Введение к работе
Актуальность проблемы.
Технология рекомбинантных ДНК позволяет создавать надежные вакцины, используя при этом разные подходы. Удаляя гены, ответственные за вирулентность, получают живые вакцины, содержащие непатогенные, иммунологически активные штаммы, которые не могут рсвертировать и становиться патогенными. Гены, кодирующие основные антигенные детерминанты патогенного организма, встраивают в геном непатогенного носителя (обычно вируса) и получают безопасную, не содержащую болезнетворных микроорганизмов вакцину. Наконец, гены или их сегменты, кодирующие основные антигенные детерминанты патогенных микроорганизмов, встраивают в экспрессирующие векторы, получают нужный продукт в большом количестве и используют его как вакцину. Последний подход позволяет производить субъединичные и пептидные вакцины.
Вакцины, созданные на основе антигенных эпитопов, экспонированных па поверхности вирионов, имеют ряд преимуществ но сравнению с вакцинами, полученными традиционными методами. Во-первых, короткие пептиды сами по себе характеризуются низкой иммуногешюстыо, и не в состоянии индуцировать достаточно высокий иммунный ответ. Рекомбинантные вирусные частицы, с экспонированными на поверхности эпитопами, напротив, имеют повышенную активность, и не в последнюю очередь за счет адъювантных свойств самих вирионов. Во-вторых, простота очистки вируса делает процесс производства вакцины быстрым и малозатратным.
Вирус табачной мозаики (ВТМ) был первым вирусом, использованным для разработки данного типа вакцины. Частица ВТМ содержит 5% РНК и 95% белка. 2130 субъединиц белка оболочки (БО) (158 а.к.) упаковывает геномную РНК (6395 нуклеотидов) в частицу длиной 300 и шириной 18 пм. Большой урожай вируса (до 5 г/кг листового материала), высокая стабильность, а также легкость очистки вирусных препаратов привлекает исследователей.
В руководстве работой над диссертацией принимала участие Татьяна Валерьевна Комарова
При сборке in vitro РНК ВТМ взаимодействует с БО посредством сайта инициации сборки. Анализ вторичной структуры БО ВТМ выявил, что N- и С-концевые участки располагаются на поверхности субъединицы и вириона, а значит, могут быть использованы для включения дополнительных пептидных вставок или удлинений БО для создания вакцин, например, против раковых заболеваний.
Известно, что рецептор-2 человеческого эпидермального фактора роста (HER2/neu; Human Epidermal growth factor Receptor 2) при НЕЯ2-позитивном раке молочной железы человека является актуальной мишенью для вакцинотерапии. Недавно были выявлены участки пептидов онкобелка HER2/neu, которые взаимодействуют с моноклональными антителами трастузумаб, известного также как герцептин (производимый швейцарской фирмой F.Hoffmann La-Roche) являющегося эффективным средством терапии рака молочной железы. Такие пептиды были названы трастузумаб-связывающими пептидами (trastuzumab-binding peptides - TBPs) (Garrett et al., 2007). TBPs характеризуются иммуногепностыо, ингибируют пролиферацию клеток рака молочной железы, экспрессирующих онкобелок HER2/neu, а также индуцируют антитело-зависимую клеточную цитотоксичность.
Одной из целью данного исследования была разработка методики сборки in vivo ВТМ с экспонированными на поверхности вирионов TBPs. Подход основывается на введении в листья N. benthamiana с помощью Agrobacterium tumefaciens двух типов вирусных векторов, ВТМ и Х-вируса картофеля (ХВК), обеспечивающих сборку и накопление наночастиц. Вирусный вектор на основе ВТМ направляет в клетке синтез РНК ВТМ с сайтом инициации сборки, но лишенного собственного гена БО, а вектор на основе ХВК вместо собственного БО направляет синтез БО ВТМ с TBPs на С- конце.
Поскольку Agrobacterium tumefaciens, играет большую роль в данном исследовании, а также в создании эффективных систем продукции в растении аптираковых вакцин и антител, нами была поставлена вторая задача, а именно
исследование возможной биологической опасности этой почвенной бактерии для млекопитающих и человека.
Таким образом, нами были поставлены следующие цели исследования:
-
Разработать метод сборки трастузумаб (герцептин)-связывающих наночастиц вируса табачной мозаики в листьях Nicatiana benthamiana
-
Изучить биобезопасность использования Agrobacterium tumefaciens.
В процессе работы предстояло решить ряд задач, а именно:
Определить оптимальные условия эффективной сборки рекомбинантного ВТМ.
Изучить морфологические и иммунологические свойства полученных наночастиц рВТМ.
Определить стабильность препарата рекомбинантных вирусных частиц при хранении
Выяснить влияние мутаций в трастузумаб (герцептин) связывающих пептидах на их способность индуцирования у мышей образование функциональных антител, способных узнавать оикобелок HER2/neu на поверхности раковых клеток
Изучить возможность трансформации клеток мыши маркерным геном GFP при бактериемии A. tumefaciens.
Научная новизна и практическая значимость работы.
В ходе данной работы впервые:
Разработана методика сборки трастузумаб-связывающих наночастиц рВТМ в листьях Nicotiana benthamiana
Определены условия эффективной сборки рВТМ.
Подтверждена биологическая безопасность A. tumefaciens для млекопитающих и человека.
Материалы диссертационной работы доложены на следующих международных научных форумах: XVI FESPB Congress, Tampere, Finland, 10-16 августа 2008 года, «Международный форум по нанотехнологиям 08». Москва, 10-12 декабря 2008 года, 34th FEBS Congress, Prague, Czech republic, 4-9 июля 2009 года.
