Содержание к диссертации
Введение
1. Общая характеристика работы 5
1.1. Актуальность темы 5
1.2. Цель и задачи работы 6
1.3. Научная новизна 7
1.4. Практическая значимость работы 7
1.5. На защиту выносятся 8
1.6. Апробация работы 8
1.7. Публикации результатов исследований 8
1.8. Внедрение 8
1.9. Объем и структура диссертации 9
2. Обзор литературы 10
2.1. Промышленная технология изготовления Хитозана 10
2.2. Диагностикумы, иммуноферментный анализ, получения отрицательных и положительных сывороток от животных 11
2.3. Способы получения Хитозана 13
2.4. Биологическая активность хитозана 21
2.5. Применение низкомолскулярпого хитозана в медицине и ветеринарии .29
2.6. Биологически активные вещества (БАВ) 38
2.7. Иммуноферментный анализ для диагностики инфекционных болезней 45
3. Собственные исследования 57
3.1. Материалы и методы исследований 57
4. Результаты исследований 59
4.1. Совершенствование технологии изготовления хитозана для использования его в качестве адъюванта 59
4.2. Способ получения биологически активной добавки из перепелиных яиц 60
4.3. Использование хитозана и биологически активной добавки из перепели- ного яйца для увеличения выхода при получении отрицательных и гипериммунных сывороток животных 64
4.3.1. Изучение адъювантных свойств различных форм хитозана 64
4.3.2. Получение отрицательных и гипериммунных сывороток для изготовления иммуноферментных тест-систем от животных, получавших с кормом хитозан и БАВ из перепелиного яйца 68
4.4. Влияние хитозана на жизнеспособность церкарий семейства Schisto-somatidae и создание на его основе защитных средств от церкариоза 70
4.5. Способ получения отрицательных рефереис-сывороток для контроля качества иммуноферментных тест-систем, предназначенных для выявления специфических антител к вирусным респираторным инфекциям в биологических жидкостях организма крупного рогатого скота 74
4.6. Способ получения стандартной положительной панели сывороток крови для контроля качества иммуноферментных тест-систем, предназначенных для выявления специфических антител к вирусным респираторным инфекциям в биологических жидкостях организма крупного рогатого скота 91
5. Практические предложения 105
6. Выводы 106
7. Список литературы 107
8. Приложения 135
- Актуальность темы
- Диагностикумы, иммуноферментный анализ, получения отрицательных и положительных сывороток от животных
- Материалы и методы исследований
Введение к работе
1.1.Актуальность темы. Хитин был открыт в 1811 г. (Н. Braconnot, A. Odier), хитозан – в 1859 г. (С. Rouget), хотя свое нынешнее название получил в 1894 г. (F. Hoppe-Seyler). В первой половине ХХ века к хитину и его производным был проявлен заслуженный интерес, в частности к нему имели непосредственное отношение три Нобелевских лауреата: E. Fisher (1903) синтезировал глюкозамин; P. Karrer (1929) провел деградацию хитина с помощью хитиназ и, наконец, W.N. Naworht (1939) установил абсолютную конфигурацию глюкозамина. В России первые работы по хитину относятся к 1933 – 1934 гг. (П.П. Шорыгин), хотя широкомасштабные исследования были начаты около 30 лет назад. Сегодня интерес к этим биополимерам небывало возрос. Чем больше ученые узнают о свойствах хитина и хитозана, тем шире сфера их практического использования. С каждым годом возникают совершенно новые и неожиданные направления. К числу основных направлений использования хитозана можно отнести медицину, ветеринарию, сельское хозяйство, косметологию и пищевую промышленность (А.И.Албулов, В.П.Варламов, А.В. Гринь и др., 2000-2009 гг.).
От способа получения хитозана и метода его контроля зависит его качество и стандартность (К.Г. Скрябин, Г.А. Вихорев, В.П. Варламов, 2002; В.М. Быкова, С.В. Немцев, 2002; А.И. Албулов и др., 2005).
Биологически активные вещества (БАВ), неспецифические средства, которые производятся из компонентов различного природного происхождения (морепродукты, микроорганизмы, животные, растения и т.д.) используются в качестве подкормки для животных, птиц, насекомых и растений, оказывают стимулирующий иммунитет, антимикробное, сорбционное, антиоксидантное воздействие, улучшают качество обрабатываемого продукта и находят все более широкое применение в ветеринарии.
Биологически активные вещества, обладающие способностью воздействовать на иммунокомпетентные системы, делятся на экзогенные и эндогенные. Подавляющее большинство первых - это вещества микробного происхождения (бактериального и грибкового). БАВ эндогенного происхождения условно разделяют на две группы: иммунорегуляторные пептиды и цитокины. Пептиды представляют собой в основном экстракты из органов иммунной системы (тимуса, селезенки) или продукты их жизнедеятельности (костного мозга). Под цитокинами понимают всю совокупность биологически активных белков, продуцируемых лимфоцитами и макрофагами: интерлейкины, моно-кины и интерфероны (Е.В. Крыжановская, 2008).
До настоящего времени данные связи между физико-химическими характеристиками хитозана и его биологическими свойствами носят разрозненный и не систематический характер (С.Н. Куликов, 2006).
Одним из основных направлений в промышленной биотехнологии является обеспечение животноводства и ветеринарии эффективными и качественными препаратами, в том числе диагностическими. Несмотря на то, что ветеринарная практика имеет в своем распоряжении большой набор диагностических препаратов, увеличение номенклатуры, улучшение качества и стандартизации диагностических тест-систем для практических лабораторий по-прежнему остается актуальной задачей (И.Н. Матвеева, 2008).
1.2.Цель и задачи работы. Целью настоящей работы является разработка и усовершенствование технологий получения хитозана и биологически активных добавок для производства диагностических и лечебных препаратов.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
1. усовершенствовать технологию изготовления хитозана для использования его в качестве адъюванта;
2. разработать способ получения биологически активной добавки из перепелиных яиц;
3. провести исследования по увеличению выхода количества отрицательных и гипериммунных сывороток животных для изготовления иммуноферментных тест-систем с использованием хитозана и БАВ из перепелиного яйца;
4.провести исследования по изучению влияния хитозана на жизнеспособность церкарий семейства Schistosomatidae и создание на его основе защитных средств от церкариоза.
1.3.Научная новизна. Впервые разработан технологический процесс получения глюкозамина, путём солянокислого гидролиза хитина, оптимизированы отдельные стадии процесса его выделения и очистки.
Впервые разработан способ получения БАВ (пищевой добавки) из свежих перепелиных яиц (не более 7-ми суток хранения в стерильных условиях), размолотых со скорлупой до однородной гомогенной массы, фильтрованной, лиофильно высушенной при отрицательном давлении не ниже 50 микрометров ртутного столба при начальной температуре минус 60-65 0С в течение 48-ми ч, затем измельченной и расфасованной в желатиновые капсулы. Таким образом, высокотехнологичный способ получения из перепелиных яиц биологической пищевой добавки, в которой сохранены в течение 12-ти месяцев при температуре хранения 4-25 0С все природные качества свежего перепелиного яйца, обогащенного растворимым кальцием (Патент РФ № 2009105619/13 от 19.02.09).
Впервые для увеличения выхода сыворотки крови в качестве кормовой добавки для животных использовали хитозан и БАВ из перепелиных яиц и разработан способ получения отрицательных референс-сывороток (Патент
№ 2008132387/15 от 07.08.08 г.) и положительных сывороток крови для контроля качества иммуноферментных тест-систем, предназначенных для выявления специфических антител к вирусным респиратурным инфекциям в биологических жидкостях организма крупного рогатого скота (Патент № 2008132390/13 от 07.08.08 г.).
Впервые для создания высокоэффективных защитных средств от церкариоза (семейства Schistosomatidae) использован хитозан.
1.4. Практическая значимость работы.
1.Усовершенствованы процессы получения глюкозамина из хитина камчатского краба.
2.Подобраны эффективные формы хитозана в качестве адъюванта.
3.Разработан способ получения БАВ из перепелиного яйца.
4. Разработан способ получения лечебных гелей, содержащих хитозан, ДБФ и ЭДТА.
1.5. На защиту выносятся:
-
Усовершенствование технологии изготовления хитозана для использования его в качестве адъюванта;
-
Способ получения биологически активной добавки из перепелиных яиц;
3. Исследования по использованию хитозана и биологически активной добавки из перепелиного яйца для увеличения выхода отрицательных и гипериммунных сывороток животных для иммуноферментных тест-систем;
4. Исследование по изучению влияния хитозана на жизнеспособность церкарий семейства Schistosomatidae и создание на его основе защитных средств от церкариоза.
1.6. Апробация работы. Материалы диссертации докладывались:
- на заседаниях Ученого Совета Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности, Щёлково, 2006-2010 гг.;
- на Международной конференции, Краснодар, 2009г.;
- на Международной научно-практической конференции, посвященной 40-летию Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности, Щелково, 2009г.
1.7. Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликованы 6 научных работ, в том числе 1 патент РФ, и 2 публикации в реферируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.
1.8. Внедрение. В 2006-2010 гг., изготовлены и паспортизированы по разработанной методике 113 кг низкомолекулярного хитозана и экспериментальных серий БАВ из перепелиного яйца для производства биопрепаратов.
1.9. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, список литературы и приложения. Диссертация иллюстрирована 17 таблицами и 24 рисунками. Список литературы содержит 275 источников, в том числе 145 зарубежных.
Актуальность темы
Актуальность темы. Хитин был открыт в 1811 г. (Н. Braconnot, А. Odier), хитозан — в 1859 г. (С. Rouget), хотя свое нынешнее название получил в 1894 г. (F. Hoppe-Seyler). В первой половине XX в. к хитину и его производным был проявлен заслуженный интерес, в частности к нему имели непосредственное отношение три Нобелевских лауреата: Е. Fisher (1903) синтезировал глюкозамин; P. Karrer (1929) провел деградацию хитина с помощью хитиназ и, наконец, W.N. Naworht (1939) установил абсолютную конфигурацию глюкозамина. В России первые работы по хитину относятся к 1933 — 1934 гг. (П.П. Шорыгин), хотя широкомасштабные исследования были начаты около 30 лет назад. Сегодня интерес к этим биополимерам небывало возрос. Чем больше ученые узнают о свойствах хитина и хитозана, тем шире сфера их практического использования. С каждым годом возникают совершенно новые и неожиданные направления. К числу основных направлений использования хитозана можно отнести медицину, ветеринарию, сельское хозяйство, косметологию и пищевую промышленность (А.И.Албулов, В.П.Варламов, А.В. Гринь и др., 2000-2009гг.).
От способа получения хитозана и метода его контроля зависит его качество и стандартность (К.Г. Скрябин, Г.А. Вихорев, В.П. Варламов, 2002; В.М. Быкова, СВ. Немцев, 2002; А.И. Албулов и др., 2005).
Биологически активные вещества (БАВ), неспецифические средства, которые производятся из компонентов различного природного происхождения (морепродукты, микроорганизмы, животные, растения и т.д.) используются в качестве подкормки для животных, птиц, насекомых и растений, оказывают стимулирующий иммунитет, антимикробное, сорбционное, антиоксидантное воздействие, улучшают качество обрабатываемого продукта и находят все более широкое применение в ветеринарии.
Биологически активные вещества, обладающие способностью воздействовать на иммунокомпетентные системы, делятся на экзогенные и эн 6 догенные. Подавляющее большинство первых - это вещества микробного происхождения (бактериального и грибкового). БАВ эндогенного происхождения условно разделяют на две группы: иммунорегуляторные пептиды и ци-токины. Пептиды представляют собой в основном экстракты из органов иммунной системы (тимуса, селезенки) или продукты их жизнедеятельности (костного мозга). Под цитокинами понимают всю совокупность биологически активных белков, продуцируемых лимфоцитами и макрофагами: интер-лейкины, монокины и интерфероны (Е.В. Крыжановская, 2008).
До настоящего времени данные связи между физико-химическими характеристиками хитозана и его биологическими свойствами носят разрозненный и не систематический характер (С.Н. Куликов, 2006).
Одним из основных направлений в промышленной биотехнологии является обеспечение животноводства и ветеринарии эффективными и качественными препаратами, в том числе диагностическими. Несмотря на то, что ветеринарная практика имеет в своем распоряжении большой набор диагностических препаратов, увеличение номенклатуры, улучшение качества и стандартизации диагностических тест-систем для практических лабораторий по-прежнему остается актуальной задачей (И.Н. Матвеева, 2008).
Диагностикумы, иммуноферментный анализ, получения отрицательных и положительных сывороток от животных
Метод ИФА широко используется для серодиагностики ПГ-3 за рубежом [60, 59, 67]. В нашей стране разработана тест-система на основе ИФА во ВНИТИБП [32, 29, 34]. Разработанные на основе моноклональных антител к антителам lgGh IgG2, IgM, IgA диагностикумы ELISA позволили определить (используя экспериментально зараженных телят), что наиболее точную ин-формацию о заражении животных дает использование ИФА, выявляющее IgM, на втором месте IgA, а сероконверсия иногда не позволяет выявить заражение; реинфицирование животных по сероконверсии определить намного труднее [67].
За последние десятилетия широкое распространение в диагностике получил метод ИФА. Данный метод можно использовать для выявления практически любой иммунореактивиой молекулы. Применительно для выявления вируса ВД-БС КРС преимущества данного метода состоят в том, что он не зависит от клеточных культур, применим для массового скрининга, результаты могут быть получены в течение нескольких часов. Среди разнообразных вариантов проведения данного метода для выявления вируса ВД -БС КРС часто применяется непрямой метод ИФА, где антиген мобилизуется на полистироловом носителе, и затем взаимодействует со специфическими антителами, которые затем выявляются с помощью конъюгированных с ферментом антиглобулинов и хромогенного субстрата.
Одной из проблем в разработке ИФА является фоновое свечение, вызванное перекрёстной реакцией конъюгированных антиглобулинов, что приводит к существованию так называемой «серой зоны», где полученный результат реакции не может однозначно интерпретироваться как положительный или отрицательный. Значительно повысить специфичность реакции позволило применение МА. Однако при этом необходимо оценивать способность полученных МА реагировать со всеми вирусными штаммами.
Вирус ВД-БС КРС считается устойчивым вирусом, но необходимособ-людать требования транспортировки и хранения клинического материала до получения результатов исследования. Максимальное количество вируса содержится в носовых истечениях, фекалиях. Для выделения вируса это не совсем удобный материал, поскольку данные образцы часто контаминированы микробами и веществами, токсичными для культуры клеток. Кровь для выделения вируса необходимо брать от живого животного, тогда как от трупов берут фрагменты внутренних органов. Для выявления вируса ВД-БС КРС существует три основных метода. Выделение вируса в культуре клеток и выявление вируса с применением меченых антител. Антигены вируса ВД-БС КРС можно выявлять специфическими антителами непосредственно в клинических образцах без культивирования вируса. И третий способ- это выявление в исследуемых образцах вирусной РНК. Исследование материала с помощью электронного микроскопа после негативного окрашивания обычно не позволяет выявить вирус ВД-БС КРС, так как вирус при этом имеет расплыв-чивый вид.
Установлена в 100 раз большая чувствительность для выявления антител к гексоновому антигену аденовирусов по сравнению с РСК. Получение гипериммунных сывороток - один из ответственных этапов при создании ИФА-теста серодиагностики данной инфекции. Третьякова и др. [11] получили гипериммунные, высокоактивные специфические сыворотки против гексонов аденовирусом I подгруппы (BAVI и BAV3) и II подгруппы (BAV7), которые были рекомендованы при разработке иммуноферментного набора для серодиагностики аденовирусной инфекции КРС.
Материалы и методы исследований
Исследования проводились в отделе биологически активных соединений ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности».
В работе использовали: инактивированную вакцину против ротовирус-ной инфекции и колибактериоза; культуру клеток СПЭВ; питательные среды Игла и 199; мясо-пептоный агар; хитин; мелкодисперсный хитозан; дистиллированную воду; алюмокалиевые квасцы; теотропин; 10%-ный раствор нейтрального формалина; 12,5 М соляную кислоту; ЭДТА; дибутилфталат (ДБФ); 96%-ный этиловый спирт; активированный уголь с размером зерна 3 мм; КРС - 16-18 мес; лабораторных животных (белые крысы и морские свинки): живые личинки трематод семейства Schistosomatidaerichobilharzia spp; лабораторное оборудование (реактор с кислотоустойчивым покрытием и механическим приводом; стеклянная емкость для кристаллизации; вакуумный фильтр; кислотосборник; предметные стекла; микроскоп БМ-51-2).
Для проверки адъювантных свойств хитозана исследования проводились на белых крысах. Контролем служили алюмокалиевые квасцы в общепринятых концентрациях. В качестве антигенов использовали инактивированные вакцины против ротавирусной инфекции и колибактериоза. Ротавирусы выращивали на культуре клеток СПЭВ с использованием питательных сред Игла и 199, эшерихии выращивали на мясо-пептонном агаре. Титр вируса в вакцине был 7,0 Lg ТЦД50/мл, эшерихии - 5 млрд. микробных тел в 1 мл. инактивацию вирусов и бактерий проводили теотропином в конечной концентрации 0,2%. В инактивированные антигены вносили хитозан различных препаративных форм до конечной концентрации 0,25%, тщательно перемешивали и вводили в/м крысам в дозе 0,5 мл. Через 7 дней животных тотально обескровливали и в сыворотках крови определяли наличие антител к рота-вирусу в РНГА, к эшерихиям - в РА.
Для оценки морфологических изменений в тканях крыс под воздействием вакцины с хитозаном до вакцинации, а также на 3- и 7-й дни после нее у крыс отбирали ткань с места введения препаратов. Материал фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина.
Для оптимизации процесса получения глюкозамина из хитина в качестве сырья использовался хитин, изготовленный в отделе получения БАВ ВНИТИБП из панциря камчатского краба с содержание влаги 5-7% и минеральных веществ 0,16%. Для гидролиза хитина применяли 12,5М соляную кислоту. Очистку получаемого продукта осуществляли 96%-ным этиловым -спиртом и активизировали углем с размером зерна 3 мм.
При исследовании влияния хитозана на жизнеспособность церкарий семейства Schistosomatidae использовали живые личинки трематод - Trichobil-harzia spp.
В качестве церкарицидных средств использовали хитозаны с различной молекулярной массой и его композиции в составе гелей.
Методика исследования заключалась в нанесении 5 мкл тестируемого вещества на дно лунки предметного стекла тонким слоем с последующим внесением 150 мкл воды с церкариями. Наблюдение за поведением церкарий проводилось с использованием микроскопа БМ-51-2 в течение 20 мин. Фиксировалось время потери плавательной активности (ППА) и гибели всех церкарий.
Статистическая обработка полученных результатов проводилась с помощью стандартных программ на ПЭВМ.
