Введение к работе
Актуальность темы Метод фотоаффинного мечения (photoaffimty labeling, PAL) широко применяется в структурно-функциональных исследованиях биологических систем Он позволяет получить прямые доказательства пространственной близости молекулярных компонентов Зонд, аналог природного вещества, несущий фотофор (фотоаффинную s фотоактивируемую = фотореактивную метку), вводят в изучаемую систему и подвергают облучению При фотолизе метки образуется высокореакционноспособный интерме-диат - карбен, нитрен, бирадикал и др. - способный ковалентно связываться (сшиваться) с ближайшим фрагментом биомолекулы Для детектирования продуктов реакции - модифицированной макромолекулы и, в конечном счете, участка ее модификации - зонд должен содержать репортерную группу (радиоактивную, хромофорную, флуоресцентную, иммунореактивную) В итоге возможно определить, например, аминокислотные остатки (а о) белка, входящие в контакт лигандом Для получения такой информации чаще всего применяют рентгеновскую кристаллографию (РСА) и ЯМР высокого разрешения Сейчас эти мощные методы анализа поддержаны технологиями получения рекомбинантных ДНК, которые позволяют получать миллиграммовые количества полипептидов и полинуклеотидов Однако такой анализ невозможен или крайне затруднен в целом ряде случаев при изучении комплексов транскрипционных факторов, рибосом, белков в составе везикул, локальных структурных образований цитоскелета и интегральных сигнальных комплексов Здесь PAL является важнейшим методом идентификации субъединиц и картирования активного центра, наряду и в дополнение к исследованиям с помощью точечного мутагенеза и связывания моноклональных антител Главное преимущество PAL состоит в том, что оно применимо к нативным белкам
Роль биологических мембран и липид-белковых комплексов в функционировании клетки и организма в целом сложно переоценить Наряду с физическими методами изучения строения мембран - электронной микроскопией, спектроскопией ЯМР, применением ЭПР- или флуоресцентных зондов, - а также химическими - с использованием моно- и бифункциональных реагентов, разработан метод исследования мембран с помощью фосфолипидных фотоаффинных зондов {Khorana Н G, 1975, Stoffel W, 1978, BrunnerJ, 1980) Развитие этого метода путем поиска новых высокочувствительных фотофоров и синтеза на их основе липидных зондов - актуальная задача мембранологии
Требования, предъявляемые к фотофорам, включают- инертность в отсутствие актиничного света, активацию в условиях, не разрушающих компоненты биологической системы, малое время жизни (меньше времени жизни лиганд-рецепторного комплекса) и высокую реакционную способность возбужденного состояния, минимальный размер, доступность, то есть несложность синтеза. Зонд должен содержать репортерную группу, наличие которой существенно облегчает подготовку и анализ образцов даже при использовании современных масс-спектрометрических (MS) методов идентификации продуктов PAL (Jahn 0, 2004, Kotzyba-Hibert F, 2006) В качестве фотофоров в мембранных исследованиях чаще всего применялись арилазиды и фенил-диазирины Первые довольно легко синтезировать, и они фотолизуются в мягких условиях, однако генерируемые при этом нитрены имеют невысокую реакционную способность Фенилдиазириновая и и-(3-трифторметилдиазири-но)фенильная (Tfd) группы при фотолизе образуют высокоактивные карбены, но синтезы соединений, меченных этими фотофорами, трудны
Домены мембраносвязанных белков и участки апобелков в липид-белковых комплексах, контактирующие с гидрофобными зонами, обогащены неполярными а о Эффективное мечение этих областей возможно лишь при использовании фотофоров, реагирующих даже с неактивированными СН-связями Наше внимание привлекла диазоциклопентадиен-2-илкарбонильная (Dcp) группа Синтез исходного соединения для ее введения - 2-диазоцикло-пентадиенкарбоновой кислоты - не представляет большой трудности (Martin J С, Block D R, 1971) До наших работ Dcp-группа лишь однажды применялась для создания зондов, причем нелипидной природы (Nielsen РЕ, 1983) Впервые синтез !4С- и 3Н-меченых фосфатидилхолинов (PC) и сфингомиели-нов, несущих Dcp-rpymry в ю-положении жирнокислотной цепи, был осуществлен в ИБХ РАН (КарюхинаМО, 1988) с использованием подходов, разработанных для зондов с 2-нитро-4-азидофенильной (Nap) меткой [2-8] Сравнение способности зондов, несущих в «и-2-положении остатки N-Nap-амино-ундекановой и N-Dcp-аминододекановой кислот, ковалентно связываться с []4С]дипальмитоил-РС или [ 14С]холестерином в везикулах из димиристоил-РС, подтвердило более высокую активность Dcp-метки
Дель исследования Целью настоящей работы явились детальные исследования фотохимических свойств диазоциклопентадиен-2-илкарбонильной
группы, разработка и усовершенствование методов синтеза разнообразных липидных зондов на ее основе, разработка метода получения зондов, содержащих удобный в работе высокоактивный радионуклид (1251)
Другой важнейшей задачей было применение полученных зондов для изучения ряда мембранных биологических систем как с целью доказательства эффективности PAL с использованием Dcp-фотофора, так и для получения новых данных об организации различных липид-белковых комплексов Данная часть работы проведена в сотрудничестве с коллегами из различных лабораторий ИБХ РАН, а также других исследовательских учреждений
Научная новизна и практическая ценность Диссертация суммирует результаты оригинальных разработок и синтезов, которые формируют новое направление в рамках развития метода фотоаффинного мечения
В настоящей работе впервые детально исследованы фотохимические свойства Dcp-группы Показано, что она является высокоэффективной карбен-генерирующей меткой, превосходящей по ряду параметров, в том числе, высокой реакционной способности и мягким условиям фотолиза известные и широко применяемые фотофоры [17,22,35,41,45]
Осуществлены синтезы новых 14С-меченых PC-зондов для мембранных исследований, содержащих Dcp-группу при концевом атоме углерода ациль-ных остатков в sn-2 положении на различном расстоянии от полярной головной группы С помощью этих зондов исследована топография цитохрома Р450 2В4 в мембране Полученные данные хорошо коррелируют с результатами конформационного анализа, а также подтверждаются более поздними публикациями авторов, применивших другие методы исследований [9,32]
В ходе разработки синтезов 14С-меченых зондов найден новый основный катализатор - 4-аминопиридин (4PyNH2) - для проведения реакции О-ацилирования в условиях карбодиимидного синтеза в среде органических растворителей Применение 4РуМІ2 в синтезах фосфо- и гликолипидов позволяет существенно увеличить выход при ацилировании малореакционноспособной вторичной ОН-группы глицерина, что имеет принципиальное значение при получении микромолярных количеств радиоактивномеченых, дорогостоящих или нестабильных соединений [10-14,27,31,33]
Обнаружена способность Dcp-группы легко подвергаться иодированию в стандартных условиях окислительного процесса Показано, что при этом фотохимическая активность сохраняется, и заметной потери иода при фотоли-
4 зе не происходит Найденные свойства превращают Dcp-метку в высокоэффективный и удобный в применении фотофор, который позволяет осуществлять синтез нерадиоактивных зондов, а высокоактивный нуклид ш1 вводить в готовую молекулу зонда непосредственно перед применением Положение радиоизотопа в фотофоре делает более надежным анализ продуктов PAL Эффективность применения 1251-меченого Dcp-фотофора для зондирования мембранных систем подтверждена на хорошо изученной биологической модели -вирионе гриппа [17,22,35,41,45]
Разработан синтез алифатической кислоты, несущей при ю-углероде Dcp-фотофор, присоединенный через сложноэфирную связь Целевыми биомолекулами в структурных исследованиях с применением PAL чаще всего являются белки, и наличие сложноэфирной связи, лабильной в щелочной среде в отличие от пептидной, должно облегчить анализ продуктов фотомечения хро-матографическими и MS методами Кислота служит синтоном при получении различных зондов для изучения неполярной области липидного бислоя Синтезирована и максимально короткая карбоновая кислота (в виде активированного эфира) с Dcp-оксигрушюй, с помощью которой можно получать зонды для мечения полярных областей мембран и других биологических систем [22]
Новые ганглиозидные зонды [22,23,41], синтезированные на основе ли-зоганглиозида GM1 и несущие шМ)ср-фотофор в ацильной части церамидно-го остатка на различном расстоянии от олигосахаридной части молекулы применены для исследования взаимодействия различных субъединиц цитоки-новых рецепторов с ганглиозидом GM1 в активированных Т-лимфоцитах Получены сведения, важные для понимания механизма сборки рецептора интер-лейкина-2 и проведения сигнала внутрь клетки [29,44],
С помощью нового зонда, несущего !25І-Оср-фотофор в олигосахаридной части молекулы ганглиозида GM1 вместо ацетила в остатке сиаловой кислоты, определены фрагменты молекулы интерлейкина-4, взаимодействующие с ганглиозидом Исследования проведены в рамках изучения молекулярных механизмов иммуносупрессии ганглиозидами Полученные данные в перспективе могут быть использованы при создании пептидов для цитокинотера-пии различных заболеваний [46]
Впервые для идентифицикации субъединиц мембранного субкомплекса F0 митохондриальной ІҐ-АТР-азьі, непосредственно контактирующих с липи-
5 дами мембраны, применен фотоаффинный фосфатидилхолин Для многосубъ-единичного интегрального белка MS метод анализа продуктов PAL липидным зондом был использован впервые [21,24,37,38]
В рамках изучения механизма взаимодействия потенциальных носителей противоопухолевых препаратов - липосом, несущих углеводные детерминанты - с клетками опухолей [14-16,18-20,26,30,31,34,36,39,40,42,43,48-52], разработан синтез неогликолипидных конъюгатов с Dcp-фотофором, предназначенных для встраивания в липидный бислой липосом [25] Зондирование 251-Бср-мечеными липосомами показало, что на поверхности исследованных опухолевых клеток действительно есть рецепторы (предположительно, лекти-ны), опосредующие взаимодействие с липосомами, оснащенными различными углеводными лигандами [28,47]
Результаты данной работы показывают, что диазоциклопентадиен-2-илкарбонил, будучи компактной, доступной, стабильной в отсутствие акти-ничного света и фотолизующейся в мягких условиях меткой, кроме того обладает высокой реакционной способностью наряду со свойством подвергаться прямому введению 1251, что обеспечивает удобство получения зондов и высокую чувствительность метода Указанные качества превращают Dcp-фотофор в ценный инструмент для биологических исследований
Объем и структура работы Диссертация изложена на 229 стр текста Она состоит из введения, обзора литературы «Метод фотоаффинного мечения и его применив в структурно-биологических исследованиях», 10 глав, посвященных результатам и их обсуждению, экспериментальной части и выводов Работа иллюстрирована 41 рисунком, 16 схемами и 7 таблицами Список цитированной литературы включает 370 наименований
![Экспериментальное исследование эффективности совместного применения цистамина и интерлейкина- 1 [В] при остром радиационном поражении](/i/i/4462/363439.png "Экспериментальное исследование эффективности совместного применения цистамина и интерлейкина- 1 [В] при остром радиационном поражении Зацепин Виктор Викторович")