Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Биофизика системы антиген-антитело 8
2. Общие сведения о природе химических связей в белковых молекулах. 13
3. Основные типы серологических реакций 16
4. Калориметрия в исследовании биологических сред.... 21
5. Использование микротерморезисторов для регистрации реакции комплексообразования..... 28
6. Моделирование иммунных процессов. 34
7. Теоретическое обоснование метода иммунотермографии. 37
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Выбор теплового режима работы микротерморезистора. . 40
2. Конструкция термисторной установки..... 44
3. Объекты исследования. 47
4. Математическая обработка результатов исследования.. 48
РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ГЛАВА III. РАЗРАБОТКА МЕТОДА ИММУНОТЕШОГРАФЙИ
1. Конструкция многоканального прибора 54
2. Установление оптимальных параметров метода иммуно-термографии. 57
3. Методика экспериментов 60
4. Количественная оценка результатов реакции агглютинации методом иммунотермографии. 65
ГЛАВА ІV. РЕЗУЛЬТАТЫ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДА ИММУНОТЕРМОГРАФИИ
ПРИ ПОСТАНОВКЕ НЕКОТОРЫХ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ 71
1. Определение теплопроводности среды в процессе комплексообразования 71
2. Применение метода иммунотермографии при постановке реакции Видаля.
3. Использование метода иммунотермографии для выявления аутоантител 84
4. Определение иммуноглобулинов методом иммунотермографии .. 90
5. Применение нормального закона распределения к результатам исследований 94
6. Алгоритм поиска адекватной математической модели иммунной реакции 101
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 105
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 112
ВЫВОДЫ. 114
ЛИТЕРАТУРА..... 116
- Биофизика системы антиген-антитело
- Выбор теплового режима работы микротерморезистора.
- Конструкция многоканального прибора
Введение к работе
Развитие науки непрерывно связано с расширением и совершенствованием применяемых методов исследования. Это в полной мере относится и к биофизике, бурный прогресс развития которой в последние десятилетия превратил ее из узкой дисциплины в широкую общебиологическую науку. Основной задачей этой науки стали исследование и расшифровка на молекулярном уровне механизмов биологических процессов с вовлечением биофизических, биохимических и математических методов.
Современные методы постановки серологических реакций - агглю тинации, гемагглютинации, преципитации, флокуляции, связывания комплемента позволяют учитывать только конечные результаты серо реакции при соединении антигенов с антителами по появлению хлоп ев из склеившихся бактерий или эритроцитов, образованию преципи тата, помутнению среды, лизису эритроцитов и т.д.
Динамика процесса соединения детерминантных групп антигенов с рецепторами антител не учитывается, так как для оценки серо-реакций важны только конечные результаты, определяемые как отрицательная или положительная реакция интенсивностью от одного до четырех плюсов, что устанавливается визуально с некоторой долей субъективности.
Разведения сыворотки или антигенов позволяют при этом определять титры серореакций и учитывать результаты в различные сроки, часто только на второй день.
Существенным отличием разработанной нами методики иммуно-термографии является регистрация в виде графических кривых течения всего процесса соединения детерминантных групп антигенов рецепторами антител.
Таким образом, метод иммунотермографии позволяет изучать не только конечные результаты серореакций, но и установить начало реакции, ее интенсивность, продолжительность, волнообразный характер течения и момент окончания процесса.
В основе иммунных реакций, как уже давно установлено, лежит электростатическое взаимодействие между рецепторами антител и детерминантными труппами антигенов - ван-дер-ваальсовнх взаимодействий, водородных и ионных связей. Энергия взаимодействия мала и составляет от 4 до 12 ккал/моль /152/. Однако, использование современных терморезисторов и усилителей позволяет выявить происходящие при этом процессы агрегации макромолекул и изменения теплопроводности среды и зарегистрировать их графически в виде имму-нотермограмм, отражающих динамику соединения антигенов с антителами.
Актуальность темы обуславливается тем обстоятельством, что в практике до сих пор отсутствует точный, объективный способ учета динамики иммунных реакций и оценка их производится только визуально по образованию осадка, просветлению среды и т.д., что носит часто субъективный характер. Метод иммунотермографии, в отличие от этого, фиксирует динамику процесса соединения антигенов: с антителами в виде графической кривой, что важно для изучения особенностей иммунного ответа при различных инфекциях и иммунопатологических состояниях и может быть использован в биологии и медицине. На основании полученных графиков, названных нами иммунограммами , дается объективная характеристика процесса сое- динения детерминантных групп антигенов с рецепторами антител. Метод иммунографии может найти применение в биологии и медицине в качестве экспресс-метода для объективной оценки и анализа проис-ходящиг в организме иммунологических сдвигов.
Цель диосрфт^пкчой работы заключается в разработке нового объективного экспресс-метода учета и регистрации термодинамики процесса соединения антигенов с антителами в виде графических кривых. Объективная графическая регистрация динамики процесса соединения детерминантных групп антигенов с рецепторами антител позволяет изучить кинетику образования комплексов антиген-антитело.
Основные задачи исследования; разработка метода иммунотермографии для регистрации динамики реакции соединения антиген-антитело; применение метода иммунотермографии для постановки серологических реакций и титрования антител в сыворотках крови больных людей и экспериментальных животных; конструирование многоканальной термисторной установки и установление оптимальных параметров метода; разработка алгоритмов обработки результатов исследования, полученных методом иммунотермографии.
Научная новизна. Впервые зарегистрирована последовательность этапов процесса соединения антигена с антителами в виде графических кривых - иммунотермограмм, позволяющих выявить волнообразное течение процесса, момент наступления реакции, ее интенсивность и длительность течения в виде отдельных затухающих этапов, а также момент окончания реакции.
Принципиальное отличие предлагаемого метода заключается в том, что ранее применявшиеся методы учета иммунологических реакций регистрировали не сам процесс, а лишь его конечные результаты по образованию флокулята, агглютината, преципитата и прочее.
Практическая ценность работы. Предлагаемый метод иммуно-термографии позволяет в течение 15-20 минут зарегистрировать динамику реакций соединения антигена с антителами, благодаря чему его следует отнести к методам экспресс-диагностики. Метод отличается специфичностью и высокой чувствительностью при выявлении различных типов антител: агглютининов, преципитинов и других иммуноглобулинов в сыворотках крови больных людей и экспериментальных животных.
Метод прост в постановке. Термисторная установка может быть собрана из типовых элементов заводского производства, что делает ее доступной для широкой лабораторной практики. Полученные графические результаты исследований в виде иммунотермо-грамм позволяют производить их дальнейшую математическую обработку с применением ЭВМ.
Разработанный метод внедрен в практику работы и включен в учебную программу кафедры экспериментальной и теоретической физики 2-го Московского медицинского института игл. її. И. Пирогова и кафедры биохимии Среднеазиатского медицинского педиатрического института.
На разработанный метод Госкомитетом по делам изобретений и открытий получено авторское свидетельство "Способ постановки реаіщии агглютинации" за В 730349 /61/. Термисторная установка как прибор для постановки реакции агглютинации экспонировалась на ВДНХ УзССР.
Биофизика системы антиген-антитело
Известно, что живая система гетерогенна, она построена из множества низко- и высокомолекулярных веществ. Гетерогенность характерна для всех уровней биологической организации вплоть до структуры нуклеиновых кислот и белков /15,171/.
Молекулярное узнавание, определяемое слабыми взаимодействиями, является основой биомолекулярных процессов: молекула белка-фермента узнает и перерабатывает множество молекул субстрата, а в биосинтезе белка рибосома "читает" весь текст,записанный в цепи матричной РНК и соответствующим образом осуществляет соединение аминокислот в полипептидную цепь. Иммунологическая защита живых организмов от чужеродных белков и других биополимеров,обладающих антигенными свойствами, осуществляется также путем узнавания и дифференцирования "своего" от "чужого" как с помощью иммунокоглпетентных клеток, так и продуцируемых ими специфических антител /122/. Появление антител в организме является, таким образом, результатом узнавания антигена иммунокомпетентными клетками, сложная система которых приводит к выработке антител популяцией В-лимфоцитов. Антитела представлены белками, относящимися к иммуноглобулинам, среди которых по классификации ВОЗ (1964) различают 5 классов:
Одним из важнейших у человека является иммуноглобулин J а Ц? Молекула Jg Ч имеет молекулярный вес около 155000 и состоит приблизительно из 1330 аминокислот /161,136,167/. Необходимо отметить, что молекула 7 состоит из 4-х цепей: двух идентичных тяжелых цепей, каждая с молекулярным весом около 55000, и двух идентичных легких цепей с молекулярным весом около 22000. Эти цепи соединяются друг с другом в трех точках, образуя гибкую Т-образную структуру /175,159,130/.
Наиболее важной частью молекулы иммуноглобулина является комбинирующий участок, специфический рецептор или активный центр, в котором происходит соединение антитела о антигеном. Молекулы Jg Ч имеют одинаковую форму и два комбинирующих участка, имеющих одинаковые размеры. Например, размер активного участка антитела к полисахариду составляет 25х11х2А /184/. Взаимодействие между антигенной детерминантой и комбинирующим участком антитела является специфическим: они должны подходить друг к другу "как ключ к замку". Размеры активного центра антитела относительно невелики и составляют около 2% поверхности ее молекулы, образуя впадину /140,181,153/.
В настоящее время имеются веские экспериментальные данные, указывающие на то, что антитела одно- или двухвалентны, а антигены - поливалентны /180,135/.
Выбор теплового режима работы микротерморезистора
Изменения коллоидно-дисперсных свойств среды сопровождаются изменением вязкости и теплопроводности жидкости, что можно определить электрическими методами. Свойство полупроводников изменять удельное сопротивление в зависимости от температуры является основой работы датчиков-микротерморезисторов /17,96/ и определяется следующим выражением: где в - постоянная, зависящая от свойств материала микротерморезистора; Т -температура микротерморезистора. Если к микротерморезистору подводится какое-то количество тепла О , проходящее через рабочее тело датчика, то оно будет передаваться окружающей среде в каждый момент времени. Передача тепла будет осуществляться пропорционально отрицательному градиенту температуры и вызовит конвективное движение частиц /67/. Если устранить причину временного движения частиц жидкости, то скорости движения различных слоев жидкости начнут выравниваться в соответствии с законом возрастания энтропии. Сила внутреннего трения, отнесенная к единице площади слоя, пропорциональна градиенту скорости и определяется выражением где /р - коэффициент вязкости.
Характер распределения температуры в среде зависит от ее молекулярной структуры и определяется вязкостью и теплопровод - 41 ностыо /64/. Становление стационарного процесса в жидкости при точечном подведении тепла происходит не сразу, а в течение некоторого времени. Время становления стационарного теплообмена и его характер, т.е. крутизна кривой на графике, зависит от условий эксперимента, температуры жидкости, его объема, вязкости, теплоемкости сосуда, а также от электрических характеристик терморезистора и величины протекающего тока.
Конструкция многоканального прибора
Одноканальная схема термисторного прибора, предложенная Кришталь М.Ф. и Каменской В.В. /63/ при практическом использований требует дополнительных затрат времени на отдельный анализ контрольной и опытной среды. При этом не исключена возможность неодинакового влияния температуры внешней среды на исследуемые объекты, поскольку замеры по времени не совпадают, а сравниваемые среды гетерогеняы. Трудность подбора одинаковых терморезисторов для компенсационной и измерительной цепи также вносит искажения в проводимые измерения.
Повысить эффективность термисторной установки и достоверность проводимых исследований удается путем увеличения числа мостов постоянного тока с терморезисторами до трех, которые через блок коммутации подключаются к усилителю постоянного тока И-37 и затем к самопишущему птабору Н-37. Каждый терморезистор, включенный в мостовую схему, автономен и одновременно используется как в целях контроля термостатирования, так и для измерения термодинамических сдвигов в среде в процессе реакпии соединения антигена с антителаш. При этом можно проводить контроль термостатирования одновременно 2-х и более сывороток независимо друг от друга. Регистрация кинетики реакции производится путем поочередного переключения к усилителю И-37 с самописцем Н-37 одного из трех мостов постоянного тока с терморезистором, где в данный момент происходит термостатирование.
