Содержание к диссертации
Введение
1. Структура и свойства жгутиков бактерий и архей 12
1. Ультраструктура бактериального жгутика (БЖ) 12
1.1 Базал ьное тело БЖ 13
1.1.1. Дополнительные компоненты БЖ 22
1.2. Нить БЖ 23
1.3. Крюк БЖ 28
1.4. НАР-белки БЖ... г 31
1.5. Структура и экспорт аксиальных компонентов БЖ 32
1.6. Система генов жгутиковой подвижности бактерий 33
2. Особенности нитей бактериальных жгутиков (НБЖ) 35
2.1. Самосборка НБЖ 35
2.2. Полиморфизм НБЖ 44
2.3. Молекулярное строение НБЖ и их полиморфные переходы 50
2.4. Сборка НБЖ in vivo 55
3. Структурные белки мотора бактериального жгутика и его функционирование 58
4. Архебактериальные жгутики 71
4.1. Структура и свойства жгутиков архей 71
4.2. Первичная структура флагеллинов архей 76
4.3. Стабильность жгутиков архей 80
4.4. Предполагаемая модель сборки жгутиков архей 81
5. Заключение 84
- Ультраструктура бактериального жгутика (БЖ)
- Дополнительные компоненты БЖ
- Самосборка НБЖ
- Молекулярное строение НБЖ и их полиморфные переходы
Введение к работе
Формы проявления биологической подвижности чрезвычайно разнообразны, однако, в основе их лежит всего несколько молекулярных механизмов. Так, наиболее широко используемый молекулярный механизм подвижности всех эукариотических клеток основан на взаимодействии двух белков, сопровождаемом гидролизом нуклеозидтрифосфата, химическая энергия которого при этом трансформируется в механическую энергию движения. Это, прежде всего, актомиозиновая система в высших организмах, основанная на взаимодействии миозина и актина. Другая форма подвижности, характерная для эукариотических клеток, связана с микротрубочками и имеет определенное сходство с актомиозиновой системой. Наиболее ярко такая подвижность проявляется в жгутиках и ресничках простейших, где она основана на взаимодействии динеина с микротрубочками, состоящими из тубулина. Различного рода системы внутриклеточного транспорта основаны на взаимодействии белков-моторов, обладающих АТФазной активностью (миозин, кинезин и подобные им белки), и структурных белков (актин, тубулин, актиноподобные белки). Имеется большое количество дополнительных белков, участвующих в этих процессах, но молекулярный механизм функционирования данных двигательных систем одинаков.
Совершенно иной молекулярный механизм лежит в основе движения бактериальной клетки. Способность бактерий к быстрому и направленному перемещению в среде обусловлена наличием у этих организмов специального органа движения - бактериального жгутика (БЖ), структуру и функционирование которого кодирует около 50 генов. БЖ, пронизывая клеточную стенку, уходит под цитоплазматическую мембрану. Он имеет дискретную структуру, состоящую из базального тела, длинной наружной нити и соединяющего эти две части «крюка». Базальное тело, расположенное в толще клеточной стенки, вращаясь, приводит в движение наружную полужесткую спиральную белковую нить (нить бактериального жгутика, НБЖ), обеспечивающую генерацию гидродинамической силы, направленно толкающую клетку. Длительное время в составе БЖ искали АТФазу, но не обнаружили ее. Относительно недавно (конец 70-х годов) выяснилось, что базальное тело жгутика представляет собой миниатюрный электромотор, благодаря которому бактериальная клетка способна развивать очень большую скорость - 100 мкм/сек, то есть более 50 длин тела в сек. Энергетика этого процесса оказалась уникальной для систем подвижности - трансмембранный потенциал ионов водорода (или натрия) на мембране.
Аппарат мотора жгутика содержит около 25 различных белков, включая специфические белки, переключающие направление вращения мотора. Имеются сведения, что именно они участвуют в сборке жгутика и хемотаксисе. В последнее время получен ряд доказательств, что эти же белки образуют две основные части мотора - ротор и статор.
Особого внимания заслуживает белок наружной нити жгутика - флагеллин, который, несмотря на пассивную роль нити в функционировании жгутика, постоянно привлекает внимание исследователей. Свойства флагеллина в составе нити таковы, что позволяют белковой надспирали НБЖ принимать разные формы (жгутик имеет форму полужесткой спирали типа винта), тем самым обеспечивая возможность менять направление плавания клетки и искать лучшие условия обитания. Кроме того, НБЖ входят в круг тех биологических структур (чехлы бактериофагов, вирусы, некоторые ферментативные комплексы), которые обладают способностью к самосборке. В основе сборки более сложных многокомпонентных структур, таких как рибосомы и информосомы, лежат те же принципы. Поскольку флагеллиновая НБЖ является наиболее простой структурой, она может служить удобной моделью для изучения явления сборки биологических систем.
Жгутик как система подвижности прокариот длительное время изучался только на представителях эубактерий. Все вышеперечисленные свойства БЖ изучены, в основном, на Salmonella typhimuriwn и Esherichia coli. Однако, жгутики грамположительных бактерий, монотрихи и лофотрихи имеют свои особенности. И уж совсем немного известно о жгутиках архебактерий, которые, судя по всему, значительно отличаются от жгутиков эубактерий. Более того, к настоящему моменту сложилось мнение, что жгутики архей представляют особую форму подвижности прокариот, отличную от бактериальной. После того, как в 1978 г. была сформулирована «концепция архебактерий», именуемых в настоящее время археями, как нового царства в системе взглядов на природу, возник интерес и к подвижности этих прокариот.
Структурно и функционально БЖ отличается от актомиозиновой и динеин-тубулиновой систем подвижности. Естественно возникает вопрос, а имеются ли какие-либо общие свойства у белков двигательных систем прокариот с тем же самым более высокоразвитых организмов. Например, нить и крюк БЖ представляют собой, подобно Ф-актину, спиральные биополимеры, построенные из протомеров одного типа, и обладают способностью к самосборке в условиях in vitro. В литературе имеются сведения, указывающие на возможность взаимодействия белков различных двигательных систем.
БЖ представляет интерес не только как органелла движения, но и как звено в цепи передачи информации из внешней среды в клетку (различного рода таксисы), а также как один из поверхностных антигенов бактериальной клетки. Изучение строения этого биологического электромотора и его свойств представляет интерес в широком спектре практических проблем, в том числе и изучение его как биосенсорной системы, осуществляющей адаптацию организма в окружающей среде и участвующей в процессах получения и обработки информации организмом. Кроме того, имеются данные, что подавлением подвижности бактерий можно регулировать степень их патогенности.
Рассмотрению строения жгутиков бактерий и архей, а также современных представлений в отношении их функционирования как органелл подвижности данных микроорганизмов посвящен обзор имеющейся по этому вопросу литературы.
Ультраструктура бактериального жгутика (БЖ)
Присутствие длинных нитеобразных придатков у подвижной бактерии было замечено еще в конце прошлого столетия, однако, основные сведения о БЖ, его структуре и свойствах, получены только за последние 30-40 лет.
Морфологически жгутик построен из трех основных частей: БАЗАЛЬНОГО ТЕЛА, вращающегося в толще клеточной стенки и выполняющего роль миниатюрного электромотора, наружной полужесткой СПИРАЛЬНОЙ НИТИ, построенной из белка флагеллина и играющей роль винта при движении бактерий в среде, и так называемого «КРЮКА», гибкой белковой структуры, связывающей базальное тело и наружную нить (Silverman & Simon, 1977; Jones & Aizawa, 1991; De Pamphillis & Adler, 1971a; De Pamphilis & Adler, 19716; Каппучинелли, 1982; Поглазов и др., 1981). Однако, этим не исчерпывается структура двигательного аппарата бактерий. Имеется еще дополнительное количество белков и белковых образований в цитоплазме и цитоплазматической мембране, участвующих во вращении жгутика, но аккумулируют в своем составе все жгутиковые белки и белковые образования эти три основные части.
Базальная область БЖ - это наиболее сложная и функционально наиболее важная часть органеллы. За последние 10-12 лет произошел значительный прогресс в выяснении структуры базального тела жгутика. Обнаружен ряд функционально важных составных белковых компонентов, примыкающих к базальному телу со стороны цитоплазматической мембраны, встроенных в нее и участвующих во вращении базального тела. Более того, обнаружен целый белковый комплекс, примыкающий к проксимальному диску базального тела со стороны цитоплазмы, обеспечивающий сборку и вращение базального тела в клеточной стенке.
До недавнего времени базальным телом так называемого «интактного жгутика» бактерий (ИЖБ), структуры, выделяемой из бактериальной клетки стандартным набором биохимических методов, назывался набор ДИСКОВ или КОЛЕЦ на СТЕРЖНЕ: две пары дисков L-P и M-S у грамотрицательных бактерий, и одна пара дисков M-S у грамположительных бактерий. Впервые такую структуру интактного жгутика рода Bacillus и Esherichia coli предложили Диммит и Саймон (Dimmit & Simon, 1971) и Де Памфилис и Адлер (De Pamphilis & Adler, 1971). С этого момента под формулировкой «интактный жгутик» бактерий подразумевается структура, состоящая из нити, крюка и двух или одной пары дисков базального тела.
Изучая прикрепление базальных тел жгутиков E.coli к поверхности бактериальной клетки, Де Памфилис и Адлер обнаружили, что каждое из четырех колец - L-, Р-, S- и М- - находится в определенном слое клеточной стенки. L-кольцо находится в наружном липополисахаридном слое, Р- контактирует с пептидогликановым слоем, S- находится в периплазматическом пространстве над цитоплазматической мембраной, а М-кольцо является интегральной частью цитоплазматической мембраны (рис. 1а).
За прошедшие тридцать лет с момента опубликования Де Памфилисом и Адлером работы (De Pamphilis & Adler, 197I), ставшей классической, был получен большой объем информации о строении БЖ и составляющих его белков, и теперь схема строения базального тела включает множество его белков и соответствующих им генов (рие.іа).
S-кольцо расположено дистально по отношению к М-кольцу, и, что является совершенно удивительным фактом, представляет собой домен белка, образующего М-кольцо (Ueno Т. el al., I992; Ueno et al., I994). P- и L-кольца вместе образуют внешний цилиндр в клеточной стенке (DePamphilis & Adler, 1971) и формируют нечто вроде «втулки». Компоненты этих четырех колец идентифицированы генетически и биохимически (Suzuki et al., 1978; Aizawa et al., 1985; Homma et al., 1987). Для белковых субъединиц колец определены последовательность ДНК и соответственно аминокислотная последовательность (Jones et ah, 1987, 1989; Kiharaetal., 1989; Homma etal., 1990a,6). Анализ белковых компонентов М- и S-колец показал, что они состоят из одного белка FHF (мол. масса 61 кДа) (Ueno et al., 1992), как и отрезок стержня, на котором они располагаются. Дальнейшая работа показала, что, действительно, проксимальный конец жгутикового базального тела состоит не из отдельных S- и М-колец, а из структуры, названной MS-кольцевым комплексом (MSKK): два М- и S-кольца различной толщины расположены близко друг к другу на отрезке стерженя, выходящего из центра S-кольца (Ueno et al., 1994). В этой же работе предложена модель укладки полипептидной цепи FHF, в которой единственная аминокислотная последовательность дает три разные субструктуры (рис. 2). Следует подчеркнуть, что этот случай представляет собой экстраординарный пример, когда единственный белок ответственен за конструирование трех морфологически различных структур - двух дисков и части стержня.
По мере развития электронномикроскопической техники становилось ясно, что и у других бактерий в базальном теле их жгутиков присутствуют вышеописанные структурные элементы (Мельник и др., 1988; Новикова и др., 1984; Bakeeva et al., 1986), обнаруженные впервые у E.coli и В. subtilis (DePhamphilis & Adler, 1971). Правда, иногда размеры и количество дисков варьировали. Так, у Ectothiorhodospira mobilis Pelsh (Remsen et al., 1968) базальное тело состоит из трех дисков диаметром 20-25 нм.
Дополнительные компоненты БЖ
Существует несколько дополнительных компонентов базального тела, обнаруженных в НВВ жгутиков S. typhimurium, которые синтезируются под контролем главного жгутикового оперона (Jones & Macnab, 1990). Функция этих белков неясна: возможно, они являются частью механизма, контролирующего экспорт аксиальных белков жгутика. Эта версия подтверждается последними работами (Fan Fan & Macnab, 1996; Fan Fan et al., 1997; Minamino & Macnab, 1999).
Базальные тела нескольких видов бактерий с единственным полярно расположенным жгутиком содержат дополнительную структуру, состоящую из одного или пары больших дисков 80-170 нм в диаметре, чувствительных к протеазам и ассоциированных с внешней мембраной (Coulton & Murray, 1977, 1978; Curry et al., 1984; Ferris et al.,1984; Kupper et al., 1989; Engelhardt et al., 1993). Такие диски обнаружены и изолированы у жгутиков Wolinella succinogenes (Kupper et al., 1989; Engelhardt et al., 1993); похожие структуры обнаружены у Aquaspirillum serpens и обозначенны как CMRs диски (Coulton & Murrey, 1978), а также у Vibrio cholerae и Campylobacter fetus (Ferris et al., 1984). Следует особо подчеркнуть, что эти диски никогда не встречаются у бактерий с перитрихиальным жгутикованием, а встречаются только у монотрихов. Функция их неизвестна, но, возможно, они играют роль подпорки или заякоривающего устройства для единственного жгута.
Нить бактериального жгутика (НБЖ), которую грубо можно представить как закрученную винтом цилиндрическую структуру, составляет более 95% от общей массы жгутика и построена из субъединиц единственного белка - флагеллина (Asakura, 1970). У живой клетки эта структура достигает 20 мкм, а в растворе нить нормальной формы выглядит как спираль, имеющая шаг от 2,0 до 2,5 мкм и диаметр около 0,4 мкм. Параметры спирали варьируют в зависимости от вида и штамма микроорганизма (Kamiya & Asakura, 1976; Kondoh & Hotani, 1974). При высушивании жгутиков на пленке-подложке для электронной микроскопии они принимают форму правильной синусоиды. Согласно Лейфсону (Leifson, 1960), определяющими параметрами для жгутика являются длина и амплитуда его синусоиды. Отношение длины волны к ее амплитуде постоянно для каждого штамма. Нормальный жгутик имеет длину около 100 мкм и длину волны синусоиды на подложке (к) 2,5 мкм. Но существуют жгутики с аномальной, вдвое меньшей X, чем у нормальных жгутиков. Это так называемые «curly»-жгутики. Существуют и прямые жгутики. Поскольку форма надспирали БЖ является одним из условий его функционирования, этому будет посвящен отдельный раздел «Строение НБЖ и их полиморфные переходы». Большинство изученных в настоящее время НБЖ перитрихиальных бактерий имеет диаметр 18-20 нм, однако, существуют отклонения от этого значения, поскольку молекулярная масса молекул флагеллина колеблется в довольно широком интервале даже в пределах одного вида. В частности, известно, что молекулярная масса флагеллинов Е.соїі у разных штаммов находится в интервале 37-69 кДа (Lawn, 1977), и диаметр их жгутиков колеблется от 19 нм до 27 нм. Иногда в состав НБЖ некоторых видов бактерий входят два флагеллина как, например, у Caulobacter crescentus (Sheffery & Newton, 1977), Bdellovibrio bacteriovorus (Thomashov & Rittenberg, 1985) и Helicobacter pylori (Kostrzynska et al., 1991). Жгутик Campylobacter coli VC167 также является гетерополимером двух различных флагеллинов, и оба они требуются для нормального функционирования филамента (Guerry et al., 1991). Другие штаммы Campylibacter coli и Campylobacter jejuni имеют два флагеллиновых гена, хотя оба не обязательно экспрессированы (Guerry et al., 1991). В нитях Campylobacter, родственника Helicobacter pylori, два флагеллина образуют две различные области: 57 кДа-флагеллин образует минорную крюк-проксимальную область, а 56 кДа-флагеллин образует весь оставшийся филамент (Kostrzynska et al., 1991). Два флагеллина жгутиковой нити Rhizobium meliloti собираются в различных ее областях (Pleier & Schmitt, 1991). А полностью функциональная нить С crescentus собрана из четырех областей: 60 нм крюк-проксимальная зона собрана из флагеллина с мол. массой 29 кДа; затем зона - 27,5 кДа; переходная зона - из 27,5 и 25 кДа; четвертая зона (оставшаяся часть нити) из 25 кДа флагеллина (Driks etal., 1989;Minnichetal., 1988).
Почему жгутики некоторых немногочисленных видов эубактерий состоят из нескольких флагеллинов, неизвестно. Возможно, по мере изучения свойств и функционирования жгутиков архей, имеющих мультифлагеллиновый состав, кое-что прояснится и для жгутиков бактерий. Однако, на сегодняшний день можно сказать лишь то, что вариант мультифлагеллинового состава НБЖ является исключением из правила; обычно у эубактерий нить жгутика однокомпонентна и состоит из единственного флагеллина. Основополагающими в области изучения физико-химических свойств флагеллина в составе НБЖ являются работы Абрама и Коффлера (Abram & Koffler, 1964) и Асакуры с соавторами (Asakura et al., 1964). В них впервые убедительно показано, что диссоциированные на отдельные мономеры флагеллина НБЖ способны к самосборке в условиях in vitro. При этом образуются практически неотличимые от интактных нитей структуры с теми же свойствами. Самосборка НБЖ является особой областью изучения этих структур, поэтому ниже ей будет посвящен отдельный раздел.
Флагеллин - глобулярный белок с изоэлектрической точкой в области рН 4-5 и широким спектром молекулярных масс - от 25 до 70 кДа в зависимости от вида и штамма микроорганизма. Аминокислотный состав флагеллина имеет определенные характерные особенности, свойственные только этому белку, и молярное соотношение входящих в его состав аминокислот у разных бактерий меняется сравнительно мало. Аминокислотный анализ нескольких десятков флагеллинов различных бактерий показал полное отсутствие цистеина и триптофана; тирозин и фенилаланин присутствуют в очень незначительных количествах. То есть дисульфидных связей флагеллин не имеет и содержит очень мало ароматических аминокислот (De Lange et al., 1973; McDonough, 1965; Simon et al., 1977; Smith & Koffler, 1971). Так, в молекуле флагеллина Bacillus subtilis 168, состоящей из 304 остатков аминокислот, обнаружено 5 молекул фенилаланина и 1 молекула тирозина (DeLange et al., 1976). Все исследованные флагеллины содержат немного гистидина и пролина, свойством которых является прерывание а- и Р-цепи, причем, последний часто вообще отсутствует (McDonough, 1965; Smith & Koffler, 1971). Для флагеллина характерно высокое содержание дикарбоновых аминокислот и аланина. На их долю приходится до 50% от общего количества аминокислот. Интересно, что все наружние белки (кроме белков оболочки эндоспор) теряют цистеин, а пролин и триптофан содержат в очень небольших количествах (Wilson & Beveridge, 1993).
В 1973 году впервые определена полная аминокислотная последовательность флагеллина В. subtilis 168. При этом отмечена высокая степень гомологии N- и С-концов этого флагеллина с N- и С-концами В. subtilis W23 (De Lange et al., 1973). В дальнейшем появилась возможность определения первичной структуры флагеллинов по нуклеотидной последовательности их генов. Это было сделано для флагеллинов С. crescentus (Gill & Agabian, 1983); Е. coli (Kuwajima et al., 1986); четырех штаммов Salmonella (Joys, 1985; Wey & Joys, 1985). При сравнении первичной структуры этих флагеллинов отмечена высокая степень гомологии аминокислотных последовательностей N- и С-концов - 80% и 60% гомологии, соответственно; и всего 20% гомологии в центральной части. Предполагается, что по степени гомологии можно судить об эволюционном родстве разных штаммов бактерий. Эти исследования подтверждают ранее высказанное Иино предположение (lino, 1977), что концевые участки молекулы флагеллина отвечают за общие для всех флагеллинов полимеризационные свойства, а центральная часть молекулы отвечает за антигенные свойства, меняющиеся от штамма к штамму. К настоящему моменту установлены нуклеотидная и аминокислотная последовательности для 29 флагеллинов (Wilson & Beveridge, 1993), широко представляющих многие ветви эубактериального филогенетического древа, включая спирохеты, г(+) виды, пурпурную филогенетическую группу и т.д. Анализ всех последовательностей подтверждает наличие трехдоменной структуры молекул флагеллинов.
Самосборка НБЖ
НБЖ - один из наиболее удобных объектов изучения общих принципов самосборки биологических структур. Молекулы флагеллина, из которых состоят НБЖ, не образуют ковалентных связей, поэтому эту надмолекулярную структуру можно диссоциировать на мономеры понижением рН до 2,0 (Abram & Koffler, 1964; Asakura et al., 1964), спиртом (Martinez et al., 1967), нагреванием и обработкой ацетоном (Asakura et al., 1964) и др. Образующиеся различными способами мономеры представляют один и тот же белок, свойства которого не меняются в зависимости от способа его получения.
Асакура с соавторами (Asakura et al., 1964) заметили, что в отсутствие солей при обработке ацетоном происходит лишь частичная (80%) деполимеризация нитей. Если убрать ацетон и добавить в образовавшуюся смесь полимера и мономера 0,3 М КС1, резко возрастает вязкость раствора. Если же полимерную фракцию предварительно осадить, вязкость не возрастает. Таким способом была обнаружена возможность реконструкции НБЖ на затравках. В дальнейшем этот способ стал широко применяться для изучения свойств реконструированных жгутиков, а в качестве затравки использовались короткие фрагменты НБЖ, полученные ультразвуковой обработкой (Asakura et al., 1966; Asakura et al., 1968).
Важное обстоятельство обнаружено Асакурой с соавторами (Asakura et al., 1968), исследовавших направление полимеризации флагеллина на затравках. Было показано, что сборка жгутиков in vivo происходит на дистальном конце жгутика. На электронномикроскопических фотографиях фрагментов НБЖ отчетливо различаются формы концов нити. Один, обозначенный как Н-конец, выглядит выпуклым и закругленным, а другой, Т-конец, напоминает хвост рыбы, Эксперименты, в которых исследовалось направление полимеризации мономеров на фрагментах жгутиков Salmonella показали, что во всех случаях мономеры присоединяются только к «рыбьему» Т-концу, соответствующему дистальному концу НБЖ (Asakura et al., 1968). Для того, чтобы решить, идет ли полимеризация на обоих концах или только на каком-то одном, Асакура с соавторами поставили следующие эксперименты. Фрагменты жгутиков одного штамма Salmonella (1,2) добавляли к раствору мономеров флагеллина другого штамма (і), и наоборот. К образовавшемуся смешанному полимеру добавляли антисыворотку, выработанную на один из компонентов, и исследовали препараты в электронном микроскопе. Выяснилось, что во всех случаях антитела садятся на смешанный жгутик только с одного конца, а образовавшиеся сополимеры построены по типу і-1,2 (или 1,2-і), но ни разу не удалось получить комбинаций і-1,2-і или 1,2-і-1,2. Деполимеризация нити происходит также только с Т-конца, а Н-конец, соответствующий проксимальной части жгутика, остается неизменным (Hotani & Kagawa, 1974).
БЖ, также как и другие палочковидные структуры (ВТМ, хвостовой чехол бактериофага и др.), можно рассматривать как маленький кристалл, процесс образования НБЖ in vitro как процесс кристаллизации, а его реконструкцию в искусственных условиях как процесс перекристаллизации (Asakura et al., 1966; Asakura et al., 1968). Реконструкция (или полимеризация, или самосборка) флагеллина происходит при 2С и даже в замороженных образцах, следовательно не является ферментативной реакцией (Abram & Koffler, 1964). Было продемонстрировано, что средняя длина жгутиков, растущих на затравочных фрагментах, линейно увеличивается с возрастанием количественного соотношения мономер/затравочные фрагменты (Asakura et al., 1964). Согласно этой работе, процесс. полимеризации флагеллина - это полимеризационное равновесие в системе флагеллин-НБЖ, которое устанавливается в два этапа. На первом этапе достигается ситуация, когда содержание мономера находится в обратимом равновесии с существующим в растворе полимером (Oosawa & Asakura, 1975). На примере флагеллина Salmonella было показано, что при 40С скорость полимеризации равна скорости деполимеризации, а концентрация флагеллина в растворе стремится к постоянному значению, определяемому температурой. То есть обратимость равновесного состояния означает, что образованная структура полимера не постоянна, состояние каждой молекулы на конце жгутика не фиксировано, в результате чего часто происходят акты диссоциации и реассоциации нити жгутика. Равновесная концентрация флагеллина не зависит от количества жгутиков в растворе и составляет критическую концентрацию, при которой начинается образование жгутиков (Gerber et al., 1973). Перераспределение в количестве и размерах полимеров происходит лишь после того, как устанавливается равновесная концентрация мономера. Изменение в длине каждого полимера происходит как диффузный процесс, а время, необходимое для того, чтобы концентрация мономера приблизилась к равновесной, намного меньше времени, требуемого для завершения перераспределения длины полимеров. Полностью процесс достижения полимеризационного равновесия в системе флагеллин-НБЖ можно представить состоящим из четырех этапов.
Молекулярное строение НБЖ и их полиморфные переходы
В предыдущей главе обсуждалось свойство НБЖ принимать целый ряд полиморфных форм. Естественно возникает вопрос, что лежит в основе полиморфных трансформаций БЖ? Для ответа на этот вопрос предложена модель, основанная на постулате о существовании в составе НБЖ молекул флагеллина, находящихся в разных конформационных состояниях (Asakura, 1970; Calladine, 1975). Модель базируется на данных рентгеновской и оптической дифракций, и ее развитие шло параллельно с накоплением информации о свойствах и строении молекул флагеллина в составе жгутиков (Champnes, 1971; O Brien & Bennet, 1972; Yamashita et al., 1998).
Молекулы флагеллина организованы в псевдогексагональную решетку на поверхности нити. На один оборот спирали приходится 5,5 мономеров при основной 1-заходовой спирали. Термин «заходовый» («start») обозначает число идентичных «прядей» мономеров, которые могут вместе охватить все субъединицы в нити. На поверхности жгутика выделено четыре типа спиралей: 1-, 5-, 6- и 11-заходовые спирали. 5- и 6-заходовые, идущие в разных направлениях, образуют на поверхности НБЖ картину, названную «шевроном» (O Brien & Bennet, 1972). Вершина «шеврона» всегда направлена к проксимальному концу жгутика (O Brien & Bennett, 1972; Shirakihara & Wakabayashi, 1979).
В 1967 Knyr(Klug, 1967) предложил гипотезу, согласно которой образование суперспирали и изменение ее конфигурации при полиморфных переходах обусловлено внутренними свойствами самой нити жгутика, а точнее, уникальными свойствами молекул флагеллина в его составе. Согласно Клугу, НБЖ в живой клетке имеет спиральную форму; каждая ее субъединица рассматривается как часть спирального тяжа, свернутого в другую спираль, и имеет два типа связей, находящихся на разных радиусах. Расположение субъединиц соответствует минимальной свободной энергии («квазиэквивалентное» состояние). Чтобы поддержать субъединицы в таком состоянии при функционировании жгутика требуется совсем незначительная перестройка молекул флагеллина 0,1 нм. Это обязательно должно привести к деформации оси цилиндра и трансформации его в такую спираль, в которой энергия напряжения каждой связи окажется минимальной, причем эта форма будет способна принимать своё конечное состояние без какой-либо поставки энергии извне. Параметры спирали должны зависеть от мест локализации связей между субъединицами, а сами субъединицы оказываются в неравноценных, квазиэквивалентных состояниях, что отразится прежде всего на их конформации (Klug, 1964).
Суперсворачивание флагеллиновой нити, то есть полиморфизм, есть следствие сосуществования двух конформационных состояний 11 протофиламентов, образуемых флагеллином. По версии Асакуры с соавт. (Asakura, 1970; Kamija et al., 1979) субъединицы флагеллина в НБЖ находятся в двух различных конформациях, L- и R-. Продольные ряды субъединиц, представляющие собой 11-заходовую спираль, включают в себя молекулы флагеллина в какой-то одной конформации. Изменение конформационного состояния субъединиц внутри продольных рядов, которое вероятнее всего происходит на уровне третичной структуры, приводит к изменению соотношения продольных рядов, что отражается в изменении угла наклона 11-заходовой спирали (рис. 9).
В свою очередь, между наклоном продольных рядов и изгибом спирали жгутика имеется предсказанная Калладином тесная взаимосвязь, следствием которой является синусоидальный вид НБЖ (Calladine, 1978). Параметры полиморфных производных, выявленные ранее в экспериментах по сополимеризации и трансформации НБЖ (Asakura & lino, 1972; Kamija & Asakura, 1976; Kamija & Asakura, 1977), находятся в хорошем соответствии с этой теоретически обоснованной кривой, причем, согласно модели возможно существование двенадцати форм НБЖ (Kamija et al., 1980). Среди таких теоретически предсказанных форм НБЖ должны существовать два типа прямых жгутиков, полностью состоящих из молекул флагеллина какой-то одной конформации. Они названы L- и R-формами и имеют левое и правое закручивание протофиламентов (Kamija et al., 1979). Такие типы прямых жгутиков были обнаружены и изучены методами оптической и рентгеновской дифракции; кроме того, была проведена сополимеризация их флагеллинов (O Brien & Bennett, 1972). Изменение количественного соотношения флагеллинов двух типов прямых жгутиков привело к появлению целого ряда спиральных форм сополимеров, в том числе спиралей, имеющих нормальную и «курчавую» формы (Kamija et al., 1980). Эти результаты явились хорошим подтверждением предложенной модели, объясняющей полиморфные переходы в НБЖ. Ряд данных указывает на существование подвижного участка в молекуле флагеллина (Shirakihara & Wakabayashi, 1979). Такой участок, возможно, отвечает за конформационные изменения, подобные предложенным в работе Калладина (Calladine, 1978), и имеет непосредственное отношение к полиморфизму НБЖ.
Интересен факт существования мутанта, жгутики которого легко меняют свою форму (lino et al., 1974). Наличие такого мутанта можно объяснить тем, что мутация произошла как раз в подвижном участке молекулы флагеллина, при этом субъединицы НБЖ получили способность к частым переходам между двумя конформационными состояниями, а жгутик - легко изменять форму.
Поверхностная зона молекулы флагеллина не участвует в образовании связей между субъединицами, поэтому изменения, происходящие в этой зоне, не влияют на способ упаковки субъединиц, но влияют на антигенные свойства жгутиков. БЖ является хорошо известным Н-антигеном, иммунологические свойства которого определяются экспонированной на поверхность жгутика частью флагеллиновых молекул (lino, 1977; Kuwajima, 1988; Lawn, 1977). Генетический и химический Рис. 9. Поверхностные решетки R- и L-типов прямых жгутиков (Kamiya et al., 1982). анализ структуры молекулы флагеллина убедительно доказали существование в этом белке консервативных и вариабельных зон (Emerson & Simon, 1971; Fedorov et al., 1988; lino, 1977; Vondervist et al., 1989). Проведенные российскими, a следом за ними и японскими учеными работы (Fedorov et al., 1988; Kostyukova et al., 1988; Vondervist et al., 1989; Vondervist et al., 1990; Aizawa et al., 1999) показали, что флагеллины имеют ярко выраженную доменную организацию, одинаковую у всех штаммов и даже видов бактерий. Было показано, что молекула флагеллина состоит из трех достаточно независимых частей. Один из доменов образован центральной частью полипептидной цепи и формирует поверхность филамента. Этот поверхностный домен отвечает за антигенную специфичность НБЖ, ее диаметр, а также молекулярный вес образующих НБЖ субъединиц. За возможность молекул флагеллина встраиваться в состав упорядоченной полимерной структуры НБЖ отвечают N- и С-концы полипептидной цепи данного белка.
