Содержание к диссертации
Введение
1.Обзор литературы 7
1.1 Значение определения витамина В12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового рецептора 7
1.2 Характеристика современных методов анализа, используемых для определения витамина В12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового рецептора 17
2. Материалы и методы 23
2.1 Получение конъюгатов В12-БСА и фол-БСА 23
2.2 Получение конъюгатов Нсу-ПАК и Нсу-БСА 24
2.3 Получение антисывороток 24
2.4 Проведение иммуноферментного анализа 25
3. Результаты исследований 28
3.1 Разработка иммуноферментного метода определения витамина В12, фолатов и гомоцистеина. 28
3.2 Приготовление растворов калибраторов 30
3.3 Оптимизация иммуноферментного анализа витамина В12 31
3.4 Разработка и оптимизация твердофазного иммуноферментного анализа для определения фолиевой кислоты 37
3.5 Постановка иммуноферментного анализа для количественного определения витамина В12 и фолатов 40
3.6 Разработка метода определения гомоцистеина 43
3.7 Разработка метода определения трансферринового рецептора 48
3.8 Клиническое использование разработанных тестов 51
3.8.1 Определение витамина В12 и фолиевой кислоты при ряде гематологических заболеваний 51
3.8.2 Определение гомоцистеина при гематологических и микрореологических заболеваниях 55
3.8.3 Определение трансферринового рецептора при гематологических нарушениях 56
Заключение 59
Выводы 71
Список литературы 72
- Значение определения витамина В12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового рецептора
- Характеристика современных методов анализа, используемых для определения витамина В12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового рецептора
- Разработка иммуноферментного метода определения витамина В12, фолатов и гомоцистеина.
- Постановка иммуноферментного анализа для количественного определения витамина В12 и фолатов
Введение к работе
Дифференциальная диагностика анемий по-прежнему остается актуальной проблемой гематологии. В связи с этим разработка и внедрение в практику лабораторных методов, позволяющих уточнить характер анемий, обусловленных разными причинами, имеет существенное значение как с научной, так и с практической точек зрения. Показано, что определение и контроль уровней витамина В12 и фолатов целесообразно в клинической гематологии. Витамин В12 и фолаты необходимы для нормального метаболизма в организме (синтез ДНК, обмен жирных кислот и др.). Дефицит этих витаминов вызывает нарушение функции быстро пролиферирующих клеток и в первую очередь мегалобластную анемию, а также неврологические и нейропсихические изменения. Кроме того, по концентрации витамина В12 в ряде случаев проводится дифференциальная диагностика хронических миелопролиферативных заболеваний. Нарушение обмена фолиевой кислоты и вызванное этим увеличение в крови концентрации гомоцистеина (Нсу), как продукта метаболизма фолатов, ведет к сердечно-сосудистым заболеваниям и тромбозам, в основе которых лежит токсическое действие гомоцистеина на эндотелий сосудов. Метаболизмы витамина В12 и фолиевой кислоты тесно взаимосвязаны, и дефицит одного из них влияет на биохимические реакции, контролируемые этими витаминами. Биохимические механизмы, посредством которых дефицит этих витаминов приводит к анемиям, на сегодня еще не полностью ясен, хотя и доказано, что наблюдается дефект синтеза ДНК при сохранном синтезе РНК и белков. Скорее всего, появление дефектной ДНК вызвано нарушениями в реакции превращения урацил-монофосфата в тимидин-монофосфат, который, включаясь в ДНК, необходим для образования ее больших тяжей, требуемых для формирования хромосомы. Таким образом, поскольку содержание в организме витамина В12, фолиевой кислоты и гомоцистеина взаимосвязаны, определение их концентраций важно для точной диагностики заболеваний, а также для контроля проводимой терапии.
Среди анемий различной этиологии значительное место занимают анемии хронических воспалительных заболеваний (АХВЗ). По ряду признаков они отличаются от истинных железодефицитных анемий. Однако, без дополнительных исследований их трудно дифференцировать с истинным дефицитом железа. Одним из информативных дифференциальных показателей является концентрация трансферринового рецептора. Трансферриновый рецептор (ТфР) является мембранным гликопротеином, выполняющим роль медиатора в передаче железа из плазмы в клетку. Этот процесс осуществляется путем связывания трансферрина плазмы, насыщенного железом, с трансферриновым рецептором с последующей интернализацией образовавшегося комплекса в эндоплазматическую везикулу путем эндоцитоза, где железо освобождается из комплекса с белком при уменьшении рН. ТфР освобождается из ретикулоцитов во время их созревания до эритроцитов. ТфР, находящийся в плазме, представляет собой растворимые фрагменты экстрацеллюлярной части рецептора. Уровень растворимого трансферринового рецептора, присутствующего в плазме, позволяет судить о состоянии гемопоэза, поскольку при недостатке в клетке свободного железа происходит увеличение синтеза ТфР, а следовательно, и увеличение поступления железа в клетку. При избытке железа в клетке синтез рецептора прекращается.
Эритроидные клетки содержат основную массу трансферринового рецептора в организме. В норме плазма содержит небольшое количество ТфР (1,5-2,5 мкг/мл). Концентрация ТфР в плазме хорошо коррелирует с общей массой рецептора на незрелых эритроидных клетках. В связи с этим при истинных ЖДА уровень растворимого трансферринового рецептора резко повышен в отличие от анемии воспалений» и хронических заболеваний. Поэтому определение уровня трансферринового рецептора включают в методы дифференциальной; диагностики этих анемий:
Поскольку все указанные соединения находятся в сыворотке крови в крайне незначительных количествах, определение их возможно лишь современными высокочувствительными методами анализа, такими как радио-, флюро- или ферментоиммунными.
В настоящее время отечественных наборов для определения витамина В12, фолатов, гомоцистеина и ТфР нет, а выпускаемые за рубежом - дороги и их применение возможно только при наличии специального оборудования - автоматизированных «закрытых» систем.
В связи с этим целью нашей работы является разработка и внедрение в клиническую практику иммуноферментных методов количественного определения витамина В12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового рецептора.
Задачи исследования
1. Получить конъюгаты витамина В12 с бычьим сывороточным альбумином (БСА), фолатов с БСА, S - аденозил - L - гомоцистеина (SАН) с БСА, SAH с полиакриловой кислотой (ПАК), необходимые при проведении иммуноферментного анализа для использования в качестве антигенов и иммуносорбентов.
2. Оптимизировать параметры проведения иммуноферментной реакции для количественного определения В12, фолатов, гомоцистеина (Нсу).
3. Провести эксперименты по получению реагентов для иммуноферментного анализа ТфР (очищенного препарата ТфР и кроличьих антисывороток к ТфР) и разработать методику количественного определения ТфР методом твердофазного ИФА.
4. Изучить аналитические характеристики сконструированных тест-систем (специфичность, чувствительность, воспроизводимость, сходимость результатов) и провести сравнительный анализ полученных результатов с данными других иммунохимических методов.
5. Оценить клиническую информативность разработанных методов количественного определения витамина В12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферриновго рецептора.
Научная новизна
Разработан оригинальный подход для получения антисыворотки против гомоцистеина на основании использования конъюгата Б-аденозил-Ь-гомоцистеина с полимером (полиакриловой кислотой), обеспечивший получение антисывороток с высоким уровнем специфических антител и высокой константой аффинности, необходимых для целей ИФА.
Разработаны иммуноферментные количественные методы анализа витамина В12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового рецептора.
Показана высокая информационная значимость комплексного определения витамина В12, фолиевой кислоты и трансферринового рецептора для дифференциальной диагностики анемий.
Показана целесообразность контроля уровня гомоцистеина у больных с повышенным риском развития тромбозов и микроциркуляторными нарушениями для выбора оптимальной тактики лечения.
Практическая значимость
1. Разработаны высокочувствительные и специфичные методики количественного определения витамина В12, фолатов, гомоцистеина и трансферринового рецептора на основе твердофазного иммуноферментного анализа.
2. Разработаны и утверждены Ученым Советом Гематологического научного центра РАМН методические рекомендации «Иммуноферментный метод определения витамина В12 и фолиевой кислоты» (протокол № 4 от 28 мая 2002 г.).
3. С 2001 г. разработанные лабораторные тесты внедрены в клиническую практику ГНЦ РАМН.
4. Показана целесообразность динамического контроля уровня гомоцистеина у больных с повышенным риском развития тромбозов.
Апробация работы
Материалы, изложенные в диссертации, доложены на научной конференции ГНЦ РАМН (Москва, 2004). Результаты диссертации обсуждены на заседании проблемной комиссии «Опухоли лимфатической системы, патология красной крови, порфирии» ГНЦ РАМН (Москва,! июля 2004).
Значение определения витамина В12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового рецептора
Биологически активными формами фолатов являются восстановленные формы тетрагидрофолаты (THFs), содержащие карбоновую единицу различной стадии восстановления (метил-, формил- или метилен) [115]. В тканях организма фолиевая кислота последовательно подвергается восстановлению. Восстанавливаются две двойные связи (5=6, 7=8) с образованием ди- и тетрагидрофолиевой кислоты, последняя является коферментом реакции, отвечающей за перенос различных одноуглеродных фрагментов (-СНз, -СН2О, -СН2, -СОН). В реакции принимает участие НАДФН-ДГ. Источником одноуглеродных групп являются реакции распада серина, глицина, холина, в результате которых образуются формальдегид и муравьиная кислота. Точкой присоединения являются 5-ый и 10-ый атомы азота тетраметилгидрофолата. Эти реакции происходят при синтезе пуриновых оснований, тимидина. Особенно важное значение имеет перенос формильных групп, донором которых является NlO-формилтетрагидрофолат [16, 30, 129]. Гидроксиметильная группа (-СНгОН) переносится на тетрафолат от серина с образованием метилентетрафолата, который, однако, не готов к реакции формилирования, поскольку СНг-группа более восстановлена, чем формильная. Затем метиленовая группа окисляется НАДФН+-зависимым ферментом и образуется метинильное производное тетрафолата, которое после гидролиза превращается в NlO-формил-тетрафолат - донора формильной группы при биосинтезе пуриновых нуклеотидов. Ферментом в данных реакциях является формилтрансфераза. Конкурентным ингибитором, тормозящим реакции синтеза, является С4аминоптерин, синтетический аналог фолатов. и Суммируя литературные данные, можно сказать, что на основании многолетних исследований [30, 32, 38] выяснено, что витамин В12 и фолаты принимают участие в следующих биохимических процессах: 1) в обратимой реакции между THF и серином с образованием 5,10-метилен-ТНФ и глицина; 2) в. реакции между 5-метил-ТНР и; гомоцистеином, во время которой образуется дигидрофолат (ДГФ) и которая зависит от СНз-В12 и катализируется метионинсинтетазой; 3) в реакции между 5,10-метилен-ТНФ и дезоксиуридилатом, с образованием дигидрофолата и тимидилата, катализируемой тидимилатсинтетазой; 4) в реакции между 5,10-метилен-ТНФ и глицинамидом рибонуклеотидом (GAR) с образованием К-формил-САЯ, т.е. передаче 8-ми атомов углерода в пуриновое кольцо; 5) в реакции между 10-формил-ТНФ и 5-амино-4-имидазол карбоксимид рибонуклеотидом с образованием инозиновой кислоты, т.е. происходит закрытие пуринового кольца путем вставки еще одного атома углерода. Таким образом из представленного описания видно, что фолаты в виде 5,10-метилен-ТНФ с В12 зависимыми ферментами участвуют в синтезе тимидинмонофосфата из дезоксиуридинмонофосфата, т.е. в синтезе ДНК [127]. В связи с выше сказанным становится понятным, что дефицит витамина В12 и фолатов ведет к нарушениям в синтезе ДНК, что в свою очередь на уровне организма приводит к анемии и поражениям нервной трубки. Механизм этих поражений не совсем ясен. Существует несколько теорий, пытающихся объяснить возникновение мегалобластной анемии при дефиците В12 и фолатов [38]. Ранее предполагалось, что существует дефект синтеза ДНК при сохранном синтезе РНК и белков [59]. Однако, было доказано, что базовый состав ДНК в мегалобластах при дефиците В12 нормален [127]. В то же время Wickremasinghe & Hoffbrand [130] показали, что при дефиците В12 и фолатов понижена скорость репликации ДНК и формирование больших тяжей ДНК («пассивная» ДНК) снижено. Поэтому было высказано предположение, что мегалобласты начинают синтез ДНК с репликона, но не способны из-за нехватки тимидилата полноценно продолжить его и сформировать нить ДНК. В настоящее время можно считать доказанным, что уровень деокситимидинтрифосфата (dTTP) в мегалобластах значительно меньше, чем требуется при репликации ДНК [72]. Кроме того существует мнение, что при недостатке витамина В12 и фолатов происходит нарушение инкорпорации урацила в ДНК вследствие скоплений дезоксиуридинмонофосфата (dUhM ), что ведет к возникновению дефектной ДНК [30]. Между нарушениями в метаболизме витамина В12 и фолиевой кислоты существует связь [122]. Метилен-тетрагидрофолат скапливается в сыворотке, что ведет к недостаточности фолатов в клетках. Это происходит при дефиците В12-зависимой метионинсинтетазы, с помощью которой метил-ТГФ деметилируется до ТГФ, а гомоцистеин - до метионина [76]. Дальнейшее развитие этой теории позволило предположить, что при дефиците В12 наблюдается недостаточность синтеза внутриклеточного фолат-полиглютамата из-за нехватки ТГФ, который необходим клетке как субстрат для синтеза фолат-полиглютамата [59]. Накапливающийся в клетке метил-ТГФ не является таким субстратом, поскольку нет фермента для его утилизации. Это объяснение является наиболее вероятным, поскольку очень многие реакции с участием фолатов нарушаются при дефиците витамина В12. Предполагается, что нейропатия, встречающаяся при дефиците В12, также обусловлена недостаточностью реакций с участием метионин t синтетазы и последующим уменьшением соотношения между SAM и SAH, которое является результатом угнетения реакции метилирования, в том числе метилирования миелина в ЦНС [76]. Дефицит витамина В12 и фолатов ведет к появлению большого количества мегалобластов и гиганских метамиелоцитов в костном мозге и гиперсигментированию нейтрофилов в крови [80, 105, 135]. Эти явления наиболее очевидны. Однако нехватка этих витаминов приводит к пролиферативным и морфологическим изменениям всех делящихся клеток [64]. Для дефицита В12 характерен неэффективный эритропоэз, т.е. увеличенная степень интрамедулярной клеточной смерти в течение этого процесса [132]. Мегалобласты характеризуются задержкой белкового синтеза в S и G2 фазах, и эти клетки с большими ультраструктурными аномалиями подвергаются фагоцитозу и разрушению костномозговыми макрофагами [70]. Многие гиганские метамиелоциты и определенное количество мегакариоцитов также разрушаются в костном мозге [130]. Характерными чертами мегалобластов являются: 1) больший размер по сравнению с нормальными эритробластами в той же стадии развития; 2) несомненная задержка конденсации хроматина по сравнению с » тем, что имеет место при нормальном эритропоэзе [125]. Показано, что увеличенный размер мегалобластов вызывается продолжающимся клеточным ростом во время удлиненного клеточного цикла [131]. Возможно, что гигантский размер мегалобластов связан с увеличенным клеточным ростом во время более или менее нормального цикла и рост эритробластов прекращается после окончания интерфазы [129]. Неизвестно чем обусловлен измененный, так называемый, открытый тип хроматина эритробластов. Существуют два объяснения: 1) цитоплазма мегалобластов изменяется от базофильной к полихроматофильной между S-фазой и митозом; 2) за процессом деконденсации хроматина следует реконденсация его, и равновесие между степенью деконденсации и реконденсации в мегалобластах таково, что масса конденсированного хроматина аномально мала [99]: В результате возникает такое поражение ДНК, которое приводит к аномалиям в нуклеарной функции и деградации ДНК.
Характеристика современных методов анализа, используемых для определения витамина В12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового рецептора
Повышение концентрации антител ведет к увеличению неспецифического связывания и расхода ценного реагента (антисыворотки). После установления в системе равновесия свободную и связанную фракции разделяют с помощью какого-либо физического, химического или иммунологического метода, а затем измеряют в связанной фракции содержание метки, используя для этого приборы (в случае РИА и ФИА) или ферментативную реакцию (в случае ИФА). Меченый антиген выступает в данном случае в роли метки и используется, для того чтобы можно было определить процентное содержание антигена, присутствующее в связанной фракции. Количество связанного антигена обратно пропорционально его концентрации в образце или стандарте. В радиоиммунных аналитических тест-системах, предложенных фирмой Bio-Rad, использованы в качестве метки витамин В12, содержащий радиоактивный изотоп кобальта (Со57) и фолаты, меченные радиоактивным иодом (I125) [101]. Испытуемые образцы и стандарты вместе с мечеными реактивами нагревают с ДТТ для восстановления всех дериватов как цианкобаламинов, так и фолатов и перевода их в циан-форму, а затем инкубируют с внутренним фактором в случае определения витамина В12 и с фолат-связывающим белком при определении фолиевой кислоты, которые иммобилизованы на носителе. Определенное количество меченых и немеченых витаминов связывается с иммобилизованными связывающими белками и осаждается, а несвязавшиеся витамины удаляют. В осадке определяют радиоактивность, и по стандартной кривой вычисляют концентрацию витаминов в исследуемых образцах. В данном методе количество радиоактивной метки в осадке обратно пропорционально количеству витамина в пробе. Эта -тест-система обладает высокой точностью и специфичностью, однако, как метод РИА она обладает и рядом недостатков, к которым относится, в первую очередь, то, что меченые реактивы имеют относительно короткий период полураспада, что значительно осложняет их хранение и связано с дополнительными расходами при транспортировке, требует использование дорогостоящих счетчиков для измерения радиоактивности, а также необходимость производить разделение свободной и связанной фракций с применением центрифугирования. Кроме того работа с радиоактивными изотопами потенциально опасна для здоровья. К неизотопным методам иммуноанализа для определения витамина В12 и фолатов относятся иммунофлуоресцентные и иммуноферментные. По своей сути неизотопные методы иммуноанализа не отличаются от своего изотопного аналога. Отличия связаны лишь с типом используемой метки, способом детекции на конечной стадии анализа. Существующие в настоящее время неизотопные методы определения уровня витаминов можно классифицировать согласно используемой метке на флуоро- или хемоиммуноанализ, в котором применяется флуоресцентная или хемилюминесцентная метка, и иммуноферментный анализ, в котором для детекции определяемых веществ используется фермент. В зависимости от того, следует или нет проводить стадию разделения, эти методы подразделяются, на гетерогенные и гомогенные. Фирма «Chiron/Diagnostics» (США) выпускает наборы для автоматического анализатора (закрытого типа), в которых в качестве конъюгата используется В12, меченный акридиниевым эфиром (acridinium ester). Так же как и в случае наборов фирмы Bio-Rad, связывающим белком является внутренний фактор, иммобилизованный на парамагнитных частицах. Эта тест-система обладает высокой чувствительностью, точностью, быстротой в исполнении анализов и относительной простотой [7]. Однако высокая стоимость автоматической установки препятствует широкому распространению этой тест-системы для целей клинического мониторинга. Методом, наиболее полно отвечающим требованиям, предъявляемым к наборам для широкого клинического использования, как и для большинства низкомолекулярных соединений, может быть иммуноферментный анализ для "открытых" систем в конкурентном варианте. Однако наборы такого типа для определения витамина В12 и фолатов не выпускаются. Определение Нсу, в основном, проводят методами высокоразрешающей жидкостной хроматографии (ВЖХ). В зависимости от метода детекции ВЖХ разделяется на несколько модификаций, различающихся по способам определения конечных продуктов: ультрафиолетовая, флюоресцентная, электрохимическая, газовая или масс-спектрометрическая. Эти методы обладают высокой разрешающей способностью, точностью и информативностью. Естественно, что использование метода ВЖХ дает возможность определять широкий спектр соединений, содержащих серу, близких по стркутуре гомоцистеину. Основным недостатком этих методов является то, что они требуют специального дорогостоящего оборудования, высокой квалификации обслуживающего персонала и очень дороги. В настоящее время фирма Axis выпустила иммуноферментный набор реактивов для определения Нсу, основанный на конкурентном варианте ИФА, но как и большинство коммерческих наборов, он является очень дорогостоящим, что крайне затрудняет его применение в широкой лабораторной практике. Однако, считается, что будущее за иммуноферментными методами определения Нсу, поскольку они наилучшим образом приспособлены для широкого клинического использования при проведении эпидемиологических исследований по выявлению лиц группы риска [102]. При использовании иммунохимических методов анализа приходится определять общий І гомоцистеин, находящийся в плазме. Гомоцистеин циркулирует в плазме, в основном, в окисленной форме в виде цистина и цистеин-Нсу дисульфида, а также в связанном с белками состоянии. Также небольшое количество гомоцистеина находится в восстановленной форме в виде дисульфид гомоцистеина. Общий гомоцистеин — это сумма свободного и связанного с белком гомоцистеина. Для определения в иммунохимической системе весь гомоцистеин следует перевести в восстановленную форму. В настоящее время чаще всего используют перевод всего Нсу в Б-аденозил-Ь-гомоцистеин (SАН) при помощи ферментативной реакции, катализуемой Б-аденозил-Ь-гомоцистеин-гидролазой в присутствии избытка аденозина, предварительно восстановив весь Нсу дитиотреитолом. Впервые эта реакция была предложена Refsum [101, 102]. Гомоцистеин является гаптеном, его определение в иммуноферментной системе возможно в конкурентном варианте с применением конъюгатов гомоцистеина с носителями. Для получения конъюгата Нсу использовали его модифицированное производное - Б-аденозил-Ь-гомоцистеин (SAH). В связи с тем, что в молекуле гомоцистеина присутствуют карбоксильные группы, модификация его представляет большие сложности, поскольку при активациии аминных групп может произойти образование полимера, не обладающего антигенными свойствами гомоцистеина. Поэтому синтез конъюгатов гомоцистеина имеет свои особенности по сравнению с синтезом конъюгатов витамина В12 и фолиевой кислоты. Необходимо проводить предварительно активацию носителей и затем соединять их с SAH (в случае витамина В12 и фолатов активировали гаптены).
Разработка иммуноферментного метода определения витамина В12, фолатов и гомоцистеина.
Показано, что S-аденозилгомоцистеин присоединяли ковалентно к бычьему альбумину через его аминогруппу (показана синим).
Малые размеры молекулы гомоцистеина затрудняют получение антител к нему. Поэтому мы использовали для иммунизации в качестве носителя полиэлектролит-полиакриловую кислоту (ПАК). Как было показано Кабановым [5], иммобилизация гаптенов на полиэлектролитных носителях значительно усиливает их иммуногенные свойства. Предполагается, что эффект обусловлен повышением сродства гаптенов к антиген-презентирующим клеткам в результате многоточечного взаимодействия полиэлектролитов с поверхностью клеток. Активации иммунного ответа способствует и неспецифическое пролиферативное действие, оказываемое полиэлектролитами.
Степень модификации ПАК гомоцистеином рассчитывали, исходя из концентрации Нсу в 1 мл раствора, измеренной с использованием коммерческого набора для определения Нсу фирмы Axis и концентрации ПАК, определенной с помощью потенциометрического титрования. Степень модификации составляла 15 остатков Нсу на цепь полимера.
Степень модификации БСА SAH определяли, исходя из значений гомоцистеина (Сі) (коммерческий набор фирмы Axis) и концентрации белка, определенной по методу Лоури (Сг), и молекулярной массы БСА по формуле: R= Сі х разе, х М /С2.
В данном случае модификация составила 7 молей на моль белка. Анализ полученного конъюгата проводили иммуноферментным методом, используя реактивы фирмы Axis. 3.2. Приготовление растворов калибраторов. Одной из главных задач при создании количественных иммунохимических методов анализа является приготовление калибровочных проб. В результате проведенных экспериментов было показано, что оптимально использовать для приготовления стандартов пулированные сыворотки крови, в которых концентрация определена разработанными методами и референтными (коммерческими) наборами реактивов (Abbot, США; Axis, Норвегия; Chiron Diagnostic, США). В качестве нулевой пробы применяли пул сывороток здоровых доноров, обработанный активированным углем (Norit A,Serva, Германия). Использовали следующие концентрации калибраторов - 800 пг/мг, 400 пг/мл, 200 пг/мл, 100 пг/мл и 0 пг/мл для витамина В12; 10 нг/мл, 5 нг/мл, 2,5 нг/мл, 1 нг/мл и 0 нг/мл для фолатов; 0 мкМ, 5 мкМ, 10 мкМ, 20 мкМ и 40 мкМ для гомоцистеина и 20 мкг/мл, 10 мкг/мл, 5 мкг/мл, 1 мкг/мл и 0 мкг/мл для трансферринового рецептора. В тесте «шахматного титрования» были определены рабочие разведения антисывороток к В12 и к фолатам, а также конъюгата airra-IgG-Mbiiiib с пероксидазой. В таблице 1 представлены результаты исследований. Исходя из этих данных, при разведении антител 1/1000 для витамина В12 и 1/500 для фолатов наблюдаются достаточно высокие значения оптической плотности, при увеличении разведения антител Д450 уменьшается и чувствительность методов ухудшается, поэтому пришли к заключению, что оптимальными являются следующие условия: разведение антител к В12 1/1000, к фолатам - 1/500, а оптимальное разведение конъюгата анти- IgG мыши-ПХ - 1/2500. З.З.Оптимизацня нммуноферментного анализа витамина В12. На, следующем этапе исследований была проведена работа по отработке условий проведения анализа: выбор схемы твердофазного анализа (конкурентный, последовательного насыщения или вытеснения), определение концентрации и оптимального времени иммобилизации конъюгата В12-БСА на твердой фазе, времени инкубации антигена с антителами, т.е. наилучшего периода конкурентной реакции и концентрации конъюгата анти-IgG-nX. Как уже сказано выше, при выборе оптимальных для анализа концентраций реагентов руководствовались тем принципом, что точка, соответствующая «нулевой» концентрации определяемого витамина, должна лежать на кривой титрования в диапазоне, близком к 50% связыванию антигенов с антителами, при этом значение оптической плотности должно лежать в пределах 1,2-1,0 оптических единиц. Все данные, представленные в таблицах и на графиках, являются средними величинами из 7-10 однотипных опытов. Мы не приводим разброс из-за неудобства построения кривых для определения концентраций. В результате выполненных экспериментов было установлено, что оптимальная концентрация конъюгата витамин В12-БСА, сорбированного на твердой фазе, находилась в пределах 800-1000 нг/мл, поскольку при этих значениях конюгата наблюдается наилучшая концентрационная зависимость (рис. 8). При последовательном увеличении концентрации сорбированных на твердой фазе конъюгатов (выше 2500 нг/мл для витВ12-БСА) наблюдался сдвиг калибровочных кривых в область более высоких концентраций антигенов и уменьшение их наклона, вследствие чего ухудшается чувствительность метода. На рисунке 8 приведены кривые титрования сыворотки анти-В12 при различных концентрациях конъюгата В12-БСА, сорбированного на твердой фазе от 500 до 4000 нг/мл (1- 500 нг/мл; 2 -1000 нг/мл; 3 -2500 нг/мл; 4 - 4000 нг/мл).
Постановка иммуноферментного анализа для количественного определения витамина В12 и фолатов
У 95,5% больных с В12-дефицитной анемии наблюдается резкое снижение витамина В12 в сыворотке (117,7±12пг/мл) и в эритроцитах (13,9± 3,3 пг/г НЬ). Концентрация фолатов при В12-дефицитной анемии в сыворотке сохраняется нормальной (9,7± 2,6 нг/мл), а в эритроцитах - снижается (2,0±0,9нг/ г Нв) После проведения соответствующей терапии происходит нормализация показателей витамина В12 в сыворотке до 350±98 пг/мл и эритроцитах - 75±31пг/ г Нв. При фолиево-дефицитной анемии наблюдаются пониженные значения фолатов как в сыворотке(2,1±0,8нг/мл), так и в эритроцитах (1,6±0,44нг/ г Нв). Значения витамина В12 в сыворотке несколько снижено (267,8±45пг/мл), а в эритроцитах - в пределах нормы (280,8±76,1пг/гНв). Мы встретились с несколькими клинически выраженными случаями В12-дефицитной анемии (3 больных, 4,5%) при которых уровень витамина В12 в сыворотке был на нижней границе нормы, а в эритроцитах даже повышен, а после начала лечения; произошло снижение концентрации витамина и в сыворотке, ив эритроцитах. Аналогичные случаи отмечаются и в литературе [130]. Вероятно подобный феномен связан с нарушениями в связывании и транспорте кобаламинов. Интересно заметить, что во всех подобных случаях отмечалась высокая степень неэффективного эритропоэза. При железодефицитной анемии (ЖДА) отмечается достоверное повышение уровней витамина В12 (1048±66,7 пг/мл) и фолатов (18±3,1 нг/мл) в сыворотке, и соответственно, 499±77,6 пг/ г Нв и 19,3±2,5 пг/ г Нв в эритроцитах, что, видимо, связано с резким, снижением потребления этих витаминов для синтеза гемоглобина в условиях дефицита железа. Характерно, что после проведения курса ферротерапии и нормализации показателей обмена железа наблюдалось снижение концентрации витамина В12 и фолиевой кислоты и в сыворотке (276±33,9 пг/мл и 9,2±2,5 пг/гНв), и в эритроцитах (128±29,0 пг/ г Нв и 10,5±2,9 нг/г НЬ). Данные результаты можно рассматривать как основание для проведения одновременно с терапией ферропрепаратами поддерживающего курса витаминов. При аутоиммунной гемолитической анемиии в большинстве случаев наблюдались относительно нормальные показатели витамина В12 - (490±187 пг/мл) и фолатов (9,2±1,9 пг/мл) как в сыворотке, так и в эритроцитах (249±56,9 пг/г НЬ и 6,1±2,0 нг/ г Нв). Однако, в состоянии; ремиссии и нормализации концентрации; Нв происходило резкое снижение концентрации этих витаминов - витамина В12 до 20 пг/мл, а фолатов - до 2,5 нг/мл, что лишний раз подтверждает предположение об интенсивном потреблении витамина В12 и фолатов в момент купирования анемии и является предпосылкой для проведения терапии витамином В12 и фолатами. Возможно, выявленные различия в уровнях витамина В12 и фолатов на разных этапах гемолитического процесса связаны, с существенными колебаниями в продолжительности жизни эритроцитов. Так, в разгар гемолитического криза «молодые» эритроциты ускоренно покидают костный мозг и, поступив в циркуляцию, быстро элиминируются. Тогда как, в период ремиссии, продукция красных клеток нормализуется, и основная часть эритроцитов в периферической крови представлена их нормальными формами. Известно, что при центрифугировании в градиенте плотности молодые эритроциты относятся к легкой фракции, а нормальные; подверженные естественному старению, - к тяжелой. Исследовали уровни витамина В12 и фолатов в легкой и тяжелой фракциях эритроцитов. Выяснилось, что уровень витамина В12 и фолатов в тяжелой фракции-23 ±5,2 пг/гНв и 1,2 ±0,04 нг/гНв, в легкой-286±3 5,8 пг/гНви 14+5,1 нг/гНв соответственно. Таким образом, возраст эритроцитов может в значительной степени определять колебания уровней витаминов в различные периоды гемолитической анемии. Определение концентрации кобаламинов и фолатов при МДС показало, что в сыворотке значения витамина В12 и фолатов находятся в пределах физиологической нормы. В то же время в эритроцитах у большинства больных (60%) уровень витамина В12 повышен (635±165 пг/ г Нв), что и отразилось на среднем значении. Возможно, что высокие значения витамина В12 являются отражением неэффективного эритропоэза, поскольку в этой же группе больных наблюдаются высокие значения эритроцитарного ферритина, который является показателем неэффективности эритропоэза. При хронических миелопролиферативных заболеваниях значения концентрации витамина В12 и в эритроцитах и в сыворотке находятся в пределах физиологической нормы. Уровень фолатов в сыворотке у данной категории больных также в норме, а в эритроцитах этот показатель снижен у 70% пациентов ( 4,2 нг/ г Нв), хотя считается, что запасы фолиевой кислоты в эритроцитах настолько велики, что должны уменьшаться в последнюю очередь. Возможно, это противоречие объясняется применением препаратов, воздействующих на метаболизм фолатов, поскольку фолиевая кислота крайне чувствительна; к действию различных химических соединений. Была обследована группа больных с ревматоидным артритом, у которых не было гематологических нарушений за исключением снижения гемоглобина. Выяснилось, что у 40% больных наблюдается снижение витамина В12 в сыворотке или в эритроцитах, но только у 20% эти показатели были снижены одновременно и в сыворотке, и в эритроцитах. Уровень фолатов в сыворотке у большинства больных был в пределах нормы, а в эритроцитах - снижен (3,2±0,9 нг/г НЬ). При сравнительном анализе показателей обмена железа и витаминов у больных с АХВЗ можно прийти к заключению, что при более низких значениях Нв дефицит фолатов выражен в меньшей степени. Кроме того, возможно, что снижение уровня фолатов связано с воздействием препаратов, которые больные данной группы получали в качестве терапии. Интересно отметить, что именно фолаты эритроцитов наиболее подвержены воздействию химиопрепаратов. В ходе работы нами было замечено, что у ряда больных вне зависимости от заболевания наблюдаются несоответствия между уровнями витаминов в сыворотке ив эритроцитах. Особенно часто это относится к значениям фолатов - нормальный уровень в сыворотке и пониженный в эритроцитах. Скорее всего, это явление объясняется неконтролируемым приемом витаминов, который ведет к повышению их содержания в сыворотке, но не может полностью нормализовать их количество в организме. В то же время у больных с высокой степенью неэффективного эритропоэза наблюдаются более высокие значения витаминов в эритроцитах, а не в сыворотке. В связи с этим можно рекомендовать оценивать уровни витамина В12 и фолатов в организме по более низким значениям, а определять эти витамины следует и в сыворотке и в эритроцитах. Таким образом, проведенное исследование установило изменения в концентрации витамина В12 и фолиевой кислоты при ряде гематологических заболеваний и показало, что использование данных методов при обследовании больных в динамике может быть полезно как для дифференциальной диагностики так и при оценке адекватной терапии. 3.8.2. Определение гомоцистеипа при гематологических и микрореологических нарушениях. При использовании разработанного нами метода определения гомоцистеина была определена его концентрация в образцах сыворотки крови 25 доноров, она оказалась равной 10,0+0,9 мкМ, что соответствует данным литературы.
![Конструирование и внедрение в практику генодиагностической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы [Электронный ресурс]](/i/i/4289/212277.png "Конструирование и внедрение в практику генодиагностической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы [Электронный ресурс] Тучков Игорь Витальевич")
