Введение к работе
Актуальность проблемы. Иммуноцитохимическое исследование клеток с впользованием моноклональных антител ( МКА ) нашло широкое применение ак в Фундаментальных исследованиях, так и в практической диагностике, эстижения гибридомной биотехнологии, в основе которой лежит метод со-атической гибридизации клеток, предложенный и разработанный Kohler и ilstetn (1975), способствовали бистрому развитию производства МКА в ашей стране.
В связи с особенностями дифференциальной диагностики элокачест-знных заболеваний системы крови возможности гибридомной техники в эльшей степени направлены на получение МКА к диФФеренцировочным анти-гнам лейкоцитов. В настоящее время в России существует широкая панель СА к антигенам различных кластеров дифференцировкн лейкоцитов серии СО (Барышников А.Ю., 1990), серии ВСА (Булычева Т.И., 1990), серии ЛТ Филатов А.В.,1987) , позволяющая в совокупности с общепризнанными ла-эраторнымм методами проводить исследования иммунофенотипа клеток на ічественно новом уровне, который стал доступен для любого гематологи-їского учреждения страны.'
Помимо изучения экспрессии мембранных и цитоплазматических анти-тов информативным для определения степени злокачественности опухоли іпяется выявление пролиферативной активности неопластических клеток, іенка этого параметра предоставляет исследователям возможность изуче-ія динамической организации здоровых тканей, нарушения регуляции кле-)чного деления при патологических процессах, изменения функциональной :тивности злокачественно трансформированных клеток.
Для исследования пролиферации клеточной популяции применяют раз личные методы: 1) авторадиографию с использованием тимидина, меченог тритием, 2) проточную цитометрию с подсчетом содержания ДНК, 3) имл регнацию нуклеол азотнокислым серебром с морфометрией результатов ре акции. Но в последние годы большой интерес вызывает изучение иммуноци тохимических маркеров делящихся клеток., что свягнша a vucoison специ Фичностью применяемых в данном методе реагентов, а именно МКА. Антите ла позволяют выявлять антигенные структуры, зкспрессированные либо течение нескольких, либо в течение отдельных фаз клеточного цикла.Эт существенно расширяет возможности изучения клеточного деления.
Так как основные события, связанные с процессом деления клеток происходят в ядре, особое внимание исследователей привлечено к ядерны антигенам, ассоциированным с клеточной пролиферацией. За рубежом настоящему времени получен ряд гибридом, секретирующих МКА к ядерным ядрышковым антигенам пролиферирующих клеток, среди которых наибольше признание получили Ki-67 (Gerdes J., et al., 1983) и РСЙА (Ogata К. et al., 1987). К отечественным МКА сходной направленности причисляю лишь антитела ИПО-38 (Сидоренко СП. с соавт., 1994). Однако в некото рых случаях случаях они дают не только ядерное, но и цитоплаэматичес кое иммуноокрашивание, что существенно затрудняет оценку пула пролифе рирующих клеток.
В связи с этим являются актуальными и перспективными для практи ческой гематологии исследования по получению и использованию отечест венных МКА к ядерным антигенам, ассоциированным с клеточной пролиферв цией. Это даст возможность дополнить существующую в нашей стране па нель антител, что позволит охарактеризовать не только фенотип патолс гических клеток, но и определить степень злокачественности опухолевог
клона. А именно эти показатели являются информативными для дифференциальной диагностики, выбора адекватной терапии и оценки индивидуальных особенностей течения болезни (.Freeman J.W., et al., 1991; Houmand A.., et al., 1992; Ковваїїочвка Л.Е. , et al., 19Э1).
Цель» работы явилось получение мышиной гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела к ядерному антигену, ассоциированному с клеточной пролиферацией, и изучение специфичности полученных антител.
Задачи работы:
-
Получить штамм перевиваемых гибридомных клеток методом соматической гибридизации в системе мышь х мышь, оекретирукщих моноклональные антитела к ядерному антигену, ассоциированному с клеточной пролиферацией .
-
Изучить характеристики полученного клона гибридомных клеток, его морфологические свойства, особенности роста в культуре и в организме животных.
-
Исследовать специфичность полученных моноклональных антител и проанализировать их пригодность для оценки пролифвративной активности латологических клеток при злокачественных заболеваниях системы крови человека.'
-
Охарактеризовать антиген, выявляемый полученными моноклональ-«лми антителами, и е го локализацию в клеточном ядре.
Научная новизна. Получек новый штамм мышиных гибридомных клеток, обозначенный ЗС9, секретмрукдаий моноклоналъкые антитела ВСР.-РС. Охарактеризованы морфологические и ростовые свойства гибридомы в культуре
и организме животных.
Доказано, что секретируемые гибридомой МКА взаимодействуют с as рышковым антигеном пролиферирующих клеток, различной линейной, тканев< и видовой специфичности, но не дают иммуноокрашивания в покоящих< клетках.
При определении молекулярной массы связываемого полученными мс ноклональными антителами антигена методом Бестерн- блоттинга виявлеї две полосы, соответствующие 35 кД и 43 кД, что свидетельствует об орі тональности полученных МКА ВСА-РС (указаний на МКА, выявляющие ядерні антиген со сходными молекулярно- биологическими характеристиками, литературе не обнаружено).
Виявлена практическая ценность МКА ВСА-РС для оценки пролиферг тивной активности патологических клеток при злокачественных заболев) ниях системы крови.
Теоретическое и практическое значение. Научные результаты, преді тавленные в работе, имеют важное теоретическое и практическое энач< ниє. Получєнньпі новый штамм гибридомных клеток ЗС9, является пригоднз для создания препарата МКА ВСА-РС в лабораторном и промышленном прои: водетве. Секретируемые им МКА могут быть рекомендованы в качестве реї гента, используемого в дополнение к существующей в нашей стране диа: ностической панели МКА для иммунофенотипирования клеток больных лейкі эами и лимфомами, позволяя производить оценку пролиферативной акти: ности патологических клеток. Полученный препарат может служить инстр; ментом для исследования сложного и многоступенчатого процесса делен клеток при нормальном и патологическом гемопоэзе, что имеет ъажн
значение для Фундаментальных исследований в области биохимии, цитологии и молекулярной биологии.
МВД ВСА-РС применяются в лаборатории электронной микроскопии НИИ физико- химической, биологии им. ІЧ.Н.Белозерского, МГУ; лаборатории гибридом НИИ сывороток и вакцин им. И.И.Мечникова РАМН. МВД ВСА-РС включены в диагностическую панель антител в лаборатории uunwufecrjcM иммунологии ГНЦ РАМН.
Положения, выносимые на защиту:
-
Получены МВД ВСА-РС оригинальной специфичности, связывающие ядрышковый антиген, экспрессируемый клетками культивируемых линий различной, видовой, тканевой и линейной принадлежности, ФГА-стимулированными лимфоцитами здорового донора, пролиферирующими клетками больных, различными гематологическими заболеваниями и не взаимодействующие с покоящимися клетками.
-
При определении молекулярной массы связываемого полученными яоноклональными антителами антигена методом Вестерн- блоттинга выявлено две полосы, соответствующие 35 кД и 43 кД.
-
Антиген, связываемый МВД ВСА-РС, в интерфазных клетках локализован в ядрышках, а в Фазе митоза выявляется в цитоплазме.
Апробация работы состоялась на заседании проблемной комиссии 'Экспериментальная гематология и биотехнология" Гемлтплогииеокпгп научного центра РАМН. Основные положения работы били доложены на II Национальном конгрессе молодых ученых- медиков Украины "Современные вопросы клинической и экспериментальной онкологии" в г. Киеве в 1994 г., m Всеармейской научной конференции "Актуальные вопросы гематологии" в
- a -
г. Санкт- Питербурге в 1995 г., на заседании "Гематологического нау^ ного общества" в г. Москве б 19Э6 г. По материалам диссертации опублу ковано 3 журнальные статьи и 2 тезисов. Подготовлены документы для па тентования полученных МКА ВСА-РС.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на странице
машинописного текста, состоит иэ введения, обзора литературы, описані-' материалов и методов исследований, изложения собственных данных, зак лючения, выводов и библиографического указателя, включающего 205 ре бот, в том числе 13 отечественных автороЕ. Диссертация иллюстрирован 11 таблицами, 4 рисунками и 1 фотографиями.
