Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 6
2. Литературный обзор 8
2.1. Классификация модифицированных фосфолипидов и методов их получения 9
2.2. Получение исходных соединений. Общие приемы синтеза модифицированных глицерофосфолипидов 15
2.2.1. Методы синтеза модифицирующих исходных соединений 16
2.2.1.1. Флуоресцентно-меченые жирные кислоты 16
2.2.1.2. Спин-меченые жирные кислоты 22
2.2.1.3. Фотореактивно-меченые жирные кислоты 25
2.2.1.4. Жирные кислоты с радиоизотопными и ЯМР-метками 29
2.2.1.5. Жирные кислоты с электронно-плотными метками 32
2.2.1.6. Фотополимеризующиеся жирные кислоты 33
2.2.1.7. Реагенты для модификации полярной части фосфолипидов 34
2.2.2. "Скелетные" исходные вещества и ключевая ста дия получения модифицированных фосфолипидов 36
2.2.2.1. Полусинтетические методы получения модифицированных фосфолипидов 36
2.2.2.1.1. Ацилирование глицерофосфатов и лизофосфо-липидов 36
2.2.2.1.2. Ацилирование гидроксильных групп в полярной головке фосфолипидов и в гидроксиацильных остатках фосфатидилхолинов 39
2.2.2.1.3. S-Ацилирование остатков этаноламина, серина и аминоацильных остатков фосфолипидов 41
2.2.2.1.4. Ы-Алкилирование остатков этаноламина, серина и аминоацильных остатков фосфолипидов 43
2.2.2.1.5. Присоединение по С=С - связям ацильных остатков фосфолипидов 46
2.2.2.1.6. Перефосфатидилирование фосфатидилхолинов фосфолипазой D 46
2.2.2.1.7. Конденсация фосфатидных кислот с модифицированными спиртовыми компонентами 47
2.2.2.2. Синтетические методы получения модифицированных фосфолипидов 48
2.2.2.2.1. Синтез фосфолипидов - производных 2-глицеро-фосфата 49
2.2.2.2.2. Синтез фосфолипидов, модифицированных по глицериновому остатку 50
2.2.2.2.3. Синтез фосфолипидов, модифицированных по фосфоэфирной группе 58
2.2.2.2.4. Синтез фосфолипидов, модифицированных по полярной компоненте 64
2.2.2.3. Биологические методы получения модифицированных гдицерофосфолипидов 65
3. Результаты и их обсуждение. 67
3.1. Синтез и установление структуры антрил- и пиренилстеариновой кислот 68
3.2. Синтез флуоресцентно-меченых глицерофосфо-липидов 76
3.2.1. Синтез фосфатидилхолинов, содержащих 9(10)-антрил- и 9(10)-(4-пиренил)стеариновую кислоты 77
3.2.2. Синтез флуоресцентно-меченых фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилинозита и дифосфатидилглицерина прямым введением метки в природные липиды 78
3.3. Спектральные характеристики флуоресцентномеченых жирных кислот и фосфолипидов и их взаимодействие с модельными и биологическими мембранами 84
4. Экспериментальная часть 90
Выводы 107
- Получение исходных соединений. Общие приемы синтеза модифицированных глицерофосфолипидов
- Жирные кислоты с электронно-плотными метками
- Синтез фосфолипидов, модифицированных по глицериновому остатку
- Синтез флуоресцентно-меченых глицерофосфо-липидов
Введение к работе
В настоящее время:в исследованиях модельних и биологических мембран широко используются флуоресцентные зонды липидной природы. Однако, существующие препаративные методы получения флуоресцентно-меченых Ш имеют ряд недостатков. В одну стадию удается получить только Ш, меченые по полярной части. Эта модификация приводит к изменению заряда полярной головки, и, следовательно, к изменению поведения всей молекулы ©І в целом. Синтез же Ш9 меченых по гидрофобной части, даже в простейшем случае получения флуоресцентно-меченого Ш. включает несколько стадий: синтез флуоресцентно-меченой жирной кислоты, гидролиз Ш фосфолипазой Ag и ацилирование полученного лизо-ФХ активированным производным меченой Ж. В случае других ЗЩ синтез дополнительно осложняется необходимостью защищать функциональные группы в полярной части молекулы.
Многоетадийноеть синтеза большинства флуоресцентных липид-ных зондов ограничивает их использование, поэтому поиск универсального метода, позволяющего получать флуоресцентно-меченые по гидрофобной части липиды различных классов в одну стадию, является весьма актуальной задачей.
Целью настоящей работы является разработка метода прямого введения ароматических хромофоров - антрацена и пирена в молекулы природных глицерофосфолипидов различных классов и ненасыщенных жирных кислот и изучение свойств полученных веществ в качестве флуоресцентных мембранных зондов.
Дурное развитие биоорганической химии последних десятилетий привело к созданию препаративных методов синтеза практически всех основных классов веществ, составляющих живые организмы, в том числе иіФЛ [і]. Однако, задачи, стоящие перед исследователями, все чаще требуют использования модифицированных ЗШ.
Область использования модифицированных $31 обширна. Они являются инструментом для исследования: а) метаболизма отдельных представителей Ш [ 2]; б) молекулярной организации субмолекулярных структур, в состав которых входят Ш (мембран, липопро-теинов плазмы крови и т.д.) и; процессов, происходящих в них [з - 7]; в) ферментов, для которых Ш являются: субстратами [8-12]; кроме этого, некоторые представители модифицированных ФЛ представляют интерес в качестве потенциальных терапевтических средств [іЗ,14].
В принципе, для получения модифицированных Ш можно использовать традиционные методы синтеза Ш [і], однако, в большинстве случаев требуются специальные методики, учитывающие специфику как метки, так и метода их дальнейшего применения. Относительная труднодоступность большинства меток также накладывает отпечаток на стратегию синтеза. Предпочтительным считается введение метки на последних стадиях синтеза, что уменьшает возможность модификации метки (являющейся, как правило, лабильной) в процессе синтеза и позволяет экономно расходовать меченые полупродукты.
Получение исходных соединений. Общие приемы синтеза модифицированных глицерофосфолипидов
В общем случае получение модифицированных I сводится к синтезу исходных соединений и их взаимодействию (ключевая стадия). Исходные вещества для синтеза модифицированных Ш можно разделить на два типа: I) структуры, несущие метку (или модифицированный фрагмент) - модифицирующие соединения; и 2) "скелетные" структуры - определяющие тип требуемого Ш и место метки в его молекуле. В исследованиях модельных и биологических мембран наибольшее распространение получили флуоресцентно-меченые ФЛ с Ж, содержащими в качестве флуорофора остатки ароматических полициклических углеводородов (антрацена [б7-75], пирена [5,76-79] или перилена [80]) (табл. I). Первый синтез флуоресцентно-меченой Ж был осуществлен в 1970 г. Вагонером и Стрером [б8]. Взаимодействием 9-антроил-хлорида (I) с 12-гидроксистеариновой кислотой (2) они получили 12-(9-антроил-окси)стеариновую кислоту (3).(схема I). Схема I. Недостатком этой кислоты является наличие достаточно лабильной еложноэфирной группы, связывающей антраценовый флуорофор с по-лиметиленовой цепью Ж. Это, в частности, не позволило включить ее биологическими методами в состав Ш мембран E.coli f ЗІ. Исходя из 9-антроилхлорида, была получена также Н-(9-антроил)--П-амино-ундекановая кислота (табл. I) [75]. Следующим шагом в синтезе флуоресцентно-меченых Ж явилось создание методов, основанных на использовании 9-(или 2-)антраль-дегида (4) [71,74,75] (схема 2). Штоффель и Михаэлис превращали 9-антральдегид в 9-бромметилантрацен (6) и конденсировали его с комплексами йоцича (7 а-е), полученными действием этил-магнийбромида на соответствующие моно- иг дииновые кислоты, получая соответственно tfi-(9-антрил)моно- и дииновые кислоты (8а-е), Другой метод (предложен Молотковским Юл.Г. и соавторами в 1979 г [75]) заключается во взаимодействии 9-антральдегида с с алкилидентрифенилфосфораном (10) по реакции Виттига (схема 2). Полученный этиловый эфир 12-(9-антрил)-П-додеценовой кислоты (II) (смесь цис- и транс- изомеров) омыляли и кристаллизацией выделяли 12-(9-антрил)-П-транс-додеценовую кислоту (12). И, наконец, третьим подходом к синтезу флуоресцентно-меченых Ж с остатками ароматических полициклических углеводородов, который используется в настоящее время наиболее часто, является метод ацилирования ароматических полициклических углеводородов по риделю-Крафтсу [70,72,76,77,80].
Так были получены 60-(2-антроил)- (15 а-в) иб -(2-антрил)-карбоновые кислоты (16 а-в) [70,72] (схема 3),а)-(1-пиренил)-карбоновые кислоты (20 а-в) [76,77] (схема 4) и 9-(3-перилено-ил)нонановая кислота (24) [80] (схема 5). Н-Дансил- и Н-НБД-аминокарбоновне кислоты (табл. I) получали соответственно ацилированием или алкилированием со-амино-карбоновнх кислот дансилхлоридом [83] или 4-хлор-7-нитробензо-2-окса-1,3-диазолом [81,82] (раздел 2.2.1.7, табл. 4). Необходимо отметить, что флуоресцентно-меченые Ж, содержащие в гидрофобной части гетероатоми (антроил-, периленоил-, да-, НВД-, карбазол-меченые), как правило, вносят большие изменения в свойства ЗШ, чем Ж без гетероатомов (ос- HjB-пари-наровые, антрил-, пиренил-меченые и 2-карбоксиэтилдифенилгекса-триен), однако, часто Ж с полярной меткой оказываются более удобными, так как подобные флуорофорн более чувствительны к изменениям свойств микроокружения [8б]. Аналогично, конденсацией этил-7-оксостеарата (30) с 3-гидрок-силамино-З-метилбутан-2-оном (35) в присутствии аммиака с последующим окислением М-гидроксиимидазолинового производного (36) и омылением эфира получали 7-имоксилстеариновую кислоту (37) [90] (схема 8). Исходным соединением для синтеза проксилышх меток служит 5,5-диметил-д -гшрролин-Н-оксид (38) [91,92] (схема 9), а для азетоксильных - 2-метил- (45) или, 2,5-диметил-Д -пирро-лин-Н-оксид (53) [88,89] (схема 10), В полученных соединениях (44,52) стандартными методами синтеза Ж наращивают углеводородную цепь и вводят в нее карбок-сигруппу [89,91,92]. В случае азетоксильных нитроксилов (52) получается смесь цис- и транс-изомеров, которые в дальнейшем разделяют хрома-тографическими методами [88,89]. Принцип использования фотоактивируемых групп, распространенный на ІЛ в 1975 г. Кораной и: сотр. [ 42], основан на том, что ряд соединений (при фотолитическом разложении) генерируют шсокореактивнне частицы: карбены (58) или нитренн (59), способные присоединяться по С=С- связи или внедряться в С-Н и С-Н - связи близлежащих молекул.
Одним из общих и широко применяемых методов введения изотопных меток ( Н , % ) в углеводородную цепь Ж является гидрирование ненасыщенных кислот в атмосфере 2Н2 или %2. При этом можно получить как насыщенные Ж [103-105] , так и а 11 -цис-моно-или полиеновые, исходя из соответствующих ацетиленовых кислот и гидрируя их на катализаторе Линдлара [102,103]. Замену атомов % на радиоактивный изотоп п можно осуществить также методом гетерогенного каталитического изотопного обмена с газообразным тритием [106,107] или методом термической активации трития [95]. При этом получаются неопределенно-меченые тритием Ж. В случае дейтерия () использование метода гетерогенного каталитического изотопного обмена позволяет осуществить полную замену легкого водорода в Ж на тяжелый изотоп. При этом изотопная чистота пердейтерированных Ж превышает 99# [ 108,109]. Кроме перечисленных, существуют различные методы удлинения углеводородной цепи Ж, позволяющие вводить - -, С-, %- или %-метки в конец (80) [I00,I03,II0] или в середину цепи (86) [101,111 ] (схемы 14,15), а также получать Ж, меченые по карбонильному углероду (92) [98,103,112,113] (схема 16). В литературе описан единственный пример синтеза металлоор-ганического аналога Ж, 12Д2-диметил-12-станнагексадекановой кислоты (109), предпринятого с целью получения зондов для исследований ультраструктуры биологических мембран [Пб] (схема 19). Исходный триметилхлорстаннан (102) обработкой бутиллитием (108) превращали в тетраалкильное соединение олова (104), которое переводили в оловоорганический бромид (105) с последующим восстановлением до соответствующего гидрида (106). Присоединением бутилдиметилстаннана (106) к метил-10-ундеценоату (107) и омылением эфира (108) получали оловоорганический аналог пальмитиновой кислоты (109).
Жирные кислоты с электронно-плотными метками
В отличие от ртутьорганических соединений, хорошо рассеивающих электроны [lI7], оловосодержащую Ж (109) не удалось обнаружить в составе Ш клеточных мембран методом обнчной электронной микроскопии [ііб]. Однако, оловянная метка легко идентифицировалась методом рентгеновского микроанализа с рассеянием энергии в аналитическом сканирующем электронном микроскопе [Пб], что позволяет использовать оловосодержащие Ж и Ш в качестве зондов для исследований организации Ш в биомембранах. 2.2.1.6. Шотополимеризующиеся жирные кислоты. Начиная с 1980 г., несколькими исследовательскими группами независимо друг от друга осуществлены синтезы Ш, содержащих в ацильных цепях фотополимеризующиеся группы: сопряженные ди-ацетиленовую и диеновую [47,48] или метакрилоилокси-группу [49]. Для создания сопряженных двойных и: тройных связей в жирно-кислотной цепи использовались классические метода синтеза полиненасыщенных ЯК [47,48 ] (схема 20). Подавляющее большинство меченых Ш с меткой в полярной части получено непосредственной модификацией полярной группы Ш природной структуры [40-46,68,120-125]. Модифицирующими соединениями в этом случае являются сами метки, снабженные активными функциональными группами (табл. 4, а также раздел 2.2.2.: fe.fe.fe.JL.46 , fe.fe.fe.JL.Oa, fe.fe.fe.JL.41. / Если требуется изменить тип полярной группы в молекуле Ш (например, при получении аналогов Ш с различным расстоянием межде атомами РиН или содержащих полярные группы иной природы, не являющиеся производными полярных групп природных ФЛ) обычно прибегают к различным вариантам химического синтеза: фосфорилированию различных производных глицерина, в частности 1,2-диглицеридов и 1,2-0,0-изопропилиден-гас-глицерина, соот- НН2-группЕг этаноламина и серина блокируют о-нитрофенилсуль-фенильной, трет-бутилоксикарбонильной и фталоильной защитными группами; СОШ-группу серина - трет-бутильной и фталимидометиль-ной группами [ і]; СН-группы миоинозита - ацетильными группами [і,64]; гидроксигруппу глицеринового остатка ДрГ, как правило, не блокируют [127] вследствие незначительной ее реакционной способности.
Получающийся по этому методу синтеза меченый Ш (124) представляет собой смесь молекулярных типов, различающихся по кислоте в первом положении глицеринового остатка. Для синтеза индивидуальных веществ используют прием, состоящий в щелочном гидролизе Ж (120) и последующем ацилировании глицерофосфохолина (125) меченой Ж [49,53,65,66,77,93,97,115] (схема 23). Для получения разнокислотных Ш глицерофосфохолин (125) ацилируют сначала природной Ж, соединение (126 б) подвергают фер-ментолизу Фл Ag и ацилируют лизо-ЗЗС (127) меченой Ж [ 10,93,98, 101 ] (или наоборот - в этом случае получают Ш с меткой в первом ацильном остатке [49,65,66,97,115]) (схема 23). Ацилирование лизо-ШЛ (122,127) и глицерофосфатов (125) осуществляют методами, традиционными в химии Ш [і]. В качестве ацилирующих реагентов используют хлорангидриды модифицирован-НБК кислот [64,74-77,94], а также более эффективные (особенно в случае труднодоступных и лабильных меченых Ж) ангидриды Ж в присутствии их легко диссоциирующих солей с щелочными металлами [ 63,81,115], оксидов щелочных металлов [116,124,128,129] или 4-Н,Н-диметиламинопиридина [49,53,65,72,80,85,93,95,97-99, 101,130], жирные кислоты в присутствии трифторуксусного ангидрида и пиридина [іЗі] и имидазолиды Ж [б6,69,89,92,9б]. 2.2.2.1.2. Ацилирование гидроксильных групп в полярной головке; фосфолипидов и в;гидроксиацильннх остатках фосфатидилхолинов. Известны лишь два примера непосредственного введения- метки в полярную часть JW и . В первом случае [123] природный Щ ацилировали хлорангидридом 2,2,5,5-тетраметилпирролин-Н-оксил-3-карбоновой кислоты (129) в присутствии пиридина (схема 24). Однако, известно, что гидроксил JW в этих условиях не поддается ацилированию [127], поэтому в данном случае маловероятно получение приемлемых выходов при адилировании. Схема 24. В ряде случаев получения меченых по гидрофобной части Ш (особенно в случае лабильных меток) целесообразным оказывается введение метки в готовую молекулу Ш, содержащую в одном из ацильных остатков (обычно, во втором положении глицеринового остатка, а иногда - в обоих) гидронси- или аминогруппу [82,83, 97,130]. Так, ацилированием гидроксил-еодержащих Х (135,139) 3,3,3-трифтор-2-диазопропионилхлоридом (табл. 4) или хлорформи-лированием фосгеном с последующей заменой хлора на азидную группу, были получены фотореактивно-меченые ФХ (137,139,140) [97] (схемы 26, 27).
Ацидирование аминогрупп в ацильных остатках Ш (143), содержащих а -аминокарбоновые кислоты, дансилхлоридом (141) или 3-(3-[І25і]иод-4 -гидроксифенил)пропионилхлоридом (145) позволило получить флуоресцентно-меченый Ш (144), содержащий в ациль-ной цепи И-даС-группу (схема 29) [83], а также радиоактивный аналог С, меченый 1251 (146) [іЗО] (схема 29). Известно много примеров алкилирования аминогрупп ФЭ и ФС. Так были получены Ы-НВД-ФЭ [120] (схема 30), Н-НВД-ФС [ю] и Ы-(4 азидо-2-нитрофенил)-ФЭ [42]. Для получения парамагнитного аналога ФЭ использовался также метод восстановительного алкилирования аминогруппй ФЭ [l2l] (схема 31). Один из немногих примеров синтеза ФЛ с электронно-плотной меткой также основан на алкилировании (точнее арилировании) ФЭ цианурхлоридом (155) [ш] (схема 34). Последующая замена атомов С1 на SH-группы и реакция с МШМ (меркарбидная электронно-плотная метка - ртутьорганическое соединение, детальное строение которого не установлено, однако, известно, что оно имеет в своем составе не менее четырех атомов ртути и содержит группировки. С-Нд-Х, пде:Х - анион кислоты) приводили к соединению (157). Вся последовательность реакций (120- -157) проводилась с ФЭ, инкорпорированным в липосомы, что, с одной стороны, позволило остроумно обойти проблему растворимости ртутьсодержащих соединений, но, с другой стороны, не позволило охарактеризовать полученное соединение. Введение метки по двойным связям ацильных остатков Ш является наиболее простым методом получения модифицированных по гидрофобной части 9ЭД; Его используют, главным образом, для введения изотопных (%, % ) меток и некоторых гетероатомов (Вг) в природные ЗШ [105,132] . 2.2.2.1.6. Перефосфатидилирование фосфатидилхолинов фосфолипазой D . Очень интересные возможности по синтезу модифицированных Ш появились в связи с открытием реакции перефосфатидилирования ШХ в присутствии фермента фосфолипазы D . Так, были найдены условия, в которых Фл D обменивает холиновую группу Ш на этанол-амин [124,130,133], глицерин [124,134] , серии [l26,I30] , миоино-зит [l35]. Это позволяет унифицировать схему получения модифицированных ЁП: синтез меченого Ш. и его перефосфатидилирование фосфолипазой D в присутствии этаноламина, серина, глицерина или миоинозита, или ферментативный гидролиз с образованием Ж (схема 36). Так были получены флуоресцентно-меченые 1ЭиШ [ 133,135], спин-меченые ФЭ, ШГ и Ж [124,128], фотореактивно-меченые ФЭ и ШГ [99,134], а также радиоактивные аналоги ФЭ, ФС и Ш, меченные 1251 [130]. Для получения ШС, спин-меченного по гидрофобной части [129] или радиоизотопно-меченного по полярной части [13б], был применен другой вариант ферментативного синтеза: превращение Ж (160) в ЩР-диглицерид с последующим взаимодействием его с L- серином в присутствии ФС-синтетазы (схема 36).
Синтез фосфолипидов, модифицированных по глицериновому остатку
Для спентрофотометрических исследований фосфолипаз оказалось удобным использование их тиоэфирннх субстратов [ll,12]. С этой целью были синтезированы аналоги Ш и ФЭ, у которых или сложно-эфирная связь в первом положении глицеринового остатка молекулы заменена на тиоэфирную (189,191) [12] (схема 40),или фосфоэфир-ная связь - на тиофосфоэфирную (194,196) [її] (схема 41). Тйоэфирные аналоги ШЛ (І89,І9І,І94,І95)получали из 1-меркапто-глицерина (183) классическими методами синтеза ЩИ [і]. В спектрах 31Р-ЯМР химические сдвиги ядер 31Р тио-Л (194,195) и Ш природной структури различаются на 19 м.д. [іб], что позволяет с помощью методики селективного насыщения [іб] дифференцировать тио-ШЛ в составе липосомальных мембран. Следовательно, тиоаналоги Ш (194,195) можно использовать в качестве зондов для изучения мембран методом ЗІР-ЯМР [іб]. Для этого синтезировали и диалкильный тио-ШХ (200) [іб]. В основу схемы синтеза был положен обычный для химии липидов метод, основанный на фосфорилировании 1,2-диглицеридов (схема 42), Введение меркаптогруппы в молекулу 1,2-диглицерида осуществлялось взаимодействием 1,2-дигексадецил-З-бром-З-дезокси-гас-глицерина (196) с тиомочевиной (197), образующуюся алкилтиурони-евую соль (198) щелочным омылением переводили в меркаптодигли- Схема 42. Заменой сложно эфирной связи во втором положении глицеринового остатка Ш на амидную были получены аналоги ФХ, негидролизуемые Фл А2. Первый синтез ациламидного аналога ФХ, осуществленный Бонсеном и соавторами исходя из L-серина [17], привел к рацемическому соединению.
Позднее были разработаны методы, основанные на использовании D-серина (201) [їв](схема 43) или L-серина (210) [19](схема 44), которые позволили получить оптически активные соединения (209,218). В обоих синтезах ключевой стадией является образование оксазолинов (203,212), что позволяет восстановить сложноэфирную группу до гидроксильной и блокирует амино- и гидроксигруппы при фосфорили-ровании и последующей кватернизации соединений (204,206) или при алкилировании свободной гидроксигруппы в соединении (213). Амидо-ФХ (209) является специфичным ингибитором Фл А2, проявляющим даже большее сродство к ферменту, чем природный субстрат [їв], а І-алкокси-2-ациламино-ФХ (218) проявляют сильную PAF-активность, обладают антигипертоническими свойствами и цитоток-сическими свойствами по отношению к HL-60-клеткам [ 19]. В качестве потенциальных антиметаболитов была синтезирована серия F- и CI -содержащих аналогов алкиллизо-ФЛ [14], включающая в себя различные структурные изомеры рацемических длинноцепннх алкилдезоксигалоидоглицерофосфохолинов (221а-в), -Я,Ш-диметил Было обнаружено, что алкилдезоксигалоидоглицеро- ЁХ (221а-в) значительно ингибиругот пролиферацию клеток асцитной карциномы Эрлиха in vitro [l4]. С целью изучения субстратной специфичности Шл.А2 были синтезированы аналоги $Х, в которых остаток глицерина замещен на остаток ш,ш-алкандаола (226) [17,21,22] (схема 46) или же на В 1978 г. Нифантьевым Э.Е., Предводителевым Д.А. и Аларконом Х.Х. предложен удобный метод получения ШХ, тионных аналогов ШХ (252а), а также аналогов с различным расстоянием между атомами Р и S (2526) на основе алкиленфосфитов производных глицерина (250а,б) путем их окисления (или сульфуризации) и последующего взаимодействия циклических фосфатов или тион-фосфатов (251а,б) с триметиламином [27] (схема 49).
Другим методом введения тиофосфатной группы в молекулу Ш является фосфорилирование 1,2-диацилглицерина (248) сульфотрихлори- дом фосфора (253) [30,31] (схема 49). Этот метод позволяет получать тионные аналоги не только ФХ (252а), но и ФЭ (256). С использованием методов фосфитной химии с последующим превращением фосфитов (258,264) в тионфосфатн (259,265) бнла получена и тион-Ж (261) [28,29] (схема 50). Тионные аналоги ФИ используют в качестве зондов в ОІР-ЯМР исследованиях биологических мембран и их моделей, так как химические сдвиги ядер 31Р тион-ФП и Ш природной структуры различаются на 57 м.д. [l45]. Это позволяет дифференцировать тион-Ш с помощью %-ЯМР даже-в составе липосомальннх и биологических мембран, где ширина сигналов достигает 50 м.д., и, следовательно, дает возможность изучить поведение отдельных классов Ш в мембранах [145]. Методы получения ЗШ, содержащих С-Р - связь (фосфонолипидов) различаются в зависимости от того, какая компонента молекулы ФЛ связана с атомом фосфора посредством С-Р - связи [32-39]. Фосфонолипиды, в которых азотсодержащий остаток (полярная компонента) присоединен к фосфору посредством С-Р - связи (этот тип фосфонолипидов был обнаружен в ряде морских организмов [32]) получают фосфорилированием диацил-, диалкил- или ацилалкилглице-ринов (268) хлорангидридом соответствующей замещенной фосфоновой кислоты (267,270) [32-38] (схема 51). Для синтеза другого типа фосфонолипидов (в которых полиол связан с фосфором посредством С-Р - связи) использовали реакцию галогенидов ацильннх или алкильных производных полиолов (273) с триэфирами фосфористой кислоты (274,277) (алкилирование по Арбузову) или с диэтилфосфитом натрия (279) с последующим омылением образующихся диэтиловых (278) или бис(триметилсилильных) эфиров фосфоновых аналогов Ш (275) [38] (схема 52). Соответствующие фосфоноше аналоги ФХ (280) и ФЭ (281) получали из Ш (276) традиционными методами [38] (схема 52). Алкилирование по Арбузову диизопропилаллилфосфонита (282) иодгидрином 1,2-диалкилглицерина (273) было использовано Розен-талем и соавторами в оригинальном синтезе фосфинатного аналога Ш (содержащего G-P-C - связи) (287) [38] (схема 53).
Синтез флуоресцентно-меченых глицерофосфо-липидов
Определение основных условий оптимального проведения алкили-рования антрацена и пирена олеиновой кислотой, а также установление структуры образующихся веществ, позволили перейти к исследованию взаимодействия аренов с природными глицерофосфолипидами. С целью сравнения разрабатываемого метода с традиционным синтезированные кислоты (5,7) были использованы для получения флуоресцентно-меченых фосфатидилхолинов по известной методике [93]. 3.2.1. Синтез фосфатидилхолинов, содержащих 9(І0)-антрил-и 9(10)-(4-пих енил)стеариновую кислоты. І-Ацил-2- [9(ІО)-антрилстеароил] - ь-глицеро-3-фосфохолин (АС-ШХ,23) и І-ацил-2- [9(10)-(4-пиренил)стеароил] 5П глицеро-3-фосфохолин (ПС- Ж,24) (схема 4) получали ацилированием яичного лизофосфатидилхолина (22) ангидридом соответствующей арил-стеариновой кислоты (20,21) в присутствии 4-Н,Н-диметиламино-пиридина. По хроматографической подвижности АС-ІХ (23) и ПС-ШХ (24) не отличались от яичного С, их УШ-спектры и спектры флуоресценции были идентичны спектрам соответственно АС (5) и ПС (7). Оба флуоресцентно-меченых Ш. (23,24) гидролизовались практически нацело л А2 змеиного яда с отщеплением соответствующей арил-стеариновой кислоты (5,7); при этом 4-5% флуоресцентно-меченых кислот содержалось в лизофосфолипидах, что, по-видимому, является следствием ацильной миграции, происходящей в той или иной степени при любом методе химического ацилирования лизофосфати-дилхолина [80,99]. 3.2.2. Синтез флуоресцентно-меченых фосфатидилхолина, фосфа-тидилэтанодамина, фоофатидилинозита и дифосфатидил-глицерина прямым введением метки в природные липиды. Алкилирование антрацена и пирена природными глицерофоефоли-пидами: яичными Ш (25) и ШЭ (26), Ш из пекарских дрожжей (27) и ДФГ из сердца быка (28) - проводили при комнатной температуре в дихлорэтане, используя 1,5-2 - кратный избыток арена (схема 5). Меченые Ш выделяли колоночной хроматографией на силика-геле. По хроматографической подвижности полученные вещества (29-36) не отличались от природных Ш. УШ-спектры и спектры флуоресценции антрил- (29-32) и пиренил-меченых Ш (33-36) подобны спектрам соответственно АС (5) и ПС (7). Сопоставление У -спектров АС-ЗЖ (23) и ПС-ШК (24) со спектрами антрил- и пиренил-меченых Ш (29-36) показало, что последние представляют собой смеси меченых и исходных веществ, и позволило определить их соотношения.
В ходе исследований было установлено, что степень модификации Ш (25-28), в основном, зависит от количества катализатора. При использовании двух экв. хлористого алюминия метку содержали только 8-996 молекул Ш, при уменьшении количества катализатора до 1,5 экв. продуктов присоединения арильного остатка к-ацильным остаткам Ш обнаружено не было, а при увеличении до 5 экв. антрильную метку содержали уже 67# выделенного фосфати-дилхолина (29,А-$Х) и 4А% фосфатидилэтаноламина (30,А-$Э), а пиренильную - во% фосфатидилхолина (ЗЗДІ-ВД и Ш фосфатидил- этаноламина (34,П-ФЭ). В случае Ш содержание пиренильной метки удалось увеличить до 8396 при 5,5 экв. катализатора. Влияние количества хлористого алюминия на состав продуктов реакции: можно объяснить тем, что в молекулах Ш имеется несколько групп, способных координировать с хлористым алюминием (сло-жноэфирные и фосфатные группы, а в Ш и W, кроме этого,- гид-роксигруппы), выводя катализатор из реакции [l57,c.346-353J. Вследствие этого Ш (27) и ДШГ (28) метились значительно хуже других фосфолипидов: при 5 экв. хлористого алюминия в Ш (31,35) Во втором положении глицеринового остатка изображена олеиновая кислота, так как на ее долю приходится более 50# ненасыщенных кислот, содержащихся в указанных природных ШЛ. содержалось 15-1895 меченых веществ, а в ДШГ (32,36) - 9-ICP6 аценовой метки. При более чем 4 экв. хлористого алюминия наблюдались процессы, приводящие к образованию меченых Щ, отличных от веществ (29-36); полученные вещества содержали димеры антрацена и антрацен или пирен, присоединенные к двум остаткам жирных кислот. Так, при щелочном гидролизе были выделены кислоты (8,10,37), полученные и при алкилировании аренов олеиновой кислотой. Кроме этого, происходило образование флуоресцирующих веществ, дающих положительную реакцию на фосфор, но имеющих хроматогра-фическую подвижность, значительно меньшую, чем у природных Ш (по-видимому, продукты межмолекулярной сшивки ареной нескольких молекул Ш1).
Эти побочные реакции приводили к существенному уменьшению степени целевой модификации природных Ш (25-28) (приводящей к образованию флуоресцентно-меченых $П (29-36)) при использовании более 5-5,5 экв. хлористого алюминия в реакции с ЩХ (25), 4,5 - 5 экв. - с ФЭ (26) (рис. 4) и 5-6 экв. - с Ш (27) и с да (28). В оптимальных условиях степень модификации Ш (25-28) соответственно антраценом и пиреном достигала: в случае Ш (25) -22 и 2№, ФЭ (26) - II и IW, Ш (27) и Щ (28) - 5-4 . При попытке использовать более мягкие катализаторы алкилирования, такие как хлористый цинк или трифторуксусная кислота, продуктов алкилирования аренов обнаружено не было даже в случае олеиновой кислоты и ее этилового эфира. Флуоресцентно-меченые фосфолипиды (29-36) идентифицировали ТСХ в сочетании с определением полярных группировок: холина -реактивом Драгендорфа, этаноламина - нингидрином и миоинозита -периодатом с последующей обработкой бензидином [ 158]. Ш (31,35) подвергали также гидролизу специфичной к фосфатидилинозиту Шл С из мозга крысы и из Bacillus cereus , а для ДФГ определяли соотношение сложнозфирных груші, глицерина и фосфора [126, с. 61-64]. Строение синтезированных веществ (29-36) также подтверждали с помощью спектральных методов: УШ-, флуоресцентной спектроскопии и масс-спектрометрии, а также методами химического и ферментативного расщепления. По данным масс-спектрометрии при мягком щелочном метанолизе антрил- и пиренил-меченых Ш (29-36) образовывались, в основном, метиловые эфиры соответственно АС ( М+»т/2 474) и ПС ( М , m/z 498). Из других арилсодержащих кислот в случае ФЭ и ДФГ отмечалось образование антрил- и пиренилоктадеценовой кислот (m/z соответственно 472 и 496), т.е. продуктов взаимодействия аренов с линолевой кислотой. Для оценки распределения флуоресцентно-меченых кислот в молекулах Ш (29-36) проводили их расщепление Фл А2 змеиного яда. Все ФЛ, кроме ДФГ (32,36), гидролизовались данной фосфолипазой (на 85-90%)х, при этом 90-95% флуоресцентной метки содержалось в Ж, а 5-10% - в лизо-ФЛ. То есть, метка распределяется, в основном, в соответствии с распределением ненасыщенных жирных кислот в молекулах природных Ш. Для подтверждения: этого было осуществлено Прямое Введение аНТрИЛЬНОЙ МеТКИ В І,2-ДИОЛЄОШН5П- глицеро-З-фосфохолин30 (38) (схема 6) с последующим анализом образующихся веществ. Ферментативный гидролиз А-ФХ (39 а-г) фосфолипазой А2 проходил на 90%, при этом в жирных кислотах присутствовало 41% метки, в лизо-ФХ - 49% и в негидролизовавшемся А-ФХ - 10%. В продуктах щелочного метанолиза фракций негидролизовавшегося А-ФХ и лизо-ФХ были: обнаружены в значительных количествах метиловые эфиры антрилдистеариновой кислоты (8): соответственно 4 Й6 и 29% (причем, во втором случае - монометиловый эфир антрилдистеариновой кислоты (41)). Всего же, по данным УФ-спектров в продуктах щелочного метанолиза флуоресцентно-меченого ФХ (39 а-г) содержалось до 19% кислот, сшитых антраценом (8). А-ФХ (39г), содержащий такие кислоты, медленнее гидролизуется Фл Ag, поэтому негидролизовавшийся А-ФХ обогащен ими. хДальнейшее расщепление фосфолипидов (29-31) и (33-35) проходило с незначительной скоростью и сопровождалось накоплением продуктов неспецифического гидролиза. Синтезирован Шрагиным А.С., МЙТХТ им. М.В.Ломоносова.
