Введение к работе
Актуальность проблемы исследования лектинов определяется,
с одной стороны, широким использованием их в качестве биореагентов для решения разнообразных задач в биологии (цитологии, генетике, биохимии, молекулярной биологии, иммунологии), биоорганической химии, клинической диагностике и др., а с другой - изучением функции лектинов в растительной и животной организме ( Simp-eon et al.,1978; Линевич,1979; Barondes, 1983; Королев,1984).
В качестве биореагентов лектины в первую очередь используют для очистки гликопротеинов, в том числе из клеточных мембран,
И характеристики ИХ уГЛевОДНЫХ ГруПП (Lotan, Nioolson, 1979; Irimura, Nioolson,, 1983) .ДЛЯ ЭТИХ ЦЄЛЄЙ ОНИ применяются Наряду
с антителами против углеводных детерминант, однако получение лектинов связано с меньшими затратами, чем в случае антител. Как инструменты исследования не следует противопоставлять монокло-нальные антитела и лектины, методика их применения в исследовании структуры углеводов практически одинакова, рационально использовать и лектины, и антитела для получения полезной информации.
Очистке.лектинов и их характеристике за рубежом уделяется
значительное внимание. Ряд крупнейших фирм, производителей биохимических ре ктивов, наладили выпуск целой серии лектинов.и их производных, которые широко применяются в научных Исследованиях.
- k -
Агглютинины, обладающие специфичностью к изннозе, галактозе, Н-ацетилгэлэкгоэаиину, N-ацётилглюкозамину представлены довольно значительным числом препаратов, в то время как ь-фукозо- и сиалоспецифичные лектины труднодоступны и получаются из дефицитного сырья. В нашей стране настоятельно необходим поиск новых сырьевых источников, получение и характеристика лектинов, эквивалентных по специфичности малодоступным зарубежный образцам.
Использование лектинов для изучения структуры и функции гли-колротеияов, в особенности клеточных мембран, представляется весьма важном и перспективным направлением. Несмотря на то, что гликопротеины играют важную роль в структурной организации и функции клеточных мембран, наши знания о них в настоящее время явно недостаточны (Nicolson, 1974; Евгеньева,1977). По существ; имеется информация о структуре только гликофорина А мембран эритроцитов человека (Хьюз,1985). Это в значительной степени обусловлено трудностями получения достаточного количества чистых иеибранных гликопротеинов для проведения их анализа и устеновле лия структуры. В связи с атим чрезвычайно актуальной задачей отоновится резкое повышение чувствитольности аналитических мето дов химии углеводов, для решения этой проблемы лектины представ ляют несомненный интерес. Во-первых, реакция связывания лектино с углеводными детерминантами обладает высокой чувствительность» благодаря использованию метки флиорохромом, ферментом или радис изотопом. Во-вторых, с помощью хроматографии на иммобилизирс-ванных лекгинах успешно решается проблема очистки мембранных гликопротеинов и гликопептидов. Если в области аффинной хроматографии не встречается принципиальных трудностей, то применен! лектинов ь качестве специфических реагентов на углеводные групі нуждается в основательной разработке. В первую очередь это свя: но с ограниченным количеством лектинов с известной тонкой углеводной специфичностью. Под ней понимают сродство активного цен' га лектинэ к углеводной детерминанте определенной структуры в составе гликопротеинз или гликолипида.
Применение химической и энзиматичоской модификаций углевод цепей с последующим анализом связывания лектинов позволит суще> венио расширить арсенал методов определения структуры углеводн цопо? в глшеопротеинэх и гликолкпидах.
Coptphiwo знчнпЯ в области исследования лектинов представл ется следующим. Этап разработки технологии получения препарате лектинов с различное углеводной специфичностью, получение прои
юдішх и коньюгатов лектинов с ферментами и другими типами меток ложно считать завершенный. Используется главным ооразсм аффинная сроматография не сорбентах, содержащих углеводные детерминанты, і который проявляют сродство лектини. В 70-х годах за рубежом был эсвоен промышленный выпуск препаратов, применяющихся в настоящее зремя а научных исследованиях. Продолжается поиск новых препарэ-гов, которые в ряде случаев превосходят по специфичности ранее известные (например, сиалоспецифичный лектин из слизня Limax flsvus),
К сожалению, этот аспект исследования лектинов не получил
доланого развития в нашей стране. В результате мы не имеем прэк* тически ни одного выпускаемого промышленным способом препарата лекгина или его производного, который можно было бы применить для структурних исследований гликопротеинов или клеточной поверхности. Это тем более достоЛно сожаления, что в нашей стране в SO-e годы проводились исследования т области лектинов и были получены новые оригинальные результаты (Потапов, 1970; Голынскап и др.,1979,1980).
В связи с этим в нашей работе (была начата в 1969 г.) один из аспектов был посвящен разработке методик очистки лектинов из различных источников. Получено ряд новых лектинов (см. таблицу I), разработаны методики с применением отечественных материалов. Предложенные методы, имеющие элемент новизны, могут служить основой для разработки промышленной технологии получения лектинов.
3 настоящее время разрзбатызаются следующие прикладные аспекты использования лектинов: применение в цито-и гистохимии для характеристики гликопротеинов и других гликоконьюгзтов в норме и в патологии; биохимический и структурный анализ клеточных и тканевых гликопротеиноз*; выявление групповых аллоантигенов в гематологии и судебной медицине; исследование механизмов взаимодействия макромолекул и клеток и процессов распознавания на молекулярном уровне. Несколько меньшее внимание уделяется разработке вопросов физиологической роли лектинов в различных биологических системах.
хНовым и перспективным методом характеристики гликопротеинов, присутствующих в биологическом материале в смеси с другими биополимерами, является комбинирование электрофореза в полнакриламид-ном геле с последующим исследованием отдельных гликопротеиновых 'Нунций с помощью лектинов и модификации углеводных цепей (Irimura. ntcolson, 1983,198^).Принципиально метод позволяет исследовать структуру углеводных групп гликопротеинэ без получения его 3 ЧИО-том состоянии.
Цель нзией работы состояла в получении и характеристике чис тых лектинов с обращением особого внимания на углеводную специфичность и использование их в качестве реагентов для выявления и характеристики гликопротеинов клеточных мембран.
В процессе выполнения работы решались следующие задачи:
-
Поиск новых источников для получения лектинов, разработка новых методов очистки и получение чистых лектинов, в том числе и вых препаратов, характеристика их физико-химических свойств и уг леводной специфичности.
-
Разработка методов получения меченых лектинов с целью визуализации их при ультраструктурных исследованиях клеточной поверхности и при биохимическом анализе мембранных гликопротеинов. В качестве ыеток использованы электронно-плотные вещества (фер-ритин, коллоидное золото}, ферменты (пероксидаза хрена},флюоресцентные красители (ФИТЦ, родаиииоульфонилфторид;.
-
Разработка методических подходов к исследованию гликопро-теинового состава плазматических мембран, характеристике их углеводных компонентов по связыванию лектинов с известной углеводной специфичностью.
Ч". Исследование элекгрофоретического спектра гликопротеинов ыемброн клеток крови (эритроцитов, тромбоцитов здоровых людей), тимоцигов крысы, клеток зародышей рыб (вьюна}.
Научная новизна работы. Разработаны новые аффинные сорбенты для очистки лектинов на основе природных полисахаридов (гуммиарабика, га лакт оманна на пажитника, яичного белка - овогель). Сорбенты получвготся из доступных и дешевых материалов, они обратные сорбируют большой набор различных ллстинов. Разработана система поиска и исследования лектинов с заданной углеводной специфичностью. Получены и охарактеризованы следующие новые препараты лектинов: крист. лектин гороха, лектин из омелы, лектин из коры бобовника анагиролистпого, лектин из икры вьюна (анти-В), лектины онти-Н из бузины травянистой и анти-и из горошка одно-парного(послсднио два препарата разработаны совместно с Ы.И.Пои повьш);продложены оригинальные методики очистки агглютининов из сои, зародыше!! пшеницы, софоры ялонской.
Из описанных в литературе и воспроизведенных нами группоспе цифичных лектинов, а также полученных впервые высокоспецифичных препаратов онти-В и анти-Н предложен набор для определения груп новых антигенов системы ABO, е также антигена и.
Модифицированы методы флюорохромировэния лектинов ФИТЦ и
родэминсульфонилфторидом, а такие получения коньгагатов лектин-пероксидазы с целью увеличения выхода и максимального сохранения свойотв целевого продукта. Впервые предложено использовать в качестве второго реагента в непрямых методах выявления связанных лзктиновконьюгатытиреоглобулина или асиалотиреоглобулина с пер-оксидазой.
Методом электронной цитохимии охарактеризована углеводная структура поверхности клетоїс нейробластомц'С 1300 (совместно с сотрудниками Института биохимии им. А.В.Палладинз д-ром мед. наук 0.А.Хомутовским и канд.биол.наук О.Ф.Передерни).
Описаны электрофоретичоские спектры мембранных гликопротеинов эритроцитов, тромбоцитов человека и кролика в норме, что монет служить отправным пунктом для исследования.изменения мембранных гликопротеинов клеток при патологии. Изучены тзкке спектры гликопротеинов плазмэтичеоких мембран клеток зародышей вьюна и их изменения в процессе развития, состав гликопротеинов плазматических мембран тимоцитов крысы.
Научно-практическое значение работы. Разработанный методический подход к анализу состава гликопротеинов клеточных мембран с помощью электрофореза и связывания лектинов значительно расширяет информацию о составе макромолекулярных мембранных компонентов. Метод открывает новые возможности для исследования структуры углеводных групп гликопротеинов, особенно при ограниченной доступности материала. Предложенная система целейаправленпого поиска лектинов может быть полезной в лабораториях, производящих этот поиск. Разроботашше методики очистки лектинов могут слунить основой для промышленной технологии производства-лектинов и их меченых производных.
Апробация работы. Материалы исследований доложены на 12-и Международном ботаническом конгрессе (Ленинград,197'+), симпозиуме СССР-ФРГ по химии пептидов и белков (Душанбе,1976), Ш и ІУ Украинских биохимических съездах (Донецк,1977; Днепропетровск, 1982), Ш Всесоюзном биохимическом съезде (Рига,1974), Всесоюзном гаколе-семинзре "Химия и биохимия углеводов клеточной поверхности микроорганизмов" (Саратов,1985)» Всесоюзной конференции rto гемодинамике и, микроциркуляции (Москва,1984), Республиканской конуеренции "Механизмы иммуностимуляции" (Киев,1985), У Всесоюзном биохимическом съезде (Киев,1986), Способ" получения фитогемагглютинина внедрен на Олайнском заводе химреактивов. Публикации. По теме-опубликовано 56 научных работ, из них две
монографии, получено четыре авторских свидетельства.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, восьми глав, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 405 источников, среди них 52 отечественных авторов.
