в условиях нормоксии, на протяжении всего курса ПНГ (см. рис. 11). После каждого из трех последующих сеансов ПНГ снижения импеданса обработанной антиоксидантом культуры также не отмечалось, что указывало на сохранение исходного уровня проницаемости монослоя клеток. В связи с тем, что обработка клеток миметиком СОД нивелировала эффекты ПНГ на изменение импеданса, мы сделали вывод о непосредственном участии АФК в изменении проницаемости монослоя ЭМСЛЧ. Это согласуется с результатами исследования Alexander J.S. et al. (2004), согласно которым АФК играют центральную роль в изменении проницаемости эндотелиоцитов при воздействии на них постоянной гипоксией в течение пяти часов. Примечательно, что мы не наблюдали повышения суммарного импеданса после третьего сеанса ПНГ в культуре клеток, обработанной ПТПМ, в отличие от опыта без обработки культуры клеток. Вероятно, формирование АФК играет определенную роль в процессе снижения проницаемости монослоя культуры эндотелиальных клеток при ПНГ. 5.4. Исследование влияния прерывистой нормобарической гипоксии на продукцию васкулярного эндотелиального фактора роста сосудов в культуре эндотелиоцитов Данные, полученные нами при исследовании с участием здоровых добровольцев (см. главу 4), позволили сделать предположение об участии системы VEGF в реакциях эндотелия на ПНГ. Поэтому одной из задач исследования стало изучение продукции VEGF эндотелиоцитами при ПНГ in vitro. Мы исследовали динамику содержания VEGF в культуральной среде ЭМСЛЧ методом имму но ферментного анализа. Положительным контролем стало трехкратное повышение концентрации VEGF после пятичасового воздействия постоянной гипоксии с содержанием кислорода в камере 1 об.%.
Как видно из таблицы 9, первый сеанс ПНГ не сопровождался существенным изменением продукции VEGF, в то время как после второго и особенно третьего сеанса гипоксии наблюдалось значительное увеличение концентрации этого фактора в культуральной среде. Данный феномен может быть связан как с активацией биосинтеза, так и с усилением секреции VEGF эндотелиоцитами при действии интермиттирующей гипоксии (Shweiki D. et al., 1992; Ferrara N. et al., 1997). Нами было отмечено, что содержание VEGF в культуральной среде после трех сеансов ПНГ с общей длительностью пять часов оказалось почти в два раза выше, чем после воздействия непрерывной гипоксии с тем же содержанием кислорода на ЭМСЛЧ в течение шести часов. Это может свидетельствовать о более выраженной стимуляции продукции VEGF при интермиттирующей гипоксии. Примечание. Достоверность различий по критерию Ньюмена-Кейлса: р - по сравнению с результатами до курса ПНГ, pi - по сравнению со вторым сеансом ПНГ, р2 - по сравнению с непрерывной гипоксией. Влияние прерывистой нормобарической гипоксии на содержание индуцируемых гипоксией факторов HIF-la и HIF-2a в эндотелиоцитах микрососудов легких человека Согласно Semenza G.L. et al. (2004, 2006) наиболее вероятным кандидатом на роль инициатора каскада приспособительных реакций при гипоксии является группа чувствительных к кислороду транскрипторных факторов, индуцируемых гипоксией (HIF-la и HTF-2a). В частности, было установлено, что в регуляции транскрипторной активности промоторов генов VEGF, антиоксидантных ферментов и белков межклеточных контактов при воздействии непрерывной гипоксии на эндотелиоциты участвуют HIF-la и FHF-2a (Мапаїо D.J. et al., 2005; Semenza G.L. et al., 2006). Поэтому одной из задач исследования стало изучение влияния ГГНГ на внутриклеточное содержание HIF-la и HIF-2a. Последнее оценивалось методом иммуноблота в полиакриламидном геле. Поскольку в процессе активации системы HIF при гипоксии происходит транслокация и накопление молекул HIF-la и HTF-2a в ядре клеток, для иммуноблота использовали полный лизат эндотелиоцитов, включавший как цитоплазматические, так и ядерные компоненты клеток.
Для положительного контроля идентификации HIF в лизате клеток культура ЭМСЛЧ была обработана диметилоксалоилглицином (ДМОГ, DMOG) - специфичным ингибитором оксидаз пролина, участвующих в деградации HIF (Ratcliffe Р et al., 2000). В качестве второго общепринятого положительного контроля усиления экспрессии HIF культура ЭМСЛЧ была подвергнута воздействию постоянной гипоксии с содержанием кислорода 1% в атмосфере в течение 6 часов (Semenza G.R. et al., 1999).
Иммуноблот лизата клеток, обработанных ДМОГ, выявил накопление HIF-la в ЭМСЛЧ, проявлявшееся приблизительно трехкратным усилением флюоресцентного сигнала в области 120 кДа (см. рис. 13 и рис.14). Еще большее усиление сигнала в соответствующей области мы обнаружили при проведении иммуноблота лизата ЭМСЛЧ после воздействия постоянной гипоксией в течение 6 часов. Это подтверждало достаточную чувствительность выбранной методики и, следовательно, позволяло надежно определять HIF в лизате клеток в использованной экспериментальной системе.
Как видно из рисунков 13 и 14, первый сеанс прерывистой гипоксии не изменял содержание HIF-la и HIF-2a в лизате ЭМСЛЧ, что, вероятно, связано с недостаточным временем воздействия для накопления HIF, по крайней мере, в количестве, достаточном для обнаружения использованным нами методом. Второй и третий сеансы ГШГ приводили к выраженному накоплению обеих изоформ фактора.
Примечательно, что одновременное накопление в клетках HIF-la и HIF-2a характерно для формирования адаптационного фенотипа, включая активацию биосинтеза VEGF и антиоксидантных ферментов (Ratcliffe P.J., 2007). Повышение содержания HIF во время второго и третьего сеансов ПНГ может объяснять накопление VEGF после завершения курса ГШГ и снижение прооксидантной активности за счет активации экспрессии антиоксидантных ферментов в эндотелиоцитах к третьему сеансу гипоксии, выявленных нами в предыдущих исследованиях.
