Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .
1.1. Принципы фотореактивного зондирования мембран 9
1.2. Применение фотореактивных реагентов для исследования липид-белковых взаимодействий
1.2.1.- Неспецифические мембранные зонды 25
1.2.2. Фотореактивные жирные кислоты 30
1.2.3. Фосфолипидные зонды 32
1.2.4. Гликолипидные зонды 50
1.3. Исследование липид-липидных взаимодействий 55
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 61
П.І.І. Синтез фотореактивных С-меченых фосфатидилхолина 2-РС и сфингомиелина 2-SM 63
П.1.2. Синтез фотореактивных С-меченых фосфатидилхолина I2-PC и сфингомиелина I2-SM 65
П. 1.3. Синтез фотореактивных фосфатидилхолина I2-PC и сфингомиелина I2-SM с высоким уровнем тритиевой метки 71
П.2. Локализация фотореактивной метки фосфолипидных зондов в липидном бислое 73
П.З. Изучение липид-белковых взаимодействий в мембране вируса гриппа 74
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 98
Ш.І. Синтез фотореактивномеченых фосфолипидов 102
Ш.2. Везикулы для спектроскопии %-ЯМР и регистрация спектров 107
Ш.З. Образцы вируса гриппа 108
ЗАКЛЮЧЕНИЕ III
ВЫВОДЫ 112
ЛИТЕРАТУРА ИЗ
Введение к работе
В связи с важной ролью биологических мембран и липид-белко-вых комплексов в функционировании клетки и процессах метаболизма в организме в настоящее время интенсивно продолжается разработка оптимальных методов исследования молекулярной организации этих объектов. Наряду с такими физическими методами изучения строения мембран как электронная микроскопия, спектроскопия ЯМР, ЭПР, флуоресцентная спектроскопия, а также химическими методами с использованием различных моно- и бифункциональных реагентов относительно недавно были разработаны методы исследования мембран с помощью ли-пофильных фотореактивных зондов.
Главной отличительной чертой фотореактивных (фотоактивируе-мых, фотоаффинных) зондов является то, что они при освещении способны к образованию ковалентной связи с находящимися рядом молекулами или частями макромолекул. В результате анализа продуктов сшивки можно однозначно определить, с какими молекулами мембраны находился в контакте зонд в момент фотолиза.
Пионерами в исследовании мембран с помощью фотореактивных ли-пофильных зондов были Клип и Житлер, применившие для этой цели І-азидо-4-йодбензол и 1-азидонафталин /I/» Однако эти и им подобные аполярные нелипидные зонды имеют существенный недостаток: их расположение в мембране неопределенно3 , кроме того, они могут нарушать упаковку бислоя, особенно при локализации вблизи полярной части мембраны.
Для флуоресцентных нелипидных гидрофобных зондов, локализация которых в мембране изучена подробно, показано, что они могут на - б Этих недостатков удается избежать при закреплении фотореактивной группировки в определенном положении молекулы мембранного ли-пида, что позволяет изучать участки мембраны на различной глубине липидного бислоя. Метод был предложен и развит Кораной с сотр. /3, 7, а также Штоффелем /Ъ/ и другими исследователями /6/.
На ранних этапах применения фотореактивных зондов в мембрано-логии, когда строение биологических мембран было известно лишь в общих чертах, некоторое распространение получил биосинтетический метод: в среду для выращивания микроорганизмов или культуры ткани добавляли фотореактивномеченую жирную кислоту, которая вступала в метаболизм и входила в состав клеточных липидов. Фотолиз и анализ продуктов сшивок позволял судить о характере липид-белковых взаимодействий (см., например, flj). Однако такой метод применим лишь к ограниченному числу объектов и с его помощью можно получить информацию, касающуюся только общей картины липид-белковых взаимодействий в мембране. Поэтому основное применение в мембранных исследованиях нашел другой подход - синтез индивидуальных фотореак-тивномеченых липидов с последующим введением их в изучаемую систему (мембрану). Такой подход позволяет изучать взаимодействие зондов с отдельными компонентами мембран, причем точно определять участок взаимодействия в цепи макромолекулы (например, конкретный аминокислотный остаток в белке).
Несмотря на значительное количество синтезированных фотореак ходиться в различных областях бислоя. Например, пирен в фосфати-дилхолиновом бислое находится как в его средней зоне (плоскость молекулы параллельна поверхности мембраны), так и между жирноки-слотными цепями, перпендикулярно поверхности мембраны /2/.
Липидов, эффективность большинства из них в качестве мембранных зондов еще недостаточно изучена. Кроме того, практически не проводилось сравнительных исследований с помощью однотипных фотореактивных липидов с различными полярными головками. В связи с этим целью настоящей работы явились синтез двух важнейших фосфолипидов биологических мембран - радиоактивноме-ченых фосфатидилхолинов и сфингомиелинов, несущих фотореактивную группировку на различных расстояниях от полярных головок, достоверная локализация фотореактивных группировок в модельной фосфо-липидной мембране и изучение дифференциального взаимодействия фосфатидилхолина и сфингомиелина с различными белками в биологических мембранах.
