Содержание к диссертации
ОГЛАВЛЕНИЕ 2
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5
ВВЕДЕНИЕ 6
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13
1. КЛИНИЧЕСКАЯ КАРТИНА БОЛЕЗНИ ДВИГАТЕЛЬНОГО НЕЙРОНА 13
2. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ЭТИОПАТОГЕНЕЗЕ БОЛЕЗНИ ВИГАТЕЛЬНОГО НЕЙРОНА 15
2.1. ОКСИДАНТНЫЙ СТРЕСС 20
2.1.1. Ген HIF1A как возможный кандидатный ген БДН 24
2.2. ИЗМЕНЕНИЕ ЦИТОСКЕЛЕТА КАК ПРИЧИНА БДН 26
2.2.1. Ген ALS2 28
2.3. ЭКСАИТОТОКСИЧНОСТЬ КАК ОДИН ИЗ ВОЗМОЖНЫХ МЕХАНИЗМОВ ГИБЕЛИ НЕЙРОНОВ ПРИ БДН 32
2.3.1. Транспортёры глутамата 35
2.3.1.1. Транспортер глутамата ЕААТ2 35
2.3.2. Рецепторы глутамата в патогенезе БДН 37
2.3.2.1. Ген ионотропного глутаматного рецептора GRIA1 38
2.3.2.2. Ген ионотропного глутаматного рецептора GRIA2 39
2.4. СИСТЕМА ДЕТОКСИКАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ КАК МОДУЛЯТОР ПОВРЕЖДАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ФАКТОРОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ В РАЗВИТИИ БДН 2.4.1. Гены первой фазы детоксикации. Цитохромы Р-450 43
2.4.1.1. Ген цитохрома CYP2E1 45
2.4.1.2. Ген цитохрома CYP2D6 47
2.4.2. Гены второй фазы детоксикации 49
2.4..2.1. Ген глутатион-Б-трансферазы GSTM1 50
2.4.2.2. Ген глутатион-Б-трансферазы GSTT1 52 2.4.2.3. Ген глутатион-8-трансферазы GSTP1 52
2.4.2.4. Ген N-ацетилтрансферазы NAT2 54
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 56
I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ 56
II. МОЛЕКУЛЯРНО- ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 57
1. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК из КЛЕТОК КРОВИ ЧЕЛОВЕКА 57
2. ПОСТАНОВКА ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР) 57
3. ВВЕДЕНИЕ РАДИОАКТИВНОЙ МЕТКИ В ПРАЙМЕРЫ ДЛЯ ПЦР АМПЛИФИКАЦИИ 63
4. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ 4.1. Исходные растворы для проведения электрофореза 64
4.2. SSCP анализ 64
4.3. DGGE анализ 65
4.4. Определение нуклеотиднои последовательности ДНК. 65
5. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИИ АНАЛИЗ МУТАЦИЙ И ПОЛИМОРФНЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНОВ 66
5.2. Анализ IVS9-675 С А полиморфизма гена HIF1А 66
5.3. Анализ полиморфизма гена CYP2D6. 67
5.4. Анализ полиморфизма гена CYP2E1 67
5.5. Анализ полиморфизма генов глутатион-$-трансфераз Ml и ТІ.. 68
5.6. Анализ полиморфизма гена GSTP1 69
5.7. Анализ полиморфизма гена NAT2 69
5.8. Анализ полиморфизма гена ЕААТ2 71
5.9. Анализ полиморфизма гена GRIA1 71
6.0. Анализ полиморфизма гена GRIA2 71
III. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ 72
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 74
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ 74 2. ОЦЕНКА ВКЛАДА МУТАЦИЙ В ГЕНЕ ALS2 в ПАТОГЕНЕЗ СПОРАДИЧЕСКОЙ ФОРМЫБДН 76
3. АНАЛИЗ IVS9-675 ОА ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА HIF1А 78
4. АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМА G603A ТРАНСПОРТЁРА ГЛУТАМАТА ЕААТ2 80
5. АНАЛИЗ ИНТРОННОГО ПОЛИМОРФИЗМА АМРА - ГЛУТАМАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ 83
6. АНАЛИЗ ИНСЕРЦИОННОГО ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА CYP2E1 86
7. АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА CYP2D6 89
8. АНАЛИЗ ПОЛИМОРФНЫХ МАРКЕРОВ ГЕНОВ ГЛУТАТИОН-8-ТРАНСФЕРАЗ Ml и ТІ 93
9. АНАЛИЗ ILE 105 VAL ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА GSTP1 97
10. АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА NAT2 101
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 103
ВЫВОДЫ 107
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 109
Введение к работе
Последнее десятилетие ознаменовано стремительным прогрессом в области молекулярной генетики человека, которое обусловлено появлением целого ряда новейших технологий и полным секвенированием генома человека. Это способствовало значительному прогрессу в понимании природы многих заболеваний человека. В первую очередь это касается моногенных заболеваний, которых на сегодняшний день известно более 5000. Для большинства из них осуществлено картирование генов на хромосомах, их клонирование, анализ структуры, а также описаны вызывающие развитие заболевания мутации. Накопление информации о природе моногенных наследственных заболеваний позволило вплотную подойти к анализу так называемых сложных заболеваний, имеющих мультифакториальную природу - то есть зависящих как от генетических факторов, так и от факторов внешней среды (4,14).
Особое место в работах по изучению роли генома в патологических процессах занимают заболевания нервной системы, так как их изучение не только позволит разработать принципиально новые подходы к их диагностике и лечению, но и даст возможность выявить фундаментальные принципы функционирования нервной системы человека на разных уровнях ее организации - от клеточного до уровня целостного организма (13).
К числу таких тяжелых неврологических патологий относится болезнь двигательного нейрона (БДН). Это группа нейродегенеративных заболеваний, для которых характерна прогрессирующая избирательная гибель мотонейронов головного и спинного мозга. БДН обычно развивается на фоне полного здоровья и за несколько лет приводит к тяжёлой инвалидизации и фатальному исходу (130). Заболеваемость БДН в мире в среднем составляет 3-7 на 100 тыс. человек в год, при этом в последнее время отмечены тенденции к росту частоты встречаемости БДН во всех возрастных группах. В основном заболевание носит спорадический характер, но в 5-10% случаев выявляется положительный семейный анамнез (103).
На сегодняшний день выделяют несколько наиболее вероятных причин развития заболевания - оксидантный стресс, изменения структуры цитоскелета, эксайтотоксичность, а также нарушения процессов детоксикации ксенобиотиков (103).
Одним из важнейших звеньев патогенеза заболевания считают оксидантный стресс (60). Это повреждающее действие, которое оказывают на клетки свободные радикалы вследствие увеличения их продукции, ослабления ферментативных механизмов антиоксидантной защиты либо сочетания этих факторов. В связи с этим, особый интерес представляют гены, продукты которых участвуют в сложном обмене активных форм кислорода в клетке. В первую очередь к ним относятся гены, кодирующие медь-цинк зависимую супероксиддисмутазу (SOD1) и фактор, индуцируемый при гипоксии HIF-la (HIF1A). О роли оксидантного стресса в патогенезе БДН говорит также тот факт, что у примерно четверти больных с семейной формой БДН и у 5-7% спорадических больных причиной заболевания являются мутации в гене SOD1. Так, в российской популяции у больных со спорадической формой БДН были выявлены две мутации в гене SOD1 - G12R и D90A. Но частота их встречаемости у больных БДН не превышает 4% (15).
При БДН наблюдается нарушение структуры цитоскелета мотонейронов (51), страдает система аксонального транспорта и трофики. Одним из доказательств роли белков цитоскелета в патогенезе БДН является выявление ассоциации между риском развития заболевания и полиморфизмом в кодирующей области гена тяжелой цепи нейрофиламентов и обнаружение очень редких мутаций в этом гене у больных БДН (15). Поэтому представляет интерес изучение и других белков, участвующих в формировании цитоскелета. В связи с этим особый интерес представляет ген ALS2, белковый продукт которого может играть важную роль в сигнальных путях клетки, внутриклеточном транспорте и организации цитоскелета, в частности, регуляции сборки микротрубочек (30). Ранее было показано, что мутации в этом гене приводят к развитию аутосомно-рецессивной ювенильной формы БДН. Это позволяет предположить, что ген алейна может играть роль в патогенезе классической спорадической формы БДН.
Детоксикация ксенобиотиков является одним из ключевых метаболических процессов в организме. Нарушения этого процесса могут приводить к развитию различных заболеваний, в том числе и нейродегенеративных. Рядом авторов уже отмечена ассоциация полиморфизмов некоторых генов системы детоксикации с развитием болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, БДН. Но такие исследования являются единичными и многие гены, белковые продукты которых вовлечены как в фазу активации, так и в фазу нейтрализации ксенобиотиков, ещё не были проанализированы у больных нейродегенеративными заболеваниями. Необходимо также подчеркнуть важность учета этнического фактора в ассоциативных исследованиях и даже в случае выявления ассоциации между ДНК маркером и заболеванием в одной популяции необходимо ее подтверждение в других, относящихся к разным этническим группам и популяциям. Исходя из важности роли в процессе детоксикации особый интерес для исследования представляют цитохромы CYP2E1 и CYP2D6, ферменты глутатион- S-трансферазы ТІ, Ml, PI, а также N-ацетилтрансфераза (93).
На сегодняшний день считается, что в механизмах гибели мотонейронов при нейродегенеративных заболеваниях, принимают участие процессы глутаматной эксайтотоксичности. Однако на молекулярно-генетическом уровне роль этих процессов в развитии нейродегенеративных заболеваний практически не исследована - хотя полученные с использованием трансгенных животных данные и указывают на важность глутаматной эксайтотоксичности в гибели нервных клеток. Особый интерес представляют белок ЕЕАТ2, связанный с обратным транспортом глутамата, и ионотропные рецепторы глутамата GRIA1 и GRIA2(1,33).
В связи с этим целью настоящей работы было молекулярно-генетическое исследование ассоциации болезни двигательного нейрона с генами, белковые продукты которых влияют на реакцию организма на оксидантный стресс, глутаматную эксайтотоксичность, функционирование цитоскелета мотонейронов и активность ферментов первой и второй стадий детоксикации ксенобиотиков.
В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи исследования:
1. Провести поиск мутаций в кодирующей области и участках экзон-интронных соединений гена алейна (ALS2).
2. Провести анализ IVS9-675 ОА полиморфизма гена индуцируемого гипоксией фактора 1 (HIF1A).
3. Провести анализ полиморфизмов генов глутаматэргической системы: G603A гена транспортёра глутамата ЕААТ2, rs545098 и rs9307959 генов ионотропных рецепторов глутамата GRIA1 и GRIA2.
4. Исследовать полиморфизмы генов, белковые продукты которых принимают участие в процессах детоксикации ксенобиотиков: инсерционный полиморфизм гена этанол-индуцибельного цитохрома Р-450 (CYP2E1), CYP2D6 4 полиморфизм гена дебризоквин-4-гидролазы (CYP2D6), делеционный полиморфизм генов глутатион-Б-трансферазы ТІ, Ml и PI (GSTT1, GSTM1, GSTP1), полиморфизм гена ариламин-М-ацетилтрансферазы(ЫАТ2). 5. Провести анализ ассоциации полиморфных вариантов
изученных генов с основными клиническими характеристиками заболевания: диагнозом и вариантом заболевания, типом прогрессирования, возрастом начала заболевания. Для изучения вклада генетической составляющей в патогенезе БДН будут использованы методы ассоциативного анализа, основанные на исследовании полиморфных вариантов генов-кандидатов в выборках больных и случайных контрольных выборках по типу случай-контроль с учетом пола, возраста и этнического происхождения больных БДН. (4). Научная новизна
В группе больных БДН из России проведен молекулярно-генетический анализ полиморфных вариантов ряда кандидатных генов заболевания и выявлен ряд ассоциаций между генетическим полиморфизмом, риском развития БДН и клиническим течением заболевания.
Обнаружено, что в российской популяции развитие спорадической формы БДН не связано с мутациями в кодирующей области гена ALS2.
Впервые показано, что генотип 1С/ 1С гена CYP2E1 ассоциирован с шейным дебютом БДН, а инсерционный генотип ID/ID коррелирует с более тяжелыми формами БДН, такими как БДН с грудным и диффузным дебютами и прогрессирующим бульбарным параличом.
Показано, что наличие мутантного аллеля CYP2D6 4 гена CYP2D6 ассоциировано с возрастом начала заболевания БДН в российской популяции.
Выявлено снижение частоты «нулевого» генотипа гена GSTM1 в группе больных БДН, что указывает на то, что нулевой аллель этого гена при БДН может играть роль протективного фактора. Обнаружено, что присутствие аллеля GSTP B гена GSTP1 коррелирует с сегментарно-ядерным и пирамидным вариантами вовлечения мотонейронов, в то время как аллель дикого типа GSTP1 A ассоциирован с классической вовлечённостью мотонейронов.
Изучение полиморфных вариантов генов индуцируемого гипоксией фактора 1, транспортёра глутамата ЕААТ2, ионотропных глутаматных рецепторов GRJA1 и GRIA2, глутатион-Б-трансферазы типа ТІ GSTT1, а также N-ацетилтрансферазы не выявило ассоциации с развитием БДН у больных из России.
Практическая значимость
Результаты, полученные в ходе проведения работы, вносят вклад в рассмотрение проблемы этиологии БДН с точки зрения изучения генетических факторов риска развития заболевания. В дальнейшем это может быть использовано для разработки молекулярно-генетических методов, позволяющих в будущем выявлять лиц с повышенным риском развития болезни двигательного нейрона и начинать направленную профилактику заболевания на доклинической стадии.
Положения, выносимые на защиту
1. В кодирующей области и участках экзон-интронных контактов гена ALS2 у больных спорадической формой БДН из России обнаружены однонуклеотидные полиморфные сайты в интронах гена и не выявлены патогенетически значимые мутации.
2. Инсерционный полиморфизм гена CYP2E1 коррелирует с клиническим типом заболевания. Так, генотип 1С/1С ассоциирован с шейным дебютом БДН, а инсерционный генотип ID/ID коррелирует с более тяжелыми формами БДН. Гомозиготность по CYP2E1 1D аллелю ассоциирована с повышенным риском развития БДН в российской популяции.
3. Наличие гомозигот по аллелю CYP2D6 4 гена CYP2D6 ассоциировано с более ранним развитием заболевания у больных БДН из России.
4. Полиморфные варианты генов индуцируемого гипоксией фактора 1, транспортёра глутамата ЕААТ2, ионотропных глутаматных рецепторов, глутатион-8-трансферазы типа ТІ (GSTT1), а также N-ацетилтрансферазы не ассоциированы с развитием болезни двигательного нейрона у больных из России.
5. В группе больных БДН выявлено снижение частоты генотипа GSTM1 0/0. При болезни двигательного нейрона нулевой аллель этого гена играет роль протективного фактора.
6. Ilel05Val полиморфизм гена GSTP1 коррелирует с вариантами вовлечённости в патологический процесс мотонейронов. Присутствие аллеля GSTP B гена GSTP1 коррелирует с сегментарно-ядерным и пирамидным вариантами вовлечения мотонейронов, в то время как аллель дикого типа GSTP1 A ассоциирован с классической вовлечённостью мотонейронов.
