Введение к работе
Актуальность темы. Ангиогенез - это процесс формирования сосудистой сети на базе существовавших ранее сосудов. Нерегулируемый интенсивный ангиогенез характерен для патологических процессов: псориаза, диабетической ретинопатии, раковых заболеваний. Поэтому изучение ангиогенеза и механизмов его регуляции имеет большое значение. Основные положения теории взаимосвязи ангиогенеза и онкогенеза заключаются в следующем: (і) большинство первичных солидных опухолей проходит через стадию небольшой аваскулярной массы (размерами 1-2 мм в диаметре), могущей длительное время находиться в неактивном, «спящем» состоянии. При этом кислород и питательные вещества доставляются в процессе пассивной диффузии; (п) эти микрообразования каким-то образом могут «включить» ангиогенез, заставляя окружающие сосуды выпускать «ростки» в сторону опухоли, которые впоследствии интегрируются в опухолевую массу. Этим самым новообразование получает возможность роста и метастазирования (через кровоток); (ііі) ангиогенный «переключатель» активируется при помощи семейства эндогенных белков, факторов роста; (iv) рост опухоли можно остановить путем блокирования ангиогенеза, либо через «переключатель» либо напрямую разрушая эндотелиальные клетки новых сосудов. Последний подход предполагает, что новообразованные сосуды по своей структуре и клеточному составу отличаются от зрелых «обычных» сосудов. В настоящее время известны многие про- и анти-ангиогенные факторы, ключевые биохимические реакции и пути трансдукции. Однако механизмы взаимодействия между ними, роль отдельных белков и способы регуляции «ангиогенного переключателя» остаются малоизученными. Одним из ключевых факторов ангиогенеза является сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и его рецептор 2 типа (VEGFR2, Flk-1/KDR). Среди про-ангиогенных факторов можно также назвать фактор некроза опухоли (TNF-a), эпителиальный фактор роста (EGF) и его рецептор (EGFR), фактор роста фибробластов (FGF), ангиопоэтин-2. Аномально активные EGF рецепторы, характерные для ряда раковых клеток, посылают постоянный митогенетический (возникающий при клеточном делении) сигнал и повышают экспрессию VEGF. Поскольку ангиогенез зависит от сложного каскада реакций с участием этих факторов, их изучение представляет большой интерес. Известно, что подавлении опосредованной VEGFR-2 передачи сигнала ведет к
мощному анти-ангиогенному эффекту, который может быть использован при патологическом ангиогенезе (в частности, в случае раковых новообразований). В идеале, дозируя препарат, можно добиться либо «нормализации сосудистой сети» (что улучшит доставку лекарств к опухоли) либо ее регрессии (что приведет к уменьшению опухоли и ее возращеню в латентное состояние). Действительно, первый анти-VEGF препарат (bevacuzimab, Genentech, Inc., San Francisco, CA) уже одобрен для лечения метастатического рака кишечника совместно с химиотерапией, еще десятки находятся на различных стадиях клинических испытаний.
В свзязи с этим возникает потребность в определении надежных биомаркеров раннего ответа не анти-ангиогенную терапию, по которым можно будет предсказать последующий клинический эффект. Такие биомаркеры будут полезны не только для облегчения клинических исследований новых препаратов, но и для определения индивидуальной схемы лечения для каждого пациента. Несмотря на то, что клинический ответ на терапию ингибиторами ангиогенеза является медленным, некоторые метаболические и физиологические изменения можно зафиксировать уже вскоре после начала лечения. Поскольку терапия ингибиторами ангиогенеза направлена на аномальные опухолевые сосуды, то естественно предположить на роль маркеров такие гемодинамические параметры, как объем крови в опухоли, поток крови через опухоль, проницаемость опухолевых сосудов и их плотность. Еще одним подходом является дизайн контрастных агентов, взаимодействующих с упомянутыми выше молекулярными маркерами ангиогенеза, которые представляют собой диагностическую и прогностическую ценность.
Магнитно-резонансная томография (МРТ) является незаменимым инструментом при изучении ангиогенеза in vivo, поскольку а) это неинвазивная методика б) она позволяет делать множество повторных снимков с хорошим анатомическим разрешением в) не сопровождается ионизирующим излучением г) позволяет измерять ряд гемодинамических параметров, изменение которых предшествует регрессии опухоли. Современные достижения в молекулярной МРТ также позволяют неинвазивно исследовать молекулярные мишени, однако возможности визуализации молекулярных биомаркеров рака пока являются ограниченными.
Цель данной работы заключается в изучении методами МРТ биомаркеров ангиогенеза и раннего ответа на анти-ангиогенную терапию в карциномах человека на животных моделях.
Для достижения этой цели поставлено ряд задач.
-
Разработать животную модель (ксенографты человеческой карциномы ободочной кишки) и чувствительный протокол для MP-экспериментов по изменению гемодинамических параметров в ответ на терапию ингибитором тирозин-киназной активности VEGFR-2.
-
Определить содержание эритроцитов для нахождения поправки по распределению контрастного МР-агента.
-
Иммуногистохимическими методами показать соотвествие данных МРТ сопровождающим анти-ангиогенную терапию и ангиогенез изменениям.
-
Оптимизировать методику синтеза и очистки конъюгатов ферментов (глюкозоксидазы и пероксидазы хрена) и антитела (анти-EGFR или анти-Ь6) с целью их дальнейшего использования в экспериментах по визуализации соответствующих молекулярных мишеней.
-
Применить метод магнитно-резонансной амплификации для визуализации EGF-рецептора, который регулирует активность VEGFR и L6 - маркера карциномы кишечника.
Защищаемые положения
-
Благодаря магнитному полю семи неспаренных электронов парамагнитный внутрисосудистый контрастный ТІ-агент PGC-Gd активно изменяет релаксационные свойства окружающих протонов. Он укорачивает время спин-решеточной релаксации (ТІ) накапливающих его областей, благодаря чему при использовании ТІ-взвешенной последовательности их изображение становится ярче. По причине большого гидродинамического диаметра концентрация PGC-Gd в сосудистом русле остается постоянной на все время MP-исследования, что позволяет рассчитать объем крови в опухоли по изменению интенсивности МР-сигнала.
-
Рассчитанные по изменению интенсивности MP-сигнала после внутривенного
введения PGC-Gd гемодинамические параметры (абсолютный объем крови в
опухоли) позволяют неивазивно оценивать ранние эффекты анти-ангиогенной терапии.
-
В присутствии перекиси водорода и фермента-оксиредуктазы (например, пероксидазы хрена) парамагнитный субстрат Gd-DTPA-diSer олигомеризуется с образованием продуктов, укорачивающих ТІ накапливающих их областей в большей степени, нежели мономер (эффект магнитно-резонансной амплификации).
-
Система конъюгатов пероксидаза хрена-антитело и глюкозоксидаза-антитело обеспечивает селективный эффект магнитно-резонансной амплификации путем доставки оксиредуктазы и генерирования Н202 in situ. Предварительная инъекция системы биоконъюгатов обеспечивает селективную олигомеризацию парамагнитного субстрата и специфичное увеличение интенсивности МР-сигнала в присутствии маркеров-мишеней in vitro и in vivo.
Новизна работы
На примере экпериментального тирозин-киназного ингибитора VEGF-рецептора второго типа показано, что разработанный МРТ-метод может применяться для оценки ранних анти-ангиогенных эффектов в ксенографтах аденокарциномы кишечника человека.
Впервые осуществлена эктопическая животная модель аденокарциномы кишечника человека.
Оптимизирована схема метода визуализации молекулярных маркеров, основанная на селективном связывании системы антитело-фермент, вызывающей олигомеризацию парамагнитного субстрата.
Впервые показана эффективность in vitro и in vivo визуализации молекулярных маркеров ангиогенеза и онкогенеза (EGFR, L6) методом магнитно-резонансной амплификации. Практическая ценность работы
Представленные в диссертационной работе методы МРТ позволяют достоверно оценивать как гемодинамические, так и молекулярные маркеры анти-ангиогенеза в опухоли.
Так, примененный MP-подход позволяет неинвазивно оценивать ранние эффекты
анти-ангиогенной терапии (изменение объема крови), предшествующие
морфологическим изменениям (регрессу опухоли). При внедрении в клинику данная схема позволит проводить мониторинг анти-ангиогенного лечения и корректировать терапевтическую схему, исходя из ответа конкретного пациента.
Разработанная в диссертации ортотопическая животная модель аденокарциномы ободочной кишки человека может использоваться для дальнейшего изучения этого заболевания и пре-клинических испытаний направленных против него препаратов.
Осуществленный подход к МРТ-визуализации молекулярных мишеней (магнитно-резонансная амплификация) имеет перспективы в диагностике и мониторинге лечения различных заболеваний. В частности, применение указанного метода может использоваться для типирования и «молекулярного окрашивания» раковых новообразований in vivo, для проведения испытаний новых анти-ангиогенных препаратов и определения их оптимальных доз.
Исследование ангионеза и анти-ангиогенеза, проведенное в данной работе, имеет большое значение для понимания причин, ведущих к активации этих процессов. Апробация работы
Основные результаты работы были доложены на 11 научных конференциях, в том числе на 5й ежегодной конференции Society for Molecular Imaging (SMI-2005, Кельн), на 2й международной летней школе по медицинской физике («Методы ядерной физики и ускорители в биологии и медицине», Познань, 2003), 8й, 9й и 1 Ой Всероссийских конференциях студентов-физиков и молодых ученых (Екатеринбург, 2002; Красноярск, 2003; Москва, 2004), а также на международных конференциях студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов» (Москва, 2002-2003 гг.). Принят тезис на 14ю международную конференцию International Society for Magnetic Resonance in Medicine (ISMRM-14, Сиэттл, 2006). Был сделан доклад на семинаре ЦМТС МГУ «Магнитный резонанс в биологии, химии и медицине». Публикации
По материалам диссертационной работы было опубликовано 15 печатных работ, в том числе 3 статьи и 2 препринта. Структура диссертации
Работа состоит из введения, обзора литературы с постановкой задачи, описания методик теоретических расчетов и экспериментов, описания результатов, их обсуждения
и выводов, а также списка цитируемой литературы. Диссертация включает 111 страниц текста, 37 рисунков и 11 таблиц. Список литературы содержит 120 наименований. Общее примечание
Особая благодарность выражается профессору Ю.А. Пирогову (директору ЦМТС МГУ им. М.В.Ломоносова), под чьим руководством автор осваивала теорию и методики исследований в области магнитно-резонансной томографии. Автор выражает признательность за все рекомендации и указания, а также поддержку во время выполнения части экспериментов в руководимом им центре. Следует также поблагодарить А.В.Петряйкина и Д.А. Куприянова за комментарии и советы по поводу постановки экспериментов по релаксометрии и фантомным исследованиям. Автор выражает признательность профессору В.А. Твердислову (заведущему каф. биофизики, физический факультет МГУ) за общее руководство работой и ценные замечания. Научная идея использования эффекта магнитно-резонансной амплификации для визуализации молекулярных маркеров-мишеней принадлежит А.А. Богданову мл. Часть данной работы была выполнена под его руководством в Центре по исследованиям в области молекулярной томографии (CMIR) Гарвардской Медицинской Школы (Бостон, США) и в Университете Массачусетса (Вустер, США) во время годичной стажировки автора. Автор выражает личную признательность А. А. Богданову за ценные практические указания при изучении молекулярных маркеров ангиогенеза и онкогенеза и полезные критические замечания по работе. Ощутимую помощь при выполнении данной работы оказали также др. М. Керол (синтез парамагнитных субстратов), Ж-Л. Фигуэрейдо (имплантация клеток в стенку ободочной кишки) и др. Й. Ким (метод измерения объема крови в опухоли, анализ данных).
