Введение к работе
Актуальность темы: Гидродинамические методи, в первую очередь седашентационнне к реологические, являются классическими физическими методами исследования дисперсных систем и ж.астворов полимеров и иироко применяются в различных разделах биологии, в том числе для анализа ДНК-соде ржаїцих модельных систем генетического аппарата клеток эуариот (под этим здесь и далее будут подразумеваться растворы ДКК, препараты выделенного хроматина, клеточные "изаты и продукти г.ыгкого лизис і клеток - пуклеоиды). Знание гидродинамических характеристик позволяет в ряде случаев определять размеры и хонформашао макромолекул ДШ в составе ДНХ-содер"-с.эг;«х систем, взаимоотношения их с другими компонэнтаїлі генетсческого аппарата, а также их изменения при воздействии различных повр ""здачадих агентов, к числу которых относятся и ионмзируьцие излучения.
Наиболее пирокое распространение получило определение седи-ментадаонных характеристик, что связано с возможностью использования в этих целях препаративних ультрацентрифуг и напчием пелуом-пирическнх зависимостей между константой седиментации и- молекулярной массой линейной ДНК. Однако з случае си« :.*., содержащих внес кополнмерные молекулы ДКК (I0+I0J Дальтон), наблюдается суїдествзн-ная зависимость константы седиментации от скорости зрапения ротора, приводящая к аномальному седдакнгацконному поведению и возможности арте^актных результатов в определении тлекулярннх масс (Ormerod M.G. , Lehnann А.Я., 1971 і r.'.oBurney M.V/. etal., 1971 ). В связи с эти:.:, при седиментанионном анализе висскопсопшерной одно-тяжевой ДНК в щелочных сахарозных градиентах, в частности, при количественном определении радиациошо-и.чдупированннх разрывов, возникают определенные трудности из-за гидролиза фосфедиэфирных связей и деградации ДНК, происходящей с малой скоростью в области щелочных рН (Hill W.E., Fagman. W.L., 1973 ). поскольку yi/Bh-JSir/e скорости седиментации сопровождается квадратичным увеличением продолжительности центри фугирования. Несмотря па то, что эта проблема давно известна, она не получила своего должного решения, которое мо""но сЬор.'.гулировагь кг : опенку допустимой скорости вращения ротора при требовании гяшимизучозать время центрифугирования в условиях конкретного радиобиологического эксперта." нта.
Наряду с изучением поведения линейных молекул г середины 60-х
годов исследовались гидродинамические характериїліки качественно отличных по топологическг ту состоянию молекул ДКК - кольцевых ко-ва/шішю-зсмкиутих 'юрм (vinograd J. et al., 1965; «апл J.С et ..1., 1967 ), -'то привело к ; :-зііккноьєнкю представлепія о наличии торсионного палрядьипя в натічна кольцевых молекула., ДпХ, приЕо-дядего " их сверхсшцівлизаши. Пргмз некие развитых на втих системах экспериментальных ііодходов позволило установить, что ДДК кле-yok ^укариот также находится в топологическом состоянии, инвариантном к структурним пре<. іразовалиям, происходящим без разрывов полкнуклеотиднпх ченеіі к определяется б клетках компої міташ ядерного матрпкса, формі_угадали суперсгшрализованяые петлеобразные домены из ДНК геногла (Coolc P.R., Brazell I.А., 1975; 1976 ).
Таїсіє представления об организации ДііК клеток эукариот іг./.г"-ли к возникновению !;оеых аспектов в проблеме клеточного ответа на радиационное воздействие (ґябченко Н.'Л., іівапипк Б.П., І2Й6; Crr up "t.А.-, 1987 ) и . вопросах, касающихся анализа рад.іашоншг/. повреждений на ypoF-e молекули ДКК. Лктерпрртаїгея изменении ггт.х)-динадаїческого поведения ІуіК-содег".аа:іх спсте;. (клеточных лизат^в, нуклео7*дов) при воздействии ионизирующих излучени;! к;-к на от и системы, так и на клетки, долада учитывать возможность наличия качественно разли -них по своему отклику на радпаїтпоппке поврежден;:.? молекулярних шившії - сулерсплратлзованкнх петлеобразных домєіов и линеіішіх молекул.
Основная трудность анализа состоит в многоколюнентности таких систем как нуклеокдіі и сложном характере их организации, неизвестно, в частности, какова зависимость глежду гидродинамический; характеристиками ічуклеоїща и чи ел л релаксировашнк доме нор и как влияет релаксация каадого последующего домена (із вязкость пли скорость седиментации. В связи с этим представляет интерес поиск >.:о-дельшос систем, отражающих особенности структурного состояния ДНК в клеточном ядре, но более простых по комтонентному составу и ор-гінизаігии, что может облегчить количественна интерпретацию ответ на радиационное воздействие яа уровне сулереппратьннх петлеобразных доменов ДНК.
Упомянутые зше подходы к исследованию ДІ-ГК-содержадих систем основываются на равковееннх, то есть не пяня?х;ііхся в течение вре-г.й.чи измерения, іидредняашческпх характеристиках. Другий подходе к изучении модельных ДІіК-сод9рла;-:их cv.cz'^k генетического аппарат*:
клеток является исследование черазновесного поведения- талей ГИДрО- динамическоґ: характеристики к;л< вязносгь. это я" тіеч;:е слойстех'іію широкому классу объектов: б :сокомалекуля?но:: ір-ігопо.'і ДНК ( "дззд D.J., 1973 ), не .'.тральним (Лысцов Б.Н. к согпт., IPS8) и цчло'ил-м (Uhlenhopp e.l., 1975 ) лнзатам бакте: тгчьни.. клеток, дисперсиям дгзокс/рлбонуклеоігоотеида ез эуляриотичееннх кл?ток (Яллонов 2.Д., 1272; Крючков В.П., 1982). Сь^спенхг таксо поведения у разных авторов различны "'--ч/на этого может состоять либо в ігр/нциплаль-ком отличии указат шх ДКК-содоржадпх систем, либо ., недостаточной пзучености пространственной организации этих систем в сильных сдвиговых долях. Неравновесные свойства наиболее »сно свя:,<анк с функциональной динамичностью структурной организации ДІіК в геногле и чувствительность этих свойств к различным воздействиям сравнима с чувствительностью живой клетки (Кркг :ов В.П., 1982). Поэтому изучение механизмов, лежащих в основе неравновесного поведения к его изменения при радиационном воздействии,представляє" песо; энный интерес.
Цепь у задачи, исследования. Целью данной работ'ч являлось кау-чение особенностей ггдредана'.мческого погедеіг.ія высокополимерпой однотяжевой линейно!'; ДНК в сильнчх иентробежпкх полях к кольцеобразной супгереігирг і,., оь лноіі ДКК в сдвиговых полях в составе ДНК-содержа^их модельных систем генетического аппарата эукириот и .х учет при радиобиологическом анализе.
3 ходе работы решались' след;да;;ие задачи: I. Получить соотношение мелзду среднечисленней молекулярной массой полкдисперсной од~ нотяжевой ДІІК и допустимой скоростью центрифугирования, не искака-гаэдй существенно профиль седиментации, и ггров^оти аЧ'.лиз зытэкак-';:ос из него следствий. 2. С учетом полученных результатов провести количественный анализ индуглии и репарации однотяжевнх разрывов дКК в облученных плетках костного мозга кчыс. 3. Изулть на препаратах выделенного хроматина тимуса теленка их возможности кек модельной система, отражагде ': гообеыюсти петс-ьго-доменлои ергани-заппи ядерной дїіК, и ее использование для иелеіі радиобиологнчесгах исследовании. 4. Г^оалалкзировать неравновесные свойства дисперсий выделенного хроматина и их изменения при радиационном воздействии с, учетом суиерспирализованкого петлеобтазного состояния его фибрилл .
Научная новизна. В данной работе впервые проанализирована на основании теории аномально': седиментации Цимма оавпеимость такого
параметра как средне численный молекулярный вес полкдисперсного образца одаотдаю вой ДНК от скорости центрифугирования. Впервые показано сохранение в выделенном хроматине организации ДКК в виде су-перстфаглзова.лых кольцеобразных доменов и определяющая роль та-. кой органи заик7' в явлении структурной гетерогенности препаратов хроматина к их способности к неравновесному течению в сде говых по„.лх. Проанализированы дозовые зависимости вязкости препаратов хроматина с привлечением представления о ядерном матриксе как ра-. .нечувствительной структуре.
Г фактическая ценность работы. Предложенный алгоритм, позволяющий связать срелнечисленную молекулярную массу одкотяжевой ДНК со скоростью вращения ротора может быть использован для оценки допустимой скорое; : центрифугирования в условиях конкретного седимзнта-циогюге ачализа. Развитый и апробированный на клетках костного мозга крнс метод, селим- чташонного анализа выхода повреждений ДКК при радиационном воздействии, исключающий использование предварительного радиоактивного меченая ДНгС, может с успехом применяться в радиобиологических исследованиях на неделяцихся или .медленно про-лиферкруїодіх клетках. Показанное наличие в препаратах хроматина ко зцес"> разной суперсітарализованноіі ДКК дает возможность использовать уту классическую модельную систему в новом качестве - для изучения структурио-функішональноіі организации хроматина на уровне чополоплк ДНК в широком спектра молекулярлобиологичеекпх и радиобиологических исследований. Предложенный оригинальный способ фр щионирования препаратов хроматина в сдвиговнх полях может быть использован для получения новых результатов в различных исследованиях, касающиеся структуры и функций хроматина.
Апробация работы. Результаты ргботы были доложены и обсуждены на IX Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Черноголовка, IS87), 32-ii Каучкой конференции Ilffil (Москва, 1987\ УІ Всесоюзном совещании по шкродозпм-зтрки (Канев, 1262). I Всесоюзном радиобиологическом съезде (!.!ос;<ва, IS8S).
Публикации. По теме диссертации опубликовано & печатных работ и получено авторское свидетельство на изобретение.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов нсследова-' ния, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Диссертация излолазна на 151
