Содержание к диссертации
Введение
Ферментативный синтез искусственных генов (литературный обзор) 7
Ферментативный синтез искусственного гена пептида сна (обсуждение результатов) . 43
Экспериментальная часть 78
Выводы 116
Литература 117
- Ферментативный синтез искусственных генов (литературный обзор)
- Ферментативный синтез искусственного гена пептида сна (обсуждение результатов)
Введение к работе
В последние годы наряду со структурным изучением нуклеиновых кислот интенсивно развиваются исследования по синтезу искусственных генетических структур. Существует два способа получения искусственных генов: синтез ДНК на матрице мРНК с помощью обратной транскриптазы (обратная транскрипция) и сшивание химически синтезированных олигодезоксинуклеотидов с помощью ДНК-лигазы (химико-ферментативный способ). Методом обратной транскрипции возможно получение только структурных генов - фрагментов ДНК, кодирующих последовательность аминокислот в полипептидной цепи. Для получения полных искусственных генов, способных к прямой экспрессии, необходимо наличие регуляторних участков, обеспечивающих нормальный процесс транскрипции и трансляции; создание искусственных регуляторних участков возможно только с помощью методов химико-ферментативного синтеза ДНК. Кроме того, в тех случаях, когда выделение мРНК, соответствующей желаемому белку, затруднено или вовсе невозможно, химико-ферментативный путь оказывается также единственным способом получения искусственных структурных генов.
Развитие методов химико-ферментативного синтеза нуклеиновых кислот является одной из важнейших задач биоорганической химии и молекулярной биологии, поскольку такой способ синтеза ДНК позволяет искусственно получать генетический материал любой заданной структуры, вводить природные и синтетические полинуклеотиды в плазмидные или фаговые векторы, проводить их молекулярное клонирование и амплификацию, осуществлять направленный мутагенез ДНК, исследовать на молекулярном уровне процессы белково-нуклеиновых взаимодействий. Особый интерес представляет введение в геном бактериальной или дрожжевой клетки искусственных генов высших организмов,
кодирующих важные биологически активные олиго- и полипептиды, а также искусственных регуляторних участков, позволяющих не только исследовать тонкие механизмы процесса биосинтеза белка, но и регулировать его на уровне транскрипции и трансляции.
За последнее десятилетие в различных лабораториях мира химико-ферментативным путём синтезировано около двух десятков искусственных структурных генов, большинство из которых были клонированы и экспресоировались под контролем природных регуляторних участков в виде гибридных белков, и в настоящее время исследования в области синтеза различных генетических структур, необходимых для научных и практических целей, продолжают развиваться.
Целью настоящей работы явился ферментативный синтез из синтетических олигонуклеотидов двух вариантов структурного гена пептида сна, операторного участка лактозного оперона Е.соїі (сайта связывания белка-репрессора), последовательности Шайна-Дальгарно (сайта связывания рибосомы) и их клонирование в плазмидных векторах. В задачу также входило создание некоторых новых плазмид, необходимых для клонирования синтезированных генов.
Синтез структурного гена пептида сна в двух вариантах был обусловлен его клонированием в принципиально отличающихся векторах с использованием двух различных подходов. Первый вариант гена был синтезирован нами для клонирования в плаз-мидном векторе, содержащем фрагмент lac -оперона; в этом случае ген пептида сна оказывается присоединенным к дистальной части гена lacz и экспрессируется в составе гибридного белка g -галактозидаза-пептид сна. Второй вариант структурного гена пептида сна был создан для клонирования в векторе с
полностью синтетическими регуляторними участками: промотор -оператор - последовательность Шайна-Дальгарно. В результате такого клонирования образуется полностью синтетический искусственный ген, способный к прямой экспрессии в бактериальной клетке»
В нашу задачу входило показать на примере этих двух моделей, что синтетический структурный ген может экспрессиро-ваться не только под контролем природных регуляторних участков с образованием гибридного белка, но также под контролем полностью синтетических регуляторних участков, обеспечивающих биосинтез in vivo непосредственно целевого пептида.
Диссертационная работа была выполнена в период I979-I98I годов и является частью комплексных исследований, проводимых в лаборатории химии генов Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина АН СССР. Автор выражает глубокую благодарность академику М.Н.Колосову и старшему научному сотруднику лаборатории, кандидату химических наук В.Г.Коробко за научное руководство настоящей диссертацией, постоянное внимание и практическую помощь, а также кандидату химических наук В.Н.Добрынину и его сотрудникам за синтез олигонуклеотидов, использованных в этой работе.
. 7 -
Ферментативный синтез искусственных генов (литературный обзор)
За последнее десятилетие в различных лабораториях мира химико-ферментативным путём синтезировано около двух десятков искусственных структурных генов, большинство из которых были клонированы и экспресоировались под контролем природных регуляторних участков в виде гибридных белков, и в настоящее время исследования в области синтеза различных генетических структур, необходимых для научных и практических целей, продолжают развиваться.
Целью настоящей работы явился ферментативный синтез из синтетических олигонуклеотидов двух вариантов структурного гена пептида сна, операторного участка лактозного оперона Е.соїі (сайта связывания белка-репрессора), последовательности Шайна-Дальгарно (сайта связывания рибосомы) и их клонирование в плазмидных векторах. В задачу также входило создание некоторых новых плазмид, необходимых для клонирования синтезированных генов.
Синтез структурного гена пептида сна в двух вариантах был обусловлен его клонированием в принципиально отличающихся векторах с использованием двух различных подходов. Первый вариант гена был синтезирован нами для клонирования в плаз-мидном векторе, содержащем фрагмент lac -оперона; в этом случае ген пептида сна оказывается присоединенным к дистальной части гена lacz и экспрессируется в составе гибридного белка g -галактозидаза-пептид сна. Второй вариант структурного гена пептида сна был создан для клонирования в векторе с полностью синтетическими регуляторними участками: промотор -оператор - последовательность Шайна-Дальгарно. В результате такого клонирования образуется полностью синтетический искусственный ген, способный к прямой экспрессии в бактериальной клетке»
В нашу задачу входило показать на примере этих двух моделей, что синтетический структурный ген может экспрессиро-ваться не только под контролем природных регуляторних участков с образованием гибридного белка, но также под контролем полностью синтетических регуляторних участков, обеспечивающих биосинтез in vivo непосредственно целевого пептида.
Диссертационная работа была выполнена в период I979-I98I годов и является частью комплексных исследований, проводимых в лаборатории химии генов Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина АН СССР. Автор выражает глубокую благодарность академику М.Н.Колосову и старшему научному сотруднику лаборатории, кандидату химических наук В.Г.Коробко за научное руководство настоящей диссертацией, постоянное внимание и практическую помощь, а также кандидату химических наук В.Н.Добрынину и его сотрудникам за синтез олигонуклеотидов, использованных в этой работе.
Одной из важных задач современной молекулярной биологии является синтез искусственных генов биологически активных веществ. Наиболее простым и распространенным методом получения таких генов является обратная транскрипция мРНК из различных природных источников. Однако, если выделение мРНК, соответствующей желаемому белку, затруднено или вовсе невозможно, единственным способом получения искусственных генов становится сшивание химически синтезированных олигонуклеоти-дов с помощью ДНК-лигазы. Кроме того, сочетание этих двух подходов оказывается чрезвычайно эффективным в тех случаях, когда необходимо изменить или восполнить какую-либо часть протяженных генов, полученных обратной транскрипцией мРНЕС [ I].
Помимо использования синтетических олигонуклеотидов в качестве строительных блоков для получения различных генов существует ряд других областей их применения [2-4]. Синтетические олигонуклеотиды позволяют выделять мРНК с помощью афинной хроматографии [5], используются в качестве линкеров [6-8], адаптеров [9, ТО], праймеров [11-15], зондов [16-18], Использование линкеров, расщепляемых рестриктазами, обеспечивает возможность соединения фрагментов ДНЕ любого происхождения с ДНК-векторами. Наличие синтетических фрагментов ДНК открывает возможность систематического изучения зависимости между структурой и функцией регуляторннх участков ДНК. Развивается изучение белково-нуклеиновых взаимодействий синтетических фрагментов ДНК промоторного района [19-26], участков инициации и терминации трансляции [27-30], последовательностей, узнаваемых ферментами рестрикции [31-33], lac-оператора [34-39]. Использование синтетических фрагментов ДНК для изучения белково-нуклеиновых взаимодействий особенно важно потому, что направленное, планомерное изменение структуры изучаемой ДНК возможно лишь с использованием органохими-ческих методов.
Создание методов химического синтеза олигонуклеотидов и их ферментативного сшивания в фрагменты ДНК связано с именем Х.Г.Кораны, который начал исследования в этой области еще в середине 50-х годов [40], а к 1970 году осуществил первый полный синтез искусственного гена [41].
Суть олигонуклеотидного синтеза сводится к постепенному наращиванию цепи путем постадийного присоединения к ней моно-нуклеотидов (ступенчатый метод). При синтезе более чем 3-4-звенных олигонуклеотидов возникают трудности при разделении продуктов реакции, поэтому в качестве присоединяемого компонента используется ди- или тринуклеотид (блочный метод) . При химическом синтезе олигонуклеотидов каждый акт образования межнуклеотидной связи сводится к фосфорилированию фосфатным остатком одного мономера (нуклеотидннй компонент) гидроксиль-ной группы второго (нуклеозидный компонент):
В первом методе нуклеотидным компонентом является монозаме-щенный фосфат, а образующееся в результате реакции соединение представляет собой диэфир фосфорной кислоты; отсюда -название метода синтеза, В случае триэфирного метода в реакцию вводится нуклеотидный компонент, в котором фосфатный остаток находится в форме диэфира, а образующаяся межнуклео-тидная группировка является триэфиром фосфорной кислоты;
Наиболее распространенным способом проведения синтеза как в диэфирном, так и в триэфирном методе является синтез в растворе. Однако в последние годы интенсивно развивается также твердофазный фосфотриэфирный метод» когда все реакции проводятся в двухфазной системе. В качестве носителей используются инертные нераотворимые полимеры. Суть метода состоит в том, что нуклеотидный или нуклеозидный компонент закреплен ковалентно на нерастворимом специально модифицированном полимере, а все остальные компоненты находятся в растворе. После проведения конденсации на твердой фазе уже оказывается олиго-нуклеотид, который легко может быть отделен от остальных продуктов реакции; Использование твердофазного метода резко сокращает время синтеза и облегчает выделение целевых олиго-нуклеотидов. Простота операций при работе с полимерным носителем позволяет использовать любые избытки реагентов (и затем регенерировать их), а также повторять обработку иммобилизованных молекул. Очевидно, что кроме увеличения обшей скорости синтеза твердофазный метод является единственным подходом, где возможна стандартизация всех операций, что позволяет автоматизировать процесс.
Ферментативный синтез искусственного гена пептида сна (обсуждение результатов)
Поскольку ферментативный синтез ДНК при помощи обратной транскрипции является более доступным подходом, таким путем было получено большое количество различных генов. Так, разными группами исследователей были клонированы двухцепочечные кДНК, представляющие собой гены овальбумина [138], сомато-кринина [139] о1 , &- и У-глобинов человека [140 ], -глобина кролика [141], куриного про-« -коллагена [142], гены интерферонов [143-146] и гаптоглобина человека [147], ген крысиного ангиотензина [148].и предшественника свиного В-неоэндорфина [149]. Кроме того, с экспрессией клонированы гены овальбумина [150, 151], гормона роста [152, 153], иммуноглобулина Е [154] и интерферонов человека [I55-I6I].
Таким образом, высокий уровень развития химико-ферментативного синтеза фрагментов нуклеиновых кислот, а также применение обратной транскрипции очищенной мИЖ позволяют получать в настоящее время самые разнообразные по величине и первичной структуре двухцепочечные фрагменты ДНК. Наиболее перспективным в этой области оказывается сочетание химико-ферментативного синтеза ДНК с обратной транскрипцией мРНК; Соединение преимуществ этих двух подходов создает возможность получения фрагментов ДНК практически любой длины. Несмотря на имеющиеся существенные различия в механизмах экспрессии генов про- и эукариот, современные методы генетической инженерии позволяют получать рекомбинантнне молекулы, введение которых в бактериальную клетку может вызывать синтез разнообразных белковых продуктов, необходимых для научных и практических целей.
На протяжении ряда лет в лаборатории химии генов Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина АН СССР ведутся исследования по синтезу искусственных генов. Использование современных высокоэффективных методов химического и ферментативного синтеза позволило осуществить в этой лаборатории создание таких искусственных генетических структур, как участки инициации транскрипции (промоторы) и трансляции (сайт связывания рибосомы), операторный участок (сайт связывания белка-репрессора) и структурный ген пептидного гормона брадикишша. В настоящей главе обсуждаются результаты исследований по ферментативному синтезу и клонированию трех генетических структур: искусственного гена пептида дельта-сна (в двух вариантах), операторного участка лактозного оперона и участка связывания рибосомы: Для клонирования структурного гена пептида сна было создано несколько векторов на основе плазмиды PBR322, в которых кроме названных выше синтетических регуляторних участков использовался фрагмент природной ДНК, содержащий необходимые для экспрессии элементы. Все олигонуклеотиды, использованные нами для получения искусственных генов, были синтезированы В.Н.Добрыниным, И.В.Северцовой и Н.С.Быстровым. Синтез проводили фосфотри-эфирным методом в растворе, наращивая олигонуклеотидную цепь в направлении 3 — 5 преимущественно дияуклеотидными блоками.1 После удаления и-, Р- и О-защитных групп синтезированные олигонуклеотиды выделяли высокоэффективной жидкостной хроматографией и их чистоту и нуклеотидную последователь-ность доказывали введением 5 -концевой Р-метки с последующим частичным гидролизом фосфодиэстеразой змеиного яда ( VPDE ) и двухмерным разделением продуктов гидролиза сначала электрофорезом на ацетилцеллюлозе при рН 3,5, а затем гомо-хроматографией на DEAE -целлюлозе. Синтез структурного гена пептида дельта-сна явился продолжением исследований по созданию простейших искусственных генов Этот пептид, состоящий из девяти аминокислотных остатков ( Trp-Ala-Gly-Gly-Asp-Ala-Ser-Gly-Glu), является ОДНИМ из нейрогормонов мозга и в эксперименте на животных вызывает такие изменения электроэнцефалограммы (дельта-ритмы), которые характерны для состояния одной из фаз сна, в связи с чем он получил название пептида дельта-сна ( Delta sleep inducing Peptide, DSIP)[l62]. Девятизвенный пептид сна не содержит остатков метиони-на, что позволяет использовать для его биосинтеза тот же общий подход, основанный на освобождении нужного пептида путем бромцианового расщепления белка-предшественника, как это было впервые осуществлено К.Итакурой и сотр. [72] в случае со-матостатина. Центральная часть гена (нуклеотиды 9-35) кодирует аминокислотную последовательность пептида сна, перед нею находится инициирующий триплет AIG, а после нее - тандем терминирующих триплетов TGA и TAG. На концах гена имеются "половинные сайты" рестриктаз ECORI И ватні (рис. I), необходимые для соединения с вектором и последующей регенерации гена из рекомбинантной ДНК. Ген с EcoRi-BamHi "липкими" концами был синтезирован для клонирования в плазмиде с фрагментом іас -оперона и при правильной ориентации относительно гена lacz обеспечивал биосинтез пептида сна в составе гибридного белка -галактозидаза-пептид сна. Метиониновый остаток.
