Содержание к диссертации
Введение
I Введение 8
II Обзор литературы 12
III Материалы и методы 61
1. Выделение антигенов 62
1.1. Выделение липопротеидов 62
1.1.1. Выделение ЛНП из плазмы крови человека.
1.1.1.1. Ультрацентрифугирование в ступенчатом градиенте плотности нейтральной соли бромида натрия .
1.1.1.2. Зональное ультрацентрифугирование.
1.1.1.3. Аффинная хроматография.
1.1.2. Выделение Лп(а).
1.1.2.1. Трехступенчатое ультрацентифугирование в ступенчатом градиенте плотности с последующей гель-фильтрацией .
1.1.2.2. Аффинная хроматография.
1.1.3. Получение ЛВП и делипидированной плазмы.
1.2. Очистка препарата IgG человека 66
2. Получение антител 67
2.1. Получение поликлональных антител 67
2.1.1. Иммунизация животных.
2.1.2. Выделение ПкАт к ЛНП.
2.1.3. Выделение ПкАт к Лп(а).
2.1.3.1. Получение моноспецифической антисыворотки.
2.1.3.2. Очистка антител.
2.1.4. Препаративная очистка ПкАт.
2.2. Получение моноклональных антител (МкАт) 69
2.2.1. Гибридизация и скрининг гибридомных клеток.
2.2.2. Выделение моноклональных антител из асцитной жидкости.
2.2.3. Выделение МкАтиз культуральной жидкости.
2.2.4. Препаративная очистка МкАт.
3. Синтез аффинных сорбентов 71
3.1. Активация матриц 71
3.1.1. Активация бромцианом.
3.1.2. Периодатное окисление.
3.2. Иммобилизация белков 72
3.2.1. Иммобилизация липопротеидов
3.2.2. Иммобилизация антител.
3.3. Синтез сорбентов для процедур терапевтического афереза. 73
4. Определение сорбционной емкости иммуносорбентов 73
4.1. Метод колоночной хроматографии 73
4.2. «Batch» метод 74
5. Анализ чистоты и специфичности белков 74
5.1. Электрофоретические методы 74
5.1.1. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.
5.1.2. Электрофорез в геле агарозы.
5.2. Иммунологические методы 76
5.2.1. Метод двойной радиальной иммунодиффузии.
5.2.2. Иммуноэлектрофорез.
5.2.3. Иммуноблотинг.
5.3. Аналитическое ультрацентрифугирование 77
6. Методы определения концентрации белков липидов 77
6.1. Иммуноферментные методы 77
6.1.1. Синтез конъюгатов антител с пероксидазой.
6.1.2. Определение концентрации антител к ЛНП.
6.1.3. Определение концентрации антител к Лп(а).
6.1.4. Определение концентрации антител к IgG.
6.1.5. Определение концентрации Лп(а) в плазме (сыворотке) крови человека.
6.1.6. Определение титра антител к иммуноглобулинам барана или мыши в плазме крови человека.
6.2. Определение концентрации Лп(а) методом радиальной иммунодиффузии по Манчини 80
6.3. Определение концентрации апоВ в плазме крови 81
6.4. Определение концентрации иммуноглобулинов G в плазме крови человека 81
6.5. Определение концентрации суммарного белка 81
6.6. Определение концентрации холестерина 82
6.7. Определение концентрации холестерина в клетках 82
7. ЛНП аферез in vitro на клеточной модели 82
7.1. Получение образцов органных и клеточных культуры аорты человека 82
7.2. Культивирование короткоживущей органной и клеточной культур из аорты человека 83
7.3. ЛНП аферез in vitro на клеточной модели 83
8. Микроскопическое исследование матриц 83
9. Контроль качества при производстве колонок для клинического применения 83
9.1. Определение стерильности 83
9.2. Испытание на пирогенность 84
9.2.1. Испытание на пирогенность на кроликах.
9.2.2. Испытание на пирогенность с использованием ЛАЛ теста.
9.3. Контроль частиц сефарозы в смывах с колонок 86
9.4. Определение свободного белка в смывах с сорбента 87
10. Проведение процедуры афереза с использованием иммуносорбционных колонок 88
Иммуносорбенты для ЛНП афереза 90
Выделение и характеристика антигена - ЛНП плазмы крови человека 91
VI Выводы 242
VII Список литературы 246
VIII Приложения 280
- Ультрацентрифугирование в ступенчатом градиенте плотности нейтральной соли бромида натрия
- Трехступенчатое ультрацентифугирование в ступенчатом градиенте плотности с последующей гель-фильтрацией
- Метод колоночной хроматографии
- Проведение процедуры афереза с использованием иммуносорбционных колонок
Введение к работе
История вопроса и актуальность проблемы. Появление и накопление в крови человека различных патогенных веществ приводит к возникновению и развитию многих заболеваний. Такими веществами могут быть: аутоантитела, циркулирующие иммунные комплексы, атерогенные липопротеиды, эндогенные и экзогенные токсины, прионы, вирусы, и микроорганизмы. Их полное удаление или снижение концентрации, как правило, дает положительный клинический эффект. В частности, одной из задач терапии атеросклероза, связанного с нарушением липидного обмена, является снижение концентрации атерогенных апоВюо-содержащих липопротеидов в крови пациента. Основное направление терапии при аутоиммунных заболеваниях - удаление патогенных аутоантител или антигенов.
Традиционным подходом к лечению в ситуациях, когда необходимо снизить концентрацию тех или иных веществ, является лекарственная терапия. Однако, в ряде случаев, она имеет ограничения в применении. Кроме того, для некоторых патологий, лекарства, эффективно снижающие концентрацию патогенных веществ в крови, отсутствуют. Поэтому поиск и разработка новых эффективных способов снижения концентрации и выведения их из крови больных с использованием современных методов биохимии, иммунологии, молекулярной биологии и биотехнологии до сих пор остается актуальной задачей.
Существует много методов экстракорпорального очищения крови. Согласно классификации, предложенной в 1990 году Borberg, указанные методы можно разделить по степени специфичности удаления патогенного компонента. Значительная часть методов относится к сорбционным технологиям, то есть базируется на использовании различных сорбентов.
Наиболее простым методом является плазмаферез, при котором часть циркулирующей плазмы больного удаляется и замещается раствором альбумина, донорской плазмой или кристаллоидными растворами.
Плазмаферез широко и успешно используется и в настоящее время, особенно при острых ситуациях. Вместе с тем, специфичностью этот метод не обладает. На рисунке 1 представлена иерархия специфичности различных экстракорпоральных методов. Следующие в пирамиде специфичности методы, основанные на принципах фильтрации, осаждения или ионообменной хроматографии, используются достаточно широко, но тоже имеют высокий процент неспецифического удаления различных компонентов крови. Максимальную специфичность можно достичь при использовании аффинных сорбентов, особенно при использовании высокоспецифичных белок-белковых взаимодействий типа: фермент-субстрат, лиганд-рецептор, пептид-лиганд, антиген-антитело. В основе работы аффинных сорбентов используется принцип хроматографии по сродству. Работа в области создания высокоспецифичных аффинных сорбентов привела к созданию иммуносорбентов (ИС) для клинического применения, которые занимают место на вершине иерархии специфичности (рис.1).
В русскоязычной литературе существует много терминов, которые определяют область медицины, в которой используются различные технологии очищения крови. Это «гемосорбция» и «гравитационная
-9 хирургия крови» [Лопухин, 1978-1985], «эфферентная терапия» [Костюченко, Гуревич, Соколов 2003], «гемокоррекция» или «экстракорпоральная гемокоррекция» (те же авторы), «экстракорпоральные методы лечения» [Коновалов, 2001]. В настоящей работе мы будем пользоваться термином «терапевтический аферез», потому что за годы становления этой области термин «Therapeutic apheresis» стал общепризнанным в международной литературе.
Методы терапевтического афереза находят широкое применение в современной медицине. Накоплено немало примеров успешного применения сорбционных технологий для лечения сердечно-сосудистых и аутоиммунных заболеваний, печеночной недостаточности, в акушерстве и гинекологии, при трансплантации органов, в дерматологии, онкологии, ревматологии, при острой интоксикации и инфекции организма
В результате становления и развития этого направления медицины, стало очевидным, что разработка высокоспецифичных сорбентов для клинического применения, которые могут быть успешно, безопасно и эффективно использованы для очистки крови имеет большое научно практическое значение. Наша работа посвящена созданию аффинных сорбентов для лечения больных с рефрактерными к иным видам терапии формами нарушений липидного обмена и дилатационной кардиомиопатией [ Покровский, 2004].
Пионерами в области сорбционных технологий очистки крови в России были Юрий Михайлович Лопухин и созданный им коллектив II МОЛГМИ им. Пирогова [ Лопухин, 1978; Лопухин и Молоденков, 1985]. В последнем абзаце книги «Холестериноз», вышедшей в 1983 году Юрий Михайлович Лопухин и соавторы писали: «Создание такого рода сорбентов (специфичных к ЛНП - примечание автора) позволит одномоментно удалять из крови почти полностью липопротеиды низкой плотности и таким образом способствовать выходу холестерина из клеток и тканевых депо. Эффективность подобного рода методов подтверждают и данные по использованию иммуносорбентов на апопротеиды липопротеидов низкой плотности в некоторых зарубежных клиниках. Вероятно, в ближайшем будущем именно на этом пути терапии атеросклероза клиницистов ждут наибольшие успехи» [Лопухин и др., 1983]. Фактически в то же время, в 1982 году, в КНЦ РАМН и была начата наша работа.
Цель и задачи работы. Цель настоящей работы - создать новое поколение высокоспецифичных аффинных сорбентов для экстракорпорального удаления из крови человека патогенных веществ и исследовать особенности их применения при лечении больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями, резистентными к лекарственной терапии.
Экспериментальные задачи:
1. Синтезировать, характеризовать и апробировать в клинике сорбент с моноспецифическими поликлональными (ПкАт) барана против липопротеидов низкой плотности (ЛНП) человека. Исследовать эффективность и безопасность использования такого сорбента в процедурах экстракорпорального удаления ЛНП (ЛНП аферез).
2. Получить и характеризовать панель моноклональных антител (МкАт) против ЛНП человека. Показать принципиальную возможность использования МкАт для синтеза иммуносорбентов с целью их применения в терапевтическом аферезе.
3. Создать in vitro модель ЛНП афереза и с помощью такой модели исследовать его эффективность на органной и клеточной культурах аорты человека.
4. Сравнить различные типы сорбентов для ЛНП афереза. Изучить особенности их взаимодействия с плазмой крови человека.
5. Исследовать связь липопротеида(а) [Лп(а)] с наличием и тяжестью атеросклеротических поражений артерий различных локализаций.
6. Синтезировать, характеризовать и провести клинические испытания иммуносорбента для специфического удаления из плазмы крови человека Лп(а). Изучить возможность и эффективность использования такого сорбента для лечения больных ИБС с повышенным содержанием Лп(а).
7. Изучить возможность и особенности синтеза аффинных сорбентов с иммобилизованными антигенами на примере сорбента с ЛНП человека.
8. Синтезировать, характеризовать и показать принципиальную возможность использования иммуносорбента для удаления патогенных аутоантител из крови больных дилатационной кардиомиопатией в процедурах эктракорпорального удаления иммуноглобулинов человека (Ig аферез).
9. Разработать технологию создания колонок с аффинными сорбентами для процедур терапевтического афереза.
Ультрацентрифугирование в ступенчатом градиенте плотности нейтральной соли бромида натрия
В том же, 1981 году, Stoffel W. с соавторами опубликовали первые результаты использования анти-ЛНП иммуносорбента для лечения трех пациентов - одного с гомозиготной и двух с гетерозиготной формами СГХС. Для каждого пациента, по аналогичной схеме с использованием ЛНП человека в качестве антигена, были изготовлены две персональные колонки. Кровь пациента поступала в плазмасепаратор ценрифужного типа, который в непрерывном режиме разделял клетки и плазму. Плазма крови поступала в колонку, где происходила сорбция ЛНП. Насыщение колонки определяли визуально, по изменению цвета сорбента. Интересно отметить, что авторы использовали простой и эффективный способ для улучшения визуализации сорбции апо В содержащих липопротеидов на колонку: они рекомендовали больным накануне выпить морковный сок, что приводило к контрастированию желтым цветом частиц липопротеидов. После насыщения ток плазмы переключался на другую колонку. Колонки использовались поочередно и подвергались регенерации в процессе процедуры. После насыщения остатки плазмы вытеснялись из колонки физиологическим раствором. Затем через колонку пропускали глициновый буфер с рН 2,8 - 3,0, который диссоциировал комплекс антиген-антитело и регенерировал колонку. Таким образом, было проведено по 3-4 хроматографии на двух колонках каждому пациенту. Объем обработанной плазмы составил, в среднем? 7 л, продолжительность процедуры - 3-4 часа. Колонки использовались многократно. Уровень ОХС у трех пациентов был снижен за одну процедуру:
Работы Stoffel W., и Borberg H., показали, что комбинирование сорбционной колонки с плазмасепаратором, позволяющем вести процедуру в непрерывном режиме, дает возможность обрабатывать большой объем плазмы, удаляя из нее только заданный компонент, эффективно снижая его концентрацию в крови.
В своей статье, посвященной результатам первого применения ЛНП-афереза на трех больных СГХС, Stoffel W., Borberg Н. и Greve V. написали: « The evidence for these sings of reversal of the atherosclerotic progress in patients with long-standing hypercholesterolaemia has not yet been convincing with any mode of management. Our technique offers an attractive and feasible test of the lipid hypothesis.» [Stoffel et.al., 1981]. РІменно эта статья и эти слова послужили толчком для начала нашей работы в Москве. В 1982 году в НИИ экспериментальной кардиологии ВКНЦ АМН СССР по инициативе профессора В.Н. Смирнова была создана новая научная группа «Аффинные сорбенты для медицины».
В том же году первые попытки использования иммуносорбентов для ЛНП афереза в клинике были предприняты в США, в Рогозинском институте, Нью-Йорк. В 1982 году, там была проведена первая процедура ЛНП-афереза. [Saal et al., 1986]. ЛНП аферез проводился с использованием иммуносорбционных колонок, выпущенных австрийской компанией «Immuno». Это был первый опыт промышленного производства колонок для ЛНП афереза. Впоследствии, работы по выпуску таких колонок в Германии проводились компанией «Baxter» GmbH, позднее «TheraSorb» GmbH, далее «PlasmaSelect» GmbH и сегодня «Miltenyi Biotec» GmbH.
В 1982 году в Кардиологическом Научном центре, Москва, Россия, нами были начаты работы по созданию иммуносорбентов для процедур ЛНП афереза. Уже в декабре 1983 года были проведены первые процедурыс использованием разработанных нами сорбентов и получены первые клинические результаты [Покровский и др., 1985].
Начиная с 80-х, применение ЛНП афереза активно расширялось в Германии [Borberg et al, 1983, 1988, 1990]. Так в 1983 году, в клинике Кельнского Университета, на лечении находилось 8 пациентов, а в 1986 уже 30. В 1989 в Германии были проведены многоцентровые клинические испытания метода, в которых участвовали клиники Бонна, Кельна и Мюнхена [Borberg et al., 1990, A. du Moulin, 1990]. В СССР в 1985 году ЛНП аферез с использованием наших иммуносорбционных колонок проводили 4 пациентам [Покровский и др., 1985], а к 1990 году на программном лечении находилось уже 24 пациента [Pokrovsky et al., 1995].
Использование метода в различных клиниках мира, рост числа пациентов, получающих лечение методом иммуносорбции, увеличение продолжительности лечения, позволили получить достаточное количество информации для того, чтобы объективно оценить результаты использования метода. Было показано, что при лечении гомозиготных больных регрессия ксантом может наблюдаться уже после 6-12 месяцев проведения ЛНП афереза, прекращаются приступы стенокардии, существенно улучшается самочувствие и качество жизни. Уровень ОХС в результате проведения процедуры удается снизить до 100-150 мг/дл, что позволяет поддерживать средний уровень ОХС в течение курса лечения 200-250 мг/дл даже у гомозиготных больных без применения медикаментов [Borberg et al., 1988, 1990]. Тогда же впервые было показано, что в результате такой стратегии лечения удается не только предотвратить дальнейшее образование атеросклеротических поражений сосудов, но и достичь их регрессии [Borberg et al., 1990, Pokrovsky et al., 1993].
В 1984 году в Японии был создан новый сорбент для ЛНП афереза. Этот сорбент представлял собой декстрансульфат, иммобилизованный на шариках целлюлозы. Как и в случае гепарин-сорбента, в основе связывания этим сорбентом ЛНП лежит принцип ионнообменного взаимодействия и сродство апоВ-содержащих липопротеидов к полианионитам. На животной модели, в качестве которой использовали кроликов Ватанабе, было показано, что при пропускании плазмы крови через колонку с сорбентом, ЛНП эффективно связываются с сорбентом, [Yokoyama et al., 1984]. Следует заметить, что более позднее изучение in vitro свойств сорбентов на основе полианионитов, таких как декстрансульфат целлюлоза (ДС) и гепарин-сорбент, показало, что их специфичность зависит от концентрации ЛНП в плазме [Pokrovsky et al., 1990]. Очевидно, что в плазме гомозиготных больных, где уровень ОХС может достигать 1000 мг/дл, ЛНП являются мажорным компонентом, несущим положительный заряд. Поэтому отрицательно заряженный сорбент будет достаточно селективно связывать ЛНП согласно принципу ионообменной хроматографии. По мере снижения концентрации ЛНП в плазме, селективность такого сорбента снижается, и при уровне ОХС 250 мг/дл, апоВ составляет не более 30% удаляемого белка , в то время как 70% приходится на другие белки плазмы [Pokrovsky et al., 1993]. Это свойство сорбентов на основе полианитов существенно ограничивает их применение, так как современный опыт ЛНП афереза доказывает, что для достижения регрессии атеросклероза необходимо, чтобы уровень ОХС в плазме больного после процедуры составлял 100 мг/дл, а целевой уровень ХС ЛНП в 2004 году снижен до 70 мг/дл.
Трехступенчатое ультрацентифугирование в ступенчатом градиенте плотности с последующей гель-фильтрацией
Липопротеид(а) [Лп(а)] был обнаружен норвежским ученым К. Berg в 1963 г. с помощью иммунологических методов как новый антиген плазмы крови [Berg, 1963]. На протяжении двух десятилетий ему не уделялось существенного внимания, однако в 1980-е годы было опубликовано несколько работ, установивших связь между концентрацией Лп(а) в крови и повышенным риском развития инфаркта миокарда [Kostner et al.., 1981; Utermann, 1989]. Лп(а) представляет собой сферическую частицу диаметром около 260 А, состоящую из ЛНП-подобной частицы и одной молекулы апобелка(а), которая связана с апоВюо ковалентной дисульфидной связью [Utermann, 1989]. Уникальность белка апо(а) состоит в том, что он не обнаруживается более ни в одном из классов липопротеидов и имеет высокую степень гомологии (до 90%) с молекулой плазминогена [MacLean et al.., 1987]. Ген, ответственный за синтез белка апо(а), локализован в длинном колене шестой хромосомы рядом с геном плазминогена [Frank et al.., 1988]. Уровень Лп(а) выше 30 мг/дл встречается у 25-40% больных ИБС и признается пороговым, так как по данным ряда авторов, у пациентов с такой концентрацией Лп(а) в крови возрастает риск развития сердечно-сосудистых заболеваний [Seed , 1996].
В 90-е годы были представлены результаты 26 проспективных исследований связи Лп(а) с развитием ИБС или ее осложнений [Danesh et al., 2000]. Мета-анализ этих исследований показал, что риск возникновения не фатального инфаркта миокарда (ИМ) или смерти от ИБС при наличии высокой концентрации Лп(а) увеличивается на 60-70% [Danesh et al., 2000]. Результаты 7-летних наблюдений в Великобритании, в которые были включены 21520 мужчин, показали, что повышенный уровень Лп(а), аналогично повышенной концентрации апоВюо и пониженной - апоАІ, связан с риском возникновения ИМ [Wald et al., 1994]. Наблюдения за здоровыми мужчинами с повышенным уровнем ХС-ЛНП ( 4,9 ммоль/л) в течение 7 лет показали, что после исключения влияния возраста, курения, АД, массы тела, ХС-ЛНП и ХС-ЛВП, Лп(а) является независимым фактором риска развития ИБС [Schaefer et al., 1994]. Исследование Gottingen Risk Incidence and Prevalence Study (GRIPS) продемонстрировало, что наряду с общепризнанными факторами, такими как ХС-ЛНП, семейный анамнез ИМ, пониженный ХС-ЛВП и высокий уровень фибриногена, Лп(а) является фактором риска ИМ [Wald et al.,1994]. У лиц с низким ХС-ЛНП повышенный уровень Лп(а) ( 30 мг/дл) также был связан с увеличением риска ИМ [Cremer et al., 1995]. Однако существуют исследования, где не подтверждается связь Лп(а) с ИБС и ее проявлениями. В частности, при наблюдении за 15000 американскими врачами в течение 5 лет - Physicians" Health Study- (PHS) не показано связи между уровнем Лп(а) и развитием фатального и не фатального ИМ [Ridker et al., 1993]. Интерпретация результатов этого исследования затруднена в связи с применением обследованными аспирина. Противоречия в результатах при исследовании связи Лп(а) и риска сердечно-сосудистых заболеваний были обнаружены также в случае, когда исследование были включены группы пациентов с невысоким (5,6 ммоль/л) и сильно повышенным уровнем ХС-ЛНП [Maher et al., 1995]. Проспективное исследование среди больных с имеющейся ИБС - Scandinavian Simvastatin Survival Study (SSS Study) установило, что. Лп(а) является независимым предиктором как коронарных осложнений, так и общей смертности (относительный риск- 1,3) [Berg et al., 1997]
В многоцентровом европейском исследовании с участием 2587 больных было установлено, что у обоих полов все липидные показатели, включая Лп(а), связаны с ангиографически доказанным коронарным атеросклерозом, причем связь эта количественная, т.е. с увеличением концентрации ОХС, ХС-ЛНП и апоВ или снижением ХС-ЛВП и апо AI, возрастает количество пораженных артерий. Причем, было показано, что Лп(а) связан с ИБС в такой же степени, как и ОХС и ХС-ЛНП [Bolibar et al., 1995]. При исследовании 118 мужчин без ИМ в анамнезе установлена положительная связь Лп(а) с коронарными индексами сосудов, стенозов и протяженности поражения коронарных артерий [Budde et al., 1994]. Корреляция концентрации Лп(а) в крови с наличием гемодинамически незначимых бляшек, обнаруженная в исследовании японских ученых позволяет предполагать, что Лп(а) участвует в атеросклеротическом процессе на ранней стадии его возникновения. Эти данные свидетельствуют о том, что Лп(а) может способствовать развитию нарушенного тонуса сосуда, действуя, вероятно, через факторы гемостаза на том этапе, когда видимые изменения в коронарных артериях еще отсутствуют.
W.Terres и соавт. (1995) с помощью повторных ангиографических исследований, проведенных с интервалом в 66 дней, продемонстрировали, что только концентрация Лп(а) связана с быстрым прогрессированием коронарного атеросклероза: у 21 больного с прогрессированием поражения, медиана уровня Лп(а) была в 4,5 раза выше, чем у 58 больных без прогрессирования (66 мг/дл и 13 мг/дл соответственно, р=0,01). Наблюдение за 85 больными ИБС в течение 2 лет с проведением повторной коронарографии показало, что прогрессирование атеросклероза без ИМ (группа 48 человек) связана с более высоким уровнем Лп(а) и более низкой концентрацией ХС-ЛВП [Tamura et al., 1995]. При изучении состава бляшек, полученных при атероэктомии, было обнаружено более высокое содержание Лп(а) при нестабильной, чем при стабильной стенокардии [Dangas et al., 1998], что позволяет предположить участие Лп(а) в росте бляшки. Итак, большая часть результатов современных исследований демонстрирует прямую связь уровня Лп(а) с наличием, прогрессированием и степенью выраженности коронарного атеросклероза. Существует предположение, что повышенный уровень Лп(а) может служить одним из предикторов смерти от ИБС мужчин в молодом и среднем возрасте [Suttonyrrell et al., 1996]. Известно, что у этой категории больных первым клиническим проявлением коронарного атеросклероза становятся фатальный ИМ или внезапная смерть, которая в 50% случаях приводит к летальному исходу на догоспитальном этапе. Мы разделяем эту точку зрения [Лякишев и др,. 1991; Лякишев и др., 2001; Ежов и др., 1999; Ежов и др., 2000].
Гомология первичной структуры молекулы белка апо(а) с плазминогеном позволяет предполагать участие частицы Лп(а) в процессах тромбообразования. В экспериментальных работах показано, что Лп(а) подавляет связывание плазминогена с его рецепторами на клетках эндотелия, конкурирует с тканевым активатором плазминогена за связывание с фибрином [Loscalzo et al., 1990]. В предыдущих исследованиях была установлена связь высокого уровня Лп(а) с перенесенным ИМ у мужчин [Kostner et al., 1981; Kark et al., 1993]. Клинические данные свидетельствуют о связи Лп(а) с самыми начальными изменениями в коронарных артериях [Budde et al., 1994; Tsurumi et al., 1995; Takami et al., 1995]. В нескольких клинико-анатомических исследованиях показано, что примерно в половине случаев ИМ развивается в артериях, имевших стенозы диаметром менее 50%. [Fishbein, Siegel, 1996]. Кроме того, у больных с развивающимся ИМ и исходно повышенным уровнем Лп(а), вероятность спонтанной реперфузии пораженной коронарной артерии ниже по сравнению с больными с нормальным уровнем Лп(а) [Moliterno et al., 1993]. Учитывая эти данные, можно предполагать, что развитию инфаркта миокарда со стойкой окклюзией способствуют протромботические свойства апо(а) [Hervio et al., 1993]. Результаты британского проспективного 3-х летнего наблюдения за 266 больными с диагнозом острого ИМ [Stubbs et al., 1998] показали, что Лп(а) 30 мг/дл связан с увеличением на 62% сердечной смертности в сравнении с группой с нормальным уровнем Лп(а). Многофакторный анализ выявил, что относительный риск смерти от кардиальных причин у больных с ИМ и Лп(а) 30 мг/дл составляет 2,16.
Метод колоночной хроматографии
Исследуемый образец сорбента, уравновешенного ФБ, помещали в колонку с площадью поперечного сечения 1 см . В зависимости от целей эксперимента, на колонку наносили от 5 до 30 мл плазмы крови человека со скоростью от 0,3 до 3,0 мл/мин. Время контакта сорбента с плазмой составляло в различных опытах от 30 мин до 3 часов. После нанесения плазмы колонку промывали ФБ, контролируя удаление белков плазмы спектрофотометрически по поглощению А280 в элюатах. При А280 0,02 начинали элюцию белка с сорбента. Элюцию проводили 0,2М глициновым буфером рН 2,5 ( для анти-ЛНП иммуносорбента с ПкАт) или рН 3,0 (для анти ЛНП-иммуносорбента с МкАт и для анти-Лп(а) иммуносорбента). Фракции элюата, имеющие оптическую плотность при 280 нм больше 0,1 - 0,2 о.е., объединяли, доводили рН до нейтрального, определяли содержание в них общего белка и холестерина.
При изучении условий регенерации сорбента, а также кинетики сорбции антигенов на иммуносорбенты, аффинную хроматографию проводили «batch» методом. Использовали образец геля объемом 100 - 200 мкл, объем плазмы крови, инкубируемой с сорбентом, составлял 1 мл. Гель сорбента, суспендированный в ФБ, осаждали центрифугированием в течение 1 мин. при 7000 g в настольной микроцентрифуге «Microfuge 8» («Beckman», США) в градуированной пробирке «Eppendorf». Доводили объем геля до 1 мл, удаляя излишки геля и буфера, добавляли 1 мл ФБ, перемешивали, центрифугировали. Процедуру промывки геля ФБ повторяли трижды. Затем добавляли 1 мл плазмы и инкубировали на шейкере KS 10 («Edmund Buhler», Германия). Время инкубации сорбентов с плазмой варьировалось в различных опытах от 15 мин. до 24 часов. После инкубации плазму удаляли, а гель вновь трижды промывали ФБ как описано выше. Элюцию проводили 0,2М глициновым буфером рН 2,5 или 3,0, добавляя 2 раза по 500 мкл. Элюат объединяли и определяли в нем содержание белка и холестерина. Неспецифическую сорбцию белков на матрице и эффект разведения исходной плазмы контролировали в параллельном опыте с образцом матрицы с иммобилизованным этаноламином. денатурирующих условиях проводили в полиакриламидном геле (ПААГ), используя буферную систему Laemli [Laemli, 1970]. Гели с различной концентрацией полиакриламида готовили на основе исходного 30% акрил амида.
При изучении белкового состава липопротеидов электрофоретическое разделение препаратов проводили в геле, приготовленном по методике Swaney [Swaney etal., 1976] с модификацией по Irwin [Irwin et al., 1984]. Использовали гель с линейным градиентом ПААГ от 3% до 7%; концентрирующий гель имел 3% концентрацию акриламида. Образцы для электрофореза готовили следующим образом. К исследуемому раствору антител или липопротеидов, с концентрацией приблизительно 0,1 мг/мл белка, добавляли в соотношении 1:1 буфер, содержащий 2,8% бетамеркаптоэтанола, 0,2% додецилсульфата натрия, 20 мМ трис-HCl рН 6,8, 2% сахарозы, 2 мг бромфенолового синего. Образцы прогревали в течение 10 мин. на кипящей водяной бане. Электрофорез вели в течение 1,5 часов при 20С, силе тока 20 мА и напряжении 100 V. Использовали прибор для вертикального электрофореза («BioRad», Венгрия) с пластинами размером 10 X 10 см, толщина геля составляла 1 мм. Окрашивание гелей проводили 0,125% раствором Coomassie Blue R-250 («Sigma», CIIIA) в смеси этанол: уксусная кислота: вода в соотношении 1:1:8. 5.1.2. Электрофорез в геле агарозы. Электрофорез препаратов липопротеидов в 0.5% агарозном геле проводили по общепринятой методике [Остерман Л.А. 1983] в трис-ацетатном буфере рН 8,7. Для приготовления пластин агарозного геля (10 X 10 см) использовали Agarose IEF («Amercham Bioscience», Швеция) с низким эндоосмосом и пластины «Gel Bond» («Amercham Bioscience» , Швеция) в качестве подложки. Пластины геля для электрофореза перед использованием выдерживали на холоде при 2-8С во влажной камере в течение суток для завершения полимеризации. Образцы для электрофореза готовили следующим образом: к исследуемому -75 препарату липопротеидов, содержащему 7-10 мг/мл белка, добавляли 1/10 часть буфера ( 35% раствор глицерина в воде с 0,15 М ЭДТА). В каждую лунку вносили по 10 мкл раствора исследуемых образцов. Электрофорез вели в течение 2 часов при +4С, силе тока 100 мА в приборе для горизонтального электрофореза «Bio Rad», США. После окончания электрофореза белки в геле фиксировали 5% раствором трихлоруксусной кислоты в воде, затем высушивали и проводили окрашивание 0,1% раствором Coomassi Blue R-250 в смеси этанол : уксусная кислота : вода в соотношении 5:1:5. 5.2. Иммунологические методы. 5.2.1. Метод двойной радиальной иммунодиффузии. Двойную диффузию проводили в соответствии с методикой, описанной [Ouchterlony et al., 1958]. На пластинку с липофильной поверхностью «Gel Bond» размером 10x10 наливали горячий 0,5% раствор агарозы, приготовленный на основе буфера 60 мМ трис-НС1, 6 мМ ацетата натрия, 2 мМ ЭДТА. После охлаждения в сформировавшимся геле делали пробойником лунки. В лунки вносили по 10 мкл растворов антител и сыворотки человеческого донора, разбавленную в 4 раза. Пластину оставляли на сутки при комнатной температуре во влажной камере для диффузии и образования полос преципитата. Затем гель отмывали в ФБ в течение 3-4 часов, высушивали и окрашивали как описано в разделе 5.1.2..
Проведение процедуры афереза с использованием иммуносорбционных колонок
Препарат ЛНП человека, выделенный как описано выше, использовали в качестве антигена для иммунизации животных-доноров. Задачей этого этапа было получение хорошего иммунного ответа и сывороток с высокими титрами и последующего выделения препаративных количеств антител из антисыворотки. Титры антител в полученной антисыворотке контролировали методом радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони [Ouchterlony, 1958]. Оптимизация схемы иммунизации животных позволила нам стабильно получать сыворотки с титрами антител 1:64 - 1:128, вместо значений 1:8 -1:16, обычно получаемых при иммунизации животных препаратом ЛНП человека.
При выборе метода выделения антител из антисыворотки мы учитывали следующие обстоятельства: во-первых - так как задачей работы являлось получение иммуносорбента для клинического использования, необходимо было получить препарат антител, свободный не только от примеси других белков сыворотки, но и неиммунных иммуноглобулинов. В идеале эффективное связывание сорбентом удаляемого компонента должно обеспечиваться минимально возможным количеством иммобилизованного белка; во-вторых - необходимо было разработать такой воспроизводимый метод выделения антител, который обеспечивал бы получение препаративных количеств ПкАт в течение длительного времени от разных животных и был бы удобен для последующего масштабирования и создания технологии.
Эксперименты показали, что препараты фракции иммуноглобулинов, полученные из антисыворотки разных животных путем осаждения сульфатом аммония или полиэтиленгликолем (ПЭГ) с молекулярной массой 6000 содержат различное количество активных антител. При использовании их для синтеза иммуносорбентов не соблюдались указанные выше требования и существенно затруднялось сравнение свойств полученных иммуносорбентов.
Необходимость проведения диализа после стадии осаждения сульфатом или ПЭГ существенно увеличивала время выделения антител и делала метод в перспективе менее технологичным и более трудоемким. Наиболее удовлетворял заданным критериям одностадийный метод жидкостной аффинной хроматографии на колонке с иммобилизованным антигеном (ЛНП). Пик суммарного белка, элюируемого с колонки, и пик активности антител, определенной методом иммуноферментного анализа, практически совпадали, что свидетельствовало о чистоте выделенного препарата и отсутствии примесей балластного белка неиммуных иммуноглобулинов.
На этом этапе работы нас интересовали также количественные параметры выбранного метода очистки, а именно: условия полного извлечения антител из сыворотки или минимальная потеря антител, сорбционная емкость аффинного носителя, условия регенерации и стабильность работы геля ЛНП-агарозы. Возможность ее длительного многократного эффективного использования. Оптимальные условия проведения аффинной хроматографии антисыворотки барана на ЛНП-агарозе были подобраны в результате серии экспериментов. Было показано, что увеличение количества иммобилизованных ЛНП приводит к увеличению сорбции антител только в области низких концентраций лиганда. Этот эффект обусловлен, видимо, большими размерами частиц ЛНП (около 2000 кДа) и, вследствие этого, их преимущественно поверхностной локализацией на сферических гранулах агорозной матрицы при иммобилизации. Для дальнейшей работы мы использовали сорбенты, содержащие 2-3 мг иммобилизованного белка ЛНП на один мл геля. Связывание антител зависит также от времени нанесения антисыворотки на колонку. Нами были подобраны оптимальные режимы рециклинга антисыворотки в течение трех часов при комнатной температуре, либо в течение 16 часов при +2-8 С. Использование аффинной хроматографии позволило нам разработать одностадийный хорошо воспроизводимый метод выделения высокоочищенного препарата антител, свободного от примесей как неиммунных иммуноглобулинов, так и других белков сыворотки крови барана. Мы проверяли чистоту и специфичность выделенных препаратов антител несколькими независимыми методами. Методом вертикального электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях, показано, что препарат ПкАт содержит два мажорных белковых компонента, которые соответствуют по молекулярной массе тяжелым и легким цепям молекулы иммуноглобулинов класса G (Рис. 1.5, а). При исследовании специфичности полученных антител использовали метод двойной радиальной иммуно диффузии. Было показано, что поликлональные антитела образуют полосу преципитации с препаратами ЛНП, ЛОНП и не взаимодействуют с препаратами ЛВП и делипидированной плазмой человека, что свидетельствует о моноспецифичности полученных антител по отношению к ЛНП человека (Рис. 1.5, б). Результаты тестирования антител методом иммуноэлектрофореза приведены на рисунке 1.5(B). Показано, что полученные антитела образуют одну полосу преципитации с сывороткой крови человека, идентичную полосе преципитации с ЛНП, что также свидетельствует о моноспецифичности полученных ПкАт. Таким образом, антитела, выделенные при помощи разработанного метода, имели характеристики, позволяющие использовать их для синтеза сорбентов, предназначенных для терапевтического афереза.
