Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Оценка функционального состояния модельных н природных гидроэкосистем 12
1.1. Показатели разнообразия и стабильности гидроэкосистем 12
1.2. Биотестирование токсичности, тест-объекты и биологические показатели 15
1.3. Методы оценки функционального состояния активных илов 22
и иммобилизованных временных сообществ микроорганизмов в процессе очистки сточных вод
1.4. Перспективы энзимоиндикации в системе биологического контроля 25
1.5. Иммобилизация микроорганизмов - деструкторов на синтетических носителях. Новые химико-экологические процессы 30
1.6. Технологические параметры и эффективность работы сооружений биологической очистки сточных вод иммобилизованными микроорганизмами
Часть 2. Собственные исследования 39
Глава 2. Материал и методы исследования 39
2.1. Дезинтеграция клеток активного ила и иммобилизованных микроорганизмов. Подготовка ферментных образцов 40
2.2. Электрофорез. Оборудование и реактивы
2.3. Методы выявления изомерных форм ферментов. Определение 43
общей активности ферментов и относительной активности изоферментов. Денситометрия.
Глава 3. Технологический контроль процессов биологической очистки сточных вод по изменению активности изоферментов малатдегидрогеназы активных илов и иммобилизованных микроорганизмов
Глава 4. Структурные особенности и динамика активности изоферментов L-глутаматдегидрогеназы активного ила и иммобилизованных микроорганизмов на действующих сооружениях биологической очистки сточных вод
Глава 5. Активность каталазы и ее изоферментов в процессе очистки сточных вод активным илом и иммобилизованными микроорганизмами 85
Глава 6. Биомониторинг активных илов и иммобилизованных микроорганизмов. Функциональная взаимосвязь дегидроге-наз и каталазы микросообществ модельных гидроэкосистем. Обсуяедение результатов 97
Выводы 113
Список литературы 115
Приложения 1-3 152
- Биотестирование токсичности, тест-объекты и биологические показатели
- Иммобилизация микроорганизмов - деструкторов на синтетических носителях. Новые химико-экологические процессы
- Дезинтеграция клеток активного ила и иммобилизованных микроорганизмов. Подготовка ферментных образцов
- Биомониторинг активных илов и иммобилизованных микроорганизмов. Функциональная взаимосвязь дегидроге-наз и каталазы микросообществ модельных гидроэкосистем. Обсуяедение результатов
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ. Неуклонное увеличение использования: водных ресурсов сопровождается возрастающим влиянием антропогенных факторов на режим водоемов и водные экосистемы. Прогнозы интенсивности водопо-требления показывают, что антропогенный пресс на гидроэкосистемы будет продолжаться и в отдаленной перспективе может привести к непредвиденным последствиям. Биологическая очистка городских и промышленных сточных вод практически во всех странах мира на 90% производится в аэро-тенках . Городские станции аэрации и сооружения биологической очистки сточных вод промышленных производств в середине прошлого столетия были единственной преградой глобального загрязнения внешних и внутренних водоемов планеты. Однако уже через 20—30 лет интенсивной эксплуатации аэротенков возникли серьезные проблемы, касающиеся утилизации избыточного активного ила. Огромные площади земли изъяты из оборота в связи с шламированием отработанного активного ила, который зачастую содержит недоокисленные адсорбированные соединения органического и неорганического характера с различной степенью токсичности. Проблема усугубляется проникновением недоокисленных соединений в верхние горизонты: подземных вод и угрозой попадания в скважинные воды.
В настоящее время в лабораторных, опытно-промышленных и промышленных испытаниях показана, возможность и перспективность биологической очистки городских и промышленных сточных вод иммобилизованной на синтетических волокнах микрофлорой в анаэробно-аэробных условиях [24, 76, 77, .125]. Разработанные методы внедряются в различных регионах России, в том числе и в Поволжье. Перспективность метода заключается в том, что снимается основная проблема биологической очистки в аэротен-ках- отсутствие избыточного активного ила и исключение шламирования и лов. Иммобилизованное на синтетических волокнах временное сообщество микроорганизмов в итоге представляет собой смешанную популяцию бакте- рий; простейших, грибов, коловраток и водорослей, образующих пищевую цепь. Во временном сообществе образуется несколько трофических уровней: первый представлен гетеротрофными бактериями, высокая окислительная способность которых обуславливает их ведущую роль в биодеградации загрязнителей; на втором уровне находятся жгутиконосцы, ресничные инфузории и коловратки; третий уровень представлен сосущими инфузориями. Количество организмов каждого трофического уровня зависит от таких факторов, как состав поступающей сточной воды, температуры , рН , концентрации кислорода и др. В зависимости от технологических параметров образуется замкнутая модельная гидроэкосистема - биореактор.
Опыт эксплуатации биореакторов в ПО " Самаранефтеоргсинтез" показал, что эффективность их работы зависит от многочисленных факторов, из которых следует выделить кислородный режим. Большинство разработанных методов биологической очистки сточных вод иммобилизованным ценозом на синтетических носителях предполагает анаэробно-аэробные условия с преобладанием анаэробных процессов окисления загрязнителей. Эксплуатация биореакторов в названных условиях не привела к успеху, поскольку зачастую вода на выходе из биореактора по многим показателям не соответствовала состоянию очищенной для сброса в водоемы.
В настоящее время принято считать, что устойчивость природных и модельных гидроэкосистем обеспечивается видовым разнообразием входящих в них сообществ гидробионтов, особенно микроорганизмов [80]. Многолетние наблюдения за гидроэкосистемами показали, что в результате кратковременного мощного антропогенного воздействия, приводящего зачастую к метаболическому шоку, гидроэкосистемы в течение 24-48 часов по многим параметрам достигают исходного функционального состояния, при этом увеличения видового разнообразия не происходит. Эти данные приводили к мысли о том, что в экстремальных ситуациях устойчивость гидроэкосистем достигается каким-то иным путем, в частности, увеличением разнообразия эндо- и экзометаболитов и, как следствие, структурной реорганизацией клю- чевых олигомерных ферментов метаболизма. Первое предположение нашло экспериментальное подтверждение, рядом авторов показано существование прямой зависимости жизнеспособности морских и пресноводных сообществ от концентрации внеклеточных органических соединений [80, 99, 115, 119, 293]. Второе же предположение остается практически неизученным и открытым. Бесспорно, взаимодействие многочисленных факторов при формировании гидроэкосистем связано с огромным числом сложных и разнообразных биохимических метаболических реакций. На каком-то этапе дальнейшее развитие биохимической экологии будет лимитировано уровнем знаний данного вопроса.
Применяемые в настоящее время традиционные методы определения и контроля функционального состояния модельных и природных гидроэкосистем не дают исчерпывающей информации о молекулярных и субмолекулярных механизмах стабилизации последних. В связи с этим особое значение приобретают исследования, направленные на изучение состава олигомерных форм ключевых ферментов метаболизма в сообществах гидроэкосистем, их роли в реанимации при техногенных, особенно экстремальных воздействиях на водные экосистемы. До сих пор неизвестны механизмы выхода гидроэкосистем в относительно короткие промежутки времени из глубочайших стрессовых ситуаций, достигается ли при этом исходный функциональный статус или экосистемам наносится какой-то "биохимический ущерб".
В то же время, для организации непрерывного биомониторинга природных и модельных гидроэкосистем, в частности, процессов биологической очистки воды в аэротенках и биореакторах, требуются надежные, информативные способы оценки функционального состояния водных сообществ, характеризующие процессы метаболизма и окислительную мощность сооружений биологической очистки в целом.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ; Исследовать эколого-биохимические- стратегии ответных реакций микроорганизмов активного ила и иммобилизованной микрофлоры на воздействие техногенных загрязнений в различных технологических режимах и" роль в этих процессах молекулярных форм оксидоре- дуктаз.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
1... Изучить структурно-функциональные особенности малатдегидрогена-зы (МДГ, К.Ф. 1.1.1.37) активного ила и иммобилизованной микрофлоры при различных режимах биологической очистки коммунально-бытовых и техногенных сточных вод.
Изучить структурно-функциональные особенности глутаматдегидроге-назы (ГДГ, К.Ф. 1.4.1.2) активного ила и иммобилизованной микрофлоры при различных режимах биологической очистки коммунально-бытовых и техногенных сточных вод.
Изучить структурно-функциональные особенности каталазы ( К.Ф. 1.11.1.6 ) активного ила и иммобилизованной микрофлоры при различных режимах биологической очистки коммунально-бытовых и техногенных сточных вод.,
Разработать способы биомониторинга очистки сточных вод в аэротен-ках и биореакторах по динамике активности и составу изомерных форм исследуемых ферментов, характеризующих функциональное состояние активных илов и иммобилизованных временных сообществ микроорганизмов.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
1. При воздействии загрязнителей различного состава одним из факторов стабилизации временных сообществ активного ила и иммобилизованной микрофлоры в фазе лог-роста и стационарной фазе развития яв- ляется увеличение количества олигомерных ферментов окислительного метаболизма. Обнаружение каталитически активных протомеров и субъединиц оксидоредуктаз в водной среде обусловлены нарастанием разнообразия экзометаболитов как в моделях активного ила, так и на действующих сооружениях биологической очистки и направлены на усиление гомеостаза и стабилизацию временных сообществ микроорганизмов.
Преимущественная роль в механизмах адаптации,; реанимации и стабилизации модельных временных сообществ микроорганизмов, функционирующих в нормальном технологическом режиме биологической очистки и в экстремальных условиях, принадлежит низкомолекулярным формам ключевых ферментов метаболизма гидробионтов-каталитически активным протомерам и субъединицам. Следствием залповых сбросов высокотоксичных промышленных стоков является блокирование мембранных систем энергообеспечения клеток активного ила и иммобилизованной микрофлоры. В таких условиях срабатывают механизмы компенсаторной биохимической адаптации, заключающиеся в мобилизации ферментов окислительного метаболизма и экспресс биосинтезе активных субъединиц молекулярных форм ферментов, выполняющих роль "реаниматоров".
Активность олигомерных форм исследуемых ферментов в большей мере подвержена ингибированию при нарушениях технологического режима и действии токсичных сточных вод и их компонентов
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые получены сведения о структурной организации малатдегидрогеназы, глутаматдегидрогеназы и катал азы активных илов и иммобилизованных на синтетических волокнах временных сообществ микроорганизмов, используемых для биологической очистки промышленных и коммунально-бытовых стоков.
Установлена зависимость набора олигомеров и пртомеров исследуемых ферментов от режима процессов биологической очистки.
Определено, что структурная организация и динамика активности изоэнзимов исследуемых ферментов в процессе очистки бытовых и промышленных сточных вод является результирующим окислительно-восстановительных реакций, характеризующих потребность экосистемы в субстратах.
Впервые установлено увеличение числа изоферментов и молекулярных форм исследуемых ферментов в условиях лимитирования процессов биологической очистки кислородом.
Впервые показана перспективность метода диск-электрофореза в гидробиологии, позволившего разработать систему экспрессных, высокоинформативных, интегральных способов биомониторинга модельных гйдроэкоси-стем по динамике изменения активности и набора изоферментов и каталитически активных протомеров некоторых ключевых ферментов окислительного метаболизма.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Полученные результаты позволяют пересмотреть подходы к практической реализации биологической очистки сточных вод промышленных производств активным илом и иммобилизованными временными сообществами микроорганизмов. Информация о структурной организации и динамике активности изоферментов исследуемых оксидоредуктаз дает возможность оперативно управлять процессами биологической очистки в аэротенках и биореакторах на всех стадиях.
Полученные данные позволяют провести коррекцию технологии очистки воды в биореакторах, функционирующих в режиме анаэробно-аэробного метаболизма. Коррекция технологии очистки, предполагающая преобладание аэробных процессов метаболизма над анаэробными приводит к стабилизации гидроэкосистемы и, в целом, к значительному улучшению показателей работы биореакторов.
Разработаны и предлагаются к практическому использованию способы биомониторинга модельных гидроэкосистем по изменению активности и набора изоферментов малатдегидрогеназы и глутаматдегидрогеназы иммобилизованных микроорганизмов. Способы отличаются экспрессностью (в модифицированном варианте 2 часа), точностью и воспроизводимостью, могут быть использованы в практике охраны окружающей среды службами биомониторинга.
Материалы диссертационного исследования используются в учебном процессе при проведении практических занятий со студентами и клиническими интернами на кафедре общей гигиены, кафедре клинической фармакологии и профессиональной патологии, кафедре химии фармацевтического факультета в курсе токсикологической химии, кафедре общей, бионеорганической и биоорганической химии Самарского государственного медицинского университета; на кафедре водоснабжения и канализации Самарской строительной академии.
Основные положения диссертации доложены на 2-ой международной научной конференции "Экология и здоровье человека" ( Самара, 1995), на конференции биохимиков Урала, Поволжья и Западной Сибири ( Челябинск, 1999), на международной научно-практической конференции "Экология и жизнь"( Пенза, 1999), на международной научно-практической конференции " Хозяйственно-питьевая и сточные воды: проблемы очистки и использования" ( Пенза 2000), на VII Всероссийском конгрессе "Экология и здоровье человека. (Самара,2001), на Всероссийской конференции "Компенсаторно-приспособительные процессы, фундаментальные и клинические аспекты" ( Сибирское отделение РАМН, Новосибирск, 2002).
По материалам диссертации опубликовано 8 работ.
Биотестирование токсичности, тест-объекты и биологические показатели
Разнообразие откликов живых систем на ухудшение условий среды представляет исследователям широкий спектр методов и подходов для оценки последствий загрязнения водных экосистем. Биомониторинг осуществляется на биоценотическом, популяционном, организменном, клеточном и молекулярном уровнях. Учитывая важность в мониторинге экосистем традиционных гидробиологических методов, следует признать их трудоемкость и недостаточную экспрессность. Информативность методов физиологии, биофизики и, особенно, биохимии может быть выше методов популяционной экологии, поэтому проблемы мониторинга и прогноза состояния водных экосистем требуют привлечения методов других наук. Возникающие нарушения на: клеточном и молекулярном уровнях регистрируются оперативнее, с большей достоверностью и при меньшем отклонении экологического режима от нормы, чем на популяционном и биоценотическом уровнях. Начальные процессы нарушения жизнедеятельности гидробионтов на уровне основных путей метаболизма могут быть зафиксированы высокочувствительными методами молекулярной биологии и биохимии.
Анализ литературы показывает, что наибольшее число исследований проводится на организменном уровне, преимущественно в экспериментальных условиях. В качестве тест-объектов используют представителей систематических групп - от простейших до высших водных растений.
В основном эксперименты направлены на изучение выживаемости тест-объектов при действии высоких концентраций токсикантов [67,97], Необходимо отметить что тест выживаемости для: биомониторинга гидроэкосистем мало эффективен, поскольку в естественных водных системах концентрации токсикантов» значительно ниже вызывающих смертность тест-организмов.
Изменение поведенческих реакций гидробионтов в ответ на загрязнение воды может быть использовано для характеристики степени токсичности поллютантов. Так, например, регистрация двигательной и фильтрационной активности моллюсков, движение створок в среде загрязнителя характеризует его агрессивность [42, 64,90, 284]. Известны методы автоматической регистрации и контроля механических движений рыб и моллюсков для мониторинга сточных вод химических предприятий [106]. Значительное число работ посвящено исследованшо патологии; эмбриогенеза как наиболее чувствительной стадии развития беспозвоночных и рыб в присутствии токсикантов [17, 236]. Оценку загрязнения гидроэкосистем авторы предлагают проводить по регистрации морфологических аномалий в строении эмбрионов и личинок водных беспозвоночных [105, 307].
Некоторые физиологические параметры жизнедеятельности водных организмов могут дать более полную информацию о характере действия сточных вод и их компонентов, а именно: изменение роста, деятельность пульсирующей вакуоли простейших, хемо- и фототаксис [31, 86].
Особое место в мониторинге процессов очистки сточных вод и их сбросе в водоемы занимает " рыбная проба.". Рыбы являются завершающим звеном трофических цепей в водоемах и аккумулируют все те изменения, которые происходят на низшей ступени экологической пирамиды и содержат интегральную информацию о направлениях трансформации водных систем. Представляют интерес публикации, посвященные исследованию токсикантов и сточных вод по изменению ритма сердца у рыб, частоты дыхательных движений, крови [108, 139]. Авторами предлагается установка для одновременной регистрации интенсивности газообмена, электропневмограммы и электрокардиограммы у рыб, позволяющая оценивать функциональное состояние гидробионтов в условиях нахождения в сточных водах различных производств [53].
Водоросли являются первичными продуцентами органического вещества и наряду с бактериями им принадлежит ведущая роль в процессах самоочищения водоемов. Именно поэтому в литературе представлен довольно обширный материал по использованию водорослей в качестве тест-объектов [68, 104]. Исследовали влияние хлора и меди на скорость погружения! водоросли Scenedesmus aquminatus [261], делается вывод о возможности применения в качестве альгологического биотеста остановка движения клеток Dunaliella salina [112]. Для оценки степени токсичности различных загрязнителей предлагается электрофизиологический метод автоматической регистрации изменений мембранного потенциала харовой водоросли [144], авторы характеризуют метод как надежный, экспрессный и информативный. Сообщается о возможности использования болотного мха для оценки токсичности тяжелых металлов [220].
Авторы представляют метод, основанный на подавлении прорастания семян высших растений [65], а также скорость движения хлоропластов у Vallisneria spiralis для токсикологической оценки речных вод [107]. Однако для более детальной характеристики влияния речных вод на растительные клетки необходима калибровка биотеста по эталонным токсикантам.
В экспериментах довольно часто используются ветвистоусые рачки дафнии, a Daphnia magna стала практически универсальным тест-объектом [50]. Исследования показывают, что Daphnia magna чувствительна к широкому ряду токсикантов, причем, эксперименты с популяциями дафний намного экономичнее, чем с рыбой. Предлагается использование принципа функциональной биотической нагрузки при токсикологических исследованиях гидроэкосистем [21]. О загрязнении окружающей среды: тяжелыми металлами судят по накоплению их различными организмами, в частности, мидиями [69], высшими водными растениями [51] и озерным планктоном [150] . При определении токсичности сточных вод и их компонентов в качестве тест-объектов используют креветок [289], губок [12], пиявок и других гидробионтов [19], которые в разной мере чувствительны к наличию токсикантов в воде.
К числу перспективных показателей загрязнения водных экосистем можно отнести микробиологические методы исследования. Микроорганизмы как индикаторы выгодно отличаются своей; скоростью размножения, быстротой наращивания биомассы, высокой чувствительностью к изменениям среды и разнообразными ответными реакциями. Последние могут быть использованы для нормирования антропогенных нагрузок на водоемы. Микробиота - существенный компонент экосистем, выполняющий функции стабилизации и сохранения естественной способности природной среды к самоочищению. Нарушение деятельности микроорганизмов может привести к ацикличности биогеохимических процессов и экологическим срывам.
Иммобилизация микроорганизмов - деструкторов на синтетических носителях. Новые химико-экологические процессы
Одной из основополагающих задач биологической очистки сточных вод иммобилизованными микроорганизмами является выбор приемлемого способа иммобилизации, обеспечивающего сохранение биохимической активности микроорганизмов в отношении загрязненной воды и предотвращение их выноса из биореактора. Наиболее часто используются четыре типа иммобилизации — адгезия, химическое прикрепление клеток к носителю с помощью бифункциональных, реагентов, механическое включение клеток в гели и электроудерживание-обратимая поляризация клеток на носителях при наложении электрического поля [25, 26]. Из них, по мнению многих исследователей, наиболее перспективными являются первые три..
Включение клеток в полимерные гели является довольно дорогостоящим методом, сложным в техническом исполнении, требующим специального подбора условий иммобилизации [22, 60, 100]. При этом слабая проницаемость гелевых капсул ухудшает обеспечение клеток питательными веществами и угнетает их биохимическую активность при длительном культивировании. После включения: микроорганизмов пластическая прочность гелей резко снижается, а применение сшивающих реагентов может привести к гибели клеток [297].
Химическое прикрепление клеток на носители посредством активирования реагентами является наиболее часто используемым методом иммобилизации. При этом применяют соли олова, титана, кальция, изоцианаты, глу-таровый альдегид и другие реагенты [6 , 258]. Перечисленные соединения не являются токсичными для иммобилизованных микроорганизмов только в узком диапазоне концентраций и значений рН. По утверждению многих авторов указанные методы применимы в основном для конкретных условий и одностадийных процессов трансформации органических соединений чистыми культурами [76].
Методы иммобилизации микроорганизмов на носителях должны быть универсальными, максимально простыми, относительно недорогими и при этом обеспечивающими удерживание клеток на поверхности носителя в экстремальных условиях. Таким требования удовлетворяет иммобилизация клеток путем адгезии — прилипание к носителю за счет коллоидно-химических и микробиологических процессов [274, 275]. По мнению многих исследователей, большинство микробных клеток представляет собой гидрофильные коллоидные частицы, несущие отрицательный заряд в физиологической области рН. Природные сорбенты в этих условиях также заряжены отрицательно и имеют гидрофильную поверхность [29]. Эти препятствия снимаются за счет подавления электростатического барьера поверхности сорбента растворами солей алюминия, железа, кальция, а также обработки растворами указанных реагентов суспензии микроорганизмов [78, 170, 251]. Процесс взаимодействия микроорганизмов с поверхностью носителя,, как правило, двухстадийный — стадия быстрой обратимой сорбции и стадия медленной необратимой сорбции. Вторая стадия завершается образованием активной микробной биопленки [128, 238].
Не менее важным этапом обеспечения оптимальной работы биореактора с применением иммобилизованных микроорганизмов является подбор носителя. В этом направлении в настоящее время проводится напряженная работа. Авторами предлагается большое количество сорбирующих материалов для фиксации микроорганизмов. Среди них необходимо отметить древесную кору, опилки, керамику, успешно применяемые для деградации соединений фенола. Отмечена трансформация соединений мышьяка микроорганизмами, иммобилизованными на древесных стружках [49], проведены исследования способности связывания кислых продуктов метаболизма мрамором, известняком, доломитом-сорбентами, имеющими щелочную реакцию в водной среде [224]. Значительное число работ посвящено исследованиям окисления углеводородов на поверхности цеолитов, активированного угля [189, 226, 305], эти эксперименты нашли практическое применение в процессах биологической очистки бытовых сточных вод. Работы, посвященные решению проблем денитрификации городских сточных вод привели к выводу, что в качестве носителей микроорганизмов можно использовать гидролизованные опилки и полихлорвиниловые гранулы [171].
Хорошие результаты очистки сточных вод нефтехимических производств, сточных вод, загрязненных поверхностно-активными веществами, соединениями цинка, азота, фосфора, тиосульфатов получены при использовании в качестве носителей материалы из стекловолокна [127, 177]. Исследования проводили на стеклоершах, вспененном стекле и стеклоткани, удаление загрязнителей достигалось от 80 до 95% по значениям химического потребления кислорода (ХПК) [54]. В ряде работ для сорбции микроорганизмов рассматривается возможность применения разнообразного гранулированного 1 материала, в частности, для получения гранулята предлаганотся полимеры в чистом виде и с добавками [147]. Материалы обеспечивают прочное удерживание и. эффективное развитие иммобилизованных микроорганизмов. При этом степень изъятия загрязнителей из промышленных и бытовых сточных вод достигается до 98-99%.
Интересны, на наш взгляд, работы, посвященные использованию в биореакторах в качестве носителей гранулированные биологические материалы, в частности, гранулированный активный ил. Гранулы обладают повышенной устойчивостью к резким перепадам нагрузок, при этом значительно уменьшается вынос биомассы из реактора, эффективность очистки по сравнению с активным илом возрастает [291].
Рядом авторов для адсорбции микроорганизмов предлагаются различные полимерные материалы, такие как поливиниловый спирт, полипропилен, поликапроамид, полиэтилентерефталат [63, 140, 246], поливинилфториды [215], полиуретан [239], поливинилхлорид [179] и другие полимерные материалы [32]. Степень удаления загрязнений различного происхождения достигается от 90% до практически полной их деструкции.
Дезинтеграция клеток активного ила и иммобилизованных микроорганизмов. Подготовка ферментных образцов
Первым и наиболее важным этапом при получении микробных клеточных и бесклеточных препаратов является дезинтеграция клетки. Она предшествует фракционированию, очистке извлекаемых структур и во многом предопределяет биохимическую активность, морфологическую интакт-ность выделяемых субклеточных структур, органелл и индивидуальных биополимеров клетки.
В настоящее время для дезинтеграции микроорганизмов используется свыше ста различных физических, механических, химических, эн-зимологических, биологических методов и их модификаций. Такое разнообразие и изобилие методов не только не облегчает, но и осложняет проблему рационального выбора адекватных способов дезинтеграции и их оптимизацию. Из физических методов наибольшее распространение получило разрушение клеток в прессах высокого давления, ультразвуковыми и звуковыми волнами, недостатком которых является отрицательное влияние на ферментативную активность извлекаемых субклеточных структур [130].
Многократное действие температурного фактора /замораживание и оттаивание до 60 раз (по данным многих авторов наиболее щадящий и эффективный метод дезинтеграции). При этом достигается разрушение клеток до 90-95 %. Однако из-за длительности процедуры (до 40 ч). метод мало удобен и малоперспективен. Механический метод дезинтеграции основан на длительном и энергичном встряхивании микробной суспензии с мелкими стеклянными бусами. В зависимости от режима дезинтеграции и вида микроорганизмов этим методом достигается 70-85%-ное разрушение клеток. Широко применяется химическая обработка клеточного материала, трихлоруксусной кислотой, фенолом, додецилсульфатом натрия, дезоксихолатом натрия, тритоном Х-100, ЭДТА, литическими ферментами / пепсин, трипсин, лизоцйм Л
Вероятно, сочетание вышеуказанных методов дезинтеграции и их модификации позволяют сохранить макромолекулярную структуру и биологическую активность выделяемых субклеточных структур. Поэтому, для выбора оптимального метода дезинтеграции клеток нами были проведены се-рии экспериментов, с ходом которых можно ознакомиться в приложении 1.
В результате был определен наиболее щадящий, эффективный, простой и хорошо воспроизводимый метод дезинтеграции клеток микроорганизмов, включающий следующие процедуры: суспензию биомассы трехкратно отмывали фосфатным буфером 0,1 М (рН 7,2), центрифугировали при 5000 g 5 мин. Осадок дезинтегрировали в механическом дезинтеграторе 5 мин. при 4 С. Дезинтеграт переносили в колбу, добавляли 5,0 мл фосфатного буфера и тритона Х-100 в конечной концентрации 20,0 мг/мл.- Колбу помещали на магнитную мешалку на 2 часа при 37С для солюбилизации белка. Далее гомогенат центрифугировали при 8000 g 10 мин. Супернатант подвергали электрофорезу.
Для электрофореза в полиакриламидном геле наиболее широко применяется аналитический аппарат фирмы «Reanal» / Венгрия L Однако цилиндрические гели, используемые в этом приборе, неудобны для последующего сканирования. Разный диаметр трубок приводит к неравномерной миграции отдельных фракций и к затруднениям при сопоставлении их относительной электрофоретической подвижности. Последнее особенно важно для идентификации различных молекулярных форм.
В связи с этим нами была сконструирована камера для электрофореза в блоках полиакриламидного геля с циркуляционной системой охлаждения. Камера для электрофореза полностью выполнена из оргстекла. Части камеры склеиваются из отдельных деталей, которые могут быть изготовлены в любой исследовательской лаборатории. Габариты камеры рассчитаны на одновременный анализ 20 образцов. В качестве электродов использовали платиновую проволоку диаметром 0,5 мм...
Для приготовления геля использовали акриламид и метиленбисак-риламид фирмы «Reanal» (Венгрия). Перед употреблением проводили перекристаллизацию указанных компонентов с целью удаления акриловой кислоты. Исходные растворы для электрофореза готовили по прописям, предложенным для электрофореза в щелочной системе [23, 59]. Заранее приготовленные и хранимые в холодильнике реактивы перед работой выдерживали при комнатной температуре. Для электрофореза готовили 7,5 % раствор полиакриламидного геля. Полученный раствор разделяющего мелкопористого геля заливали в кюветы прибора, далее шприцом на поверхность геля наслаивали холодную воду. Окончание полимеризации фиксировали по образованию хорошо видимой границы раздела между гелем и наслоенной водой. После удаления воды на поверхность мелкопористого геля наслаивали раствор крупнопористого геля, на который осторожно наносили охлажденный верхний электродный буфер. Фотополимеризацию крупнопористого кон- центрирующего геля проводили с помощью ультрафиолетовой лампы. Окончание полимеризации крупнопористого концентрирующего геля устанавливали по образованию четко видимой границы между гелем и наслоенным буферным раствором.
После окончания полимеризации гелей камеры заливали верхним и нижним буферными растворами, в кюветы на линию старта наносили анализируемые образцы в объеме 50,0 мкл в смеси с 40% раствором сахарозы. В качестве электродного буфера использовали 1,0 М трис-ЭДТА-боратный буфер (рН 9,2). Режим электрофореза подбирали опытным путем в предварительных экспериментах. Первые 30 мин электрофорез проводили при силе тока 5,0 мА/см, затем 10,0 мА/см до окончания электрофореза. О времени окончания процедуры электрофореза судили по положению диска красителя бромфенолового синего. По окончании электрофореза буферные растворы сливали, гели из кювет извлекали путем введения шприцем дистиллированной воды между поверхностью геля и стенкой кюветы.
Биомониторинг активных илов и иммобилизованных микроорганизмов. Функциональная взаимосвязь дегидроге-наз и каталазы микросообществ модельных гидроэкосистем. Обсуяедение результатов
Модельные экосистемы активного ила и иммобилизованных микроценозов функционируют и развиваются по классической схеме развития природных гидроэкосистем. К ним применимы общие положения окислительного обмена и представления о ферментах, как о самонастраивающихся катализаторах. В экспериментах указанные гидроэкосистемы выгодно отличаются тем,, что цикл их развития можно проследить за несколько суток, а также возможностью варьирования факторов внешней среды в любых пределах и на любых уровнях, в том числе и моделирования кризисных ситуаций. Поэтому трактовку результатов исследований мы сочли необходимым начать с характеристики изоферментов МДГ, ГДГ и каталазы в моделях развивающихся экосистем активного ила.
Итак, МДГ активного ила в фазе адаптации представлена тремя зонами активности в составе шести изомерных форм, из которых четыре включены во вторую зону. У ГДГ обнаружено пять изоферментов,. причем, пятая характеризуется как основная, а четыре остальных, незначительно отличающихся по относительной электрофоретической подвижности, как минорные формы, что вполне согласуется с данными других авторов [268, 270]. Каталаза представлена двумя изоферментами.
Таким образом, все исследуемые ферменты окислительного метаболизма представляют собой олигомеры с той или иной степенью гетерогенности. Такая структурная организация олигомерных ферментов по сравнению с мономерными имеет ряд преимуществ, хотя и кинетическая кооперативность не является следствием субъединичного строения. Агрегация субъединиц приводит к тому, что соотношение площади внешней поверхности к объему белка становится более благоприятным с точки зрения значения энергии стабилизации нативной структуры.
При этом достигается и структурная симметричность [208]. Интересно отметить, что основная активность всех исследуемых ферментов концентрируется в области высокомолекулярных, мембраносвязанных форм.
В фазе лог-роста отмечено увеличение общей активности ферментов в 1,5-3,5 раза. На этом фоне установлена значительная структурная реорганизация МДГ, число изоформ МДГ возрастает до семи. Структурная организация ГДГ и каталазы не меняется. Такая степень гетерогенности ферментов сохраняется вплоть до перехода в стационарную фазу. Следует сказать, что увеличение гетерогенности МДГ достигается относительно низкомолекулярными формами, что объясняется или диссоциацией олигомеров на прото-меры с сохранением каталитической активности или индукцией адаптивных форм фермента. Индукторами могут быть вновь образующиеся метаболиты, структурно схожие с субстратами, тем более, что для многих дегидрогеназ прокариотов нехарактерна строгая субстратная специфичность. Не вызывает сомнения то, что независимо от механизмов, увеличение гетерогенности дегидрогеназ направлено на усиление гомеостаза экосистемы и ее стабилизацию.
Теперь остановимся на изменениях в соотношении активности изоформ ферментов в фазе лог-роста. Для МДГ характерно увеличение активности МДГ-2 при некотором снижении МДГ-1 и МДГ-3. Минорные формы ГДГ, кроме ГДГ-2, также значительно активированы, заметно снижение активности основной формы ГДГ-5. И только у единственного из исследуемых ферментов каталазы установлено явное преобладание активности высокомолекулярной формы К-2 над К-1.
Анализ данных показывает, что переход экосистемы в фазу лог-роста на фоне увеличения общей активности всех исследуемых ферментов, характеризуется нарастанием каталитических функций цитоплазматических изоформ. Известно, что МДГ и ГДГ в совокупности с их метаболитами выполняют роль челночных, систем транспорта восстановленных эквивалентов в митохондрии [28] или аналоги митохондрий у прокариотов. Координированная деятельность указанных ферментов обеспечивает жизнедеятельность клетки. Однако в ряде последних работ убедительно доказано явление ассоциации растворимых ферментов, в компартментах клеток прокариот, и эукариот [61, 66, 98, 153, 184], Преимуществом образования ферментных комплексов является последовательная микрокомпартментализация метаболитов /туннелирование субстратов/, заключающаяся в прямом переносе продукта первой ферментной реакции на фермент второй реакции без выхода метаболита в среду. При передаче метаболита происходит образование короткоживущего фермент-ферментного комплекса с непосредственной передачей метаболита "из рук в руки". При этом обсуждается возможность прямого переноса NADH между ферментами [290]. Пока не доказано, прикреплены ли мультиферментные комплексы к внутренней поверхности цитоплазматической мембраны жестко, или в процессе каталитического акта десорбируются и свободно диффундируют в среде до встречи следующего по эстафете мультиферментного комплекса. В любом случае, одновременное увеличение относительной активности цитоплазматических форм МДГ и ГДГ в наших исследованиях косвенно подтверждают существование "метаболонов".
Переход экосистемы активного ила в стационарную фазу характеризуется следующими особенностями. Отмечено некоторое снижение общей активности ГДГ, активность МДГ оставалась на уровне активности фазы лог-роста, а активность каталазы продолжала возрастать и становилась значительно выше фазы адаптации. Число изоферментов МДГ и ГДГ не изменяется, а в области К-2 у каталазы выявлена еще одна изомерная форма и число изоферментов каталазы становится равным трем.
Рассмотрим изменения соотношения активности изоферментов при переходе из фазы лог-роста в стационарную и на протяжении всей стационарной фазы. У ГДГ установлено явное преобладание каталитических функций минорных изомерных форм, относительная активность К-2 значительно снижена. Это может быть объяснено усилением аэробных процессов и повышением напряжения кислорода в клетках ила. И, наоборот, отмечена активация мембраносвязанных форм МДГ и каталазы, цито плазматические же функции указанных ферментов много ниже мембранных. Серии экспериментов по лимитированию развития экосистемы кислородом полностью подтвердили наши предположения: лимит кислорода приводил к активации мембраносвязанных форм ГДГ и резкому снижению активности высокомолекулярных форм МДГ. Что касается цитоплазматических форм ферментов, то здесь мы наблюдали обратную картину. Это позволило характеризовать ГДГ как фермент анаэробно-аэробного метаболизма, а МДГ как фермент аэробно-анаэробного метаболизма. В полной мере это относится и к каталазе, однако на лимитирование кислородом или его избыток реагировала только К-2, активность же К-1 не претерпевала резких изменений.
