Роль света в устойчивости растений томата к вирусу табачной мозаики Кузнецова Евгения Николаевна

Содержание к диссертации

Введение

1. Физиолого-биохимическая природа вирусного патогенеза 9

1.1. Развитие представлений о вирусном патогенезе 9

1.2. Молекул ярно-генетические модели в исследованиях вирусного патогенеза 10

1.2.1. Модельные системы в фитовирусологии 11

1.2.2. Репродукция фитовирусов в модельных системах 12

1.3. Реакции растения на внедрение патогена 15

1.3.1. Влияние патогена на энергетику фотосинтеза 15

1.3.2. Влияние патогена на реакции, связанные с дыханием 18

1.3.3. Реакции на внедрение патогена, связанные с белками растения 21

1.4.. Транспорт вирусной инфекции по растению 28

1.4.1. Транспортная форма вирусной инфекции 29

1.4.2. Транспорт вируса в пределах листа 31

1.4.3. Транспорт вирусной инфекции на большие расстояния 34

2. Действие света различного спектрального состава на растения 36

2.1. Реакции растений на свет и фоторецепторы 36

2.2. Предполагаемые механизмы преобразования светового сигнала в морфогенетические реакции 43

2.3. Действие света различного спектрального состава на биохимические и морфологические характеристики растений 44

2.3.1 Влияние света различного спектрального состава на биохимические характеристики 44

2.3.2. Влияние света спектрального состава на морфометрические характеристики 46

3. Материалы и методики исследования 48

3.1. Объект исследования 48

3.2. Условия выращивания растений на белом свету 51

3.3. Эксперименты с использованием света различного спектрального состава 53

3.3.1. Эксперименты по измерению экспозиции спектрального света 54

3.3.2. Эксперименты с использованием контрастных по устойчивости растений томата и спектрального света 56

3.4. Определение количества фотосинтетических пигментов 57

3.5. Количественное определение белка оболочки вируса табачной мозаики 58

3.6. Определение эндогенных фитогормонов 61

3.6.1. Выделение фитогормонов 61

3.6.2. Количественное определение фитогормонов 63

4. Влияние заражения втм на рост, содержание фотосинтетических пигментов и баланс эндогенных фитогормонов растений томата при выращивании на белом свету 66

4.1. Накопление вируса в зараженных растениях томата 66

4.2. Особенности роста зараженных растений томата на белом свету 67

4.3. Влияние заражения на содержание пигментов в растениях томата 71

4.4. Влияние заражения ВТМ на баланс

эндогенных фитогормонов на белом свету 74

5. Влияние синего и красного света различной экспозиции и продолжительности на накопление антигена втм в растениях томата 87

5.1. Динамика титра ВТМ в листьях растений томата при воздействии синего и красного света различной экспозиции 87

5.2, Влияние синего и красного света на накопление антигена ВТМ в листьях восприимчивых, устойчивых и толерантных растениях томата 90

6. Влияние синего и красного света на рост, содержание фотосинтетических пигментов и гормональный баланс растений томата, зараженных ВТМ 97

6.1. Влияние синего и красного света на рост инфицированных ВТМ растений томата 97

6.2. Содержание фотосинтетических пигментов в листьях зараженных ВТМ растений томата при освещении синим и красным светом 101

6.3. Динамика эндогенных фитогормонов в листьях инфицированных ВТМ растений томата на синем и красном свету 108

Заключение 129

Выводы 132

Список литературы 13 3

• Репродукция фитовирусов в модельных системах
• Реакции растений на свет и фоторецепторы
• Условия выращивания растений на белом свету
• Особенности роста зараженных растений томата на белом свету

Введение к работе

Актуальность проблемы. В настоящее время множество исследований посвящено изучению молекулярных механизмов взаимодействия патогенов и растений, начинающегося с их контакта и завершающегося формированием ответа растения и подавлением развития возбудителя инфекции.

Ответ растения зависит от включения «защитных генов» и синтеза разнообразных веществ, которые определяют устойчивость растений к вирусам. Большую роль в формировании иммунитета к патогенам у растений играют сигнальные системы клеток. Веществами, участвующими в сигнальных системах, могут быть различные группы эндогенных фитогормонов (Grill Е., Himmelbach, 1998; Munnik et al., 1995; Тарчевский, 2000).

При проникновении инфекции в клетки растения происходит изменение баланса эндогенных фитогормонов. Регуляция гормонального баланса также может осуществляться светом разного спектрального состава (Ahmad, 1999; Kohler, 1985; Карначук и др., 1989; 1990). Кроме того, показана роль синего и красного света в регуляции различных реакций растений (Воскресенская, 1975; Протасова и др., 1981; Карначук, 1989; Ушакова и др., 1997; Тихомиров и др., 1991, 1999; Тищенко, 2000).

Одними из основных сигналов для растения являются спектральный свет и различные экологические факторы, в том числе и вирусы. Внешние сигналы могут передаваться на внутриклеточные структуры с помощью фитогормонов. Сущесвуют многочисленные данные о том, что эффекты света и гормонов в растениях могут перекрываться в регуляции различных реакций метаболизма растительной клетки. Фитогормоны могут инициировать реакции, запускаемые светом, и наоборот (Moore, 1979; Evans, 1985; Chory et al., 1994; Su, Howwell, 1995). Однако, связь между световыми сигналами и уровнем эндогенных фитогормонов мало изучена.

Существует предположение, что регуляторная роль света проявляется не только в контроле роста и развития растений, но и в защитных реакциях растений в ответ на проникновение вирусов (Шатило и др., 1997). Однако в современной литературе очень мало исследований посвящено изучению роли эндогенных фитогормонов, индуцируемых световыми сигналами разного спектрального состава в защитных реакциях на атаку патогенов.

Цель и задачи исследования. Для понимания взаимодействия световых сигналов внешней среды с эндогенными регуляторами в формировании устойчивости к патогенам была поставлена следующая цель:

Выяснить роль синего и красного света в регуляции роста, его влияние на титр вируса табачной мозаики (ВТМ) и баланс эндогенных фитогормонов в растениях томата, инфицированных ВТМ.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

Проанализировать особенности роста и содержания фотосинтетических пигментов, исходный уровень эндогенных фитогормонов в здоровых и зараженных растениях томата на белом свету.

Определить оптимальный вариант освещения для формирования устойчивости растений томата к ВТМ.

Исследовать влияние синего и красного света на рост, титр ВТМ и содержание эндогенных фитогормонов в растениях томата, контрастных по устойчивости.

Научная новизна. Полученные экспериментальные данные вносят вклад в развитие представлений об участии света - синего и красного в устойчивости растений к патогенам. Впервые показана возможность формирования индуцированной светом устойчивости растений томата. Это стало возможным благодаря использованию модели патосистемы «контрастные по устойчивости растения томата - ВТМ». Показано, что различные по восприимчивости зараженные растения томата неоднозначно реагируют на облучение светом

8 разных участков спектра - синим и красным. Наблюдается изменение титра ВТМ, уровня эндогенных фитогормонов, которые являются участниками сигнальных систем растений, что отражается в изменении ростовых реакций. Определена наиболее оптимальная экспозиция и продолжительность досвечивания спектральным светом растений томата для инициации процессов устойчивости. Продемонстрирована возможность участия цитокининов и абсцизовой кислоты в формировании устойчивости растений томата, при облучении монохроматическим светом.

Практическая значимость работы. Результаты данной работы позволяют разработать экологически чистую технологию профилактики растений закрытого грунта. Полученные результаты могут использоваться в учебном процессе при чтении курсов: «Иммунитет растений», «Физиология и биохимия больного растения».

Работа выполнена на кафедре физиологии и биотехнологии растений Томского государственного университета, при поддержке гранта №151 от 19. 01.2001г. по Федеральной Целевой Программе "Интеграция", направление 1.5. "Поддержка обучения и стажировок наиболее способных студентов и аспирантов в российских научных школах мирового уровня" и отдела защиты растений Главного ботанического сада им. Н.В. Цицина.

1.ФИЗИОЛОГО БИОХИМИЧЕСКАЯ ПРИРОДА ВИРУСНОГО

ПАТОГЕНЕЗА

1.1. Развитие представлений о вирусном патогенезе

Первое описание вирусной болезни у растений касалось пестролепестности тюльпанов, голландские художники начала XVII века на своих натюрмортах обычно изображали цветки зараженных тюльпанов.

Манером в 1886 году были описаны первые опыты по передаче вирусов растений, путем инъекций в жилки их листьев сока пораженных растений (Гиббс, Харрисон, 1978). В 1892 году Дмитрий Ивановский установил, что сок растений табака, пораженных описанной Майером болезнью, оставался инфекционным после того, как был профильтрован через бактериальный фильтр, хотя и не содержал бактерий. Позднее Мартин Бейеринк на основании собственных результатов и данных Ивановского заключил, что мозаику табака вызывает какой-то новый неизвестный инфекционный агент. При описании возбудителей, вызывающих эти болезни, Бейеринк использовал термин «вирус». По мере обнаружения все большего числа болезней такого рода, возбудителей стали называть «фильтрующимися» вирусами и в течение 50 лет вирусные болезни растений, животных и бактерий изучали независимо друг от друга. До 1930 года, большинство ученых расходились во мнениях, и существовала значительная путаница как в анализе болезней, вызываемых вирусами, так и относительно вопросов, касающихся самих вирусов (Альштейн, Быковский, 1982). Высокая концентрация некоторых вирусов в зараженных растениях и их относительная стабильность сыграли решающую роль на первых этапах выделения и изучения химических свойств вирусов. В настоящее время электронная микроскопия и рентгеноструктурный анализ являются основными методами, используемыми для исследования строения

10 вирусных частиц, хотя уровень знаний о репликации вирусов растений в клетке - хозяине значительно отстает от того, что известно о вирусах животных и бактерий (Zaitlin, 2000). Это обусловлено в основном техническими причинами. Так, до сих пор не удалось разработать систему из тканей растений, в которой все клетки могли бы быть инфицированы одновременно и последующие этапы репликации вирусов проявлялись бы более или менее синхронно (Raychaudhuru, 1966). Другой трудностью при работе с вирусами является крайне низкая эффективность существующей инокуляции клеток. Для многих вирусов, которые могут передаваться механической инокуляцией, требуется нанести на поверхность листа около 10 -10 вирусных частиц в расчете на одну клетку, чтобы добиться ее инфицирования. Было проведено много исследований по изучению влияния вирусной инфекции на такие процессы метаболизма растения хозяина, как дыхание и фотосинтез, а также на концентрацию различных встречающихся в норме метаболитов и. макромолекул (Aoki, Takebe, 1975; Koiwa, 1989; Boyko et al., 2000; Cohn, 2001).

Сейчас вирусология растений играет существенную роль в формировании понимания различных механизмов: системной приобретенной устойчивости, реакции сверхчувствительности, а также в развитии методов обнаружения патогенов (Zaitlin, 2000).

1.2. Молекулярно-генетические модели в исследованиях вирусного патогенеза

Изучение взаимодействия вируса с растением - хозяином может осуществляться с разных позиций, в том числе и с взаимопротивоположных. Фитовирусология изучает особенности строения, размножения и распространения фитовирусов. Иные задачи у физиолога растений, поскольку репродукция фитовирусов, развертывание генетической информации происходят не сами по себе, а в особой среде — внутри растительной клетки, которая представляет собой часть сложного растительного организма. Взаимодействие вирус - растение предстает как разнообразие взаимодействий, осуществляющихся на различных уровнях, начиная с молекулярного, клеточного и заканчивая уровнем целого растения и сообществ. Каждый аспект такого взаимодействия строго специфичен, и для его изучения необходимы самые различные методы и подходы, свои модели.

1.2.1. Модельные системы в фитовирусологии

Первое успешное заражение протопластов из незрелых плодов томата было осуществлено Cocking в 1965 году (Cocking Е.С, 1965). Изолированные протопласты в растворе плазмолитика представляют собой удобную для фитовирусологических исследований модель. При заражении вирусами легко обеспечить контакт каждого протопласта с вирусным инокулюмом по всей поверхности протопласта. Состав инокулюма, условия и продолжительность инокуляции, предварительная и последующая обработка — все это легко поддается учету и контролю. Изолированные протопласты, обеспечивая высокий процент заражения, имеют еще и то преимущество, что к делению более или менее одновременно переходит большое число недавно еще специализированных клеток, чем облегчается изучение влияния вирусного поражения на различные этапы дифференциации и дедифференциации клеток (Motoyoshi, 1971 ;Burketov, 1997)..

Вторая по сложности модельная система представлена широким спектром клеточных культур и тканей (Kassanis, 1967). Изучение особенностей взаимодействия вируса с растением в зависимости от состояния ядерного аппарата клетки проводили с использованием культур клеток и протопластов разной плоидности (Аветисов, 1976). Распространенную в настоящее время культуру апикальных меристем, используемую для оздоровления растений от

12 вирусов, применяют широко как модельную систему для изучения распределения вируса в зоне апекса, репродукции его там и защитных реакций, направленных на ограничение репродукции патогена, а также изучение механизма транспорта вирусной инфекции (Zaitlin, 2000).

Следующая по сложности модель, применяющаяся в фитовирусологии, -лист растения, а также само растение. Лист растения часто служит местом первичного инфицирования. Функционально лист служит органом ассимиляции и испарения, что находит отражение в различных опытах по проникновению вирусной инфекции, репродукции вируса и его распространения (Аветисов, 1976; Burketov, 1997).

Сложность растения, как модельной системы, определяется в первую очередь его строением, представляющей его системой органов с определенными взаимоотношениями между ними, иерархией взаимоподчинения, онтогенезом и зависимостью от среды. С применением растения в качестве модели в изучении взаимодействия вируса с хозяином открываются такие стороны процесса, как поведение инфекционного начала в системах дальнего и. ближнего Транспорта, зависимость распространения инфекции от аттрагирующей способности органов и конкретной временной роли в донор - акцепторных отношениях, значение отдельных защитных реакций растения в ограничении распространения вируса по растению (Журавлев, 1979).

1.2.2. Репродукция фитовирусов в модельных системах

Репродукция многих фагов и ряда вирусов животных заканчивается гибелью первично инфицированной клетки, в результате чего дочерние частицы освобождаются и участвуют в новых инфицированиях (Агол, 1975). В отличие от этой схемы в листьях пораженных растений выход инфекционного материала из первично зараженной клетки начинается задолго до окончания

13 репродукции вируса в ней. Поэтому в листьях растений уже в первые сутки после заражения существует разнообразие клеток, находящихся на разных стадиях болезни и зараженных как вирусом инокулюма, то есть первично инфицированных, так и зараженных вторично - инфекционным материалом из ранее зараженных клеток. Такое разнообразие клеток в листе поддерживается довольно долго, так как репродукция вируса в одной клетке может продолжаться несколько суток. В этих условиях практически не удается четко проследить ни циклов размножения, ни смены поколений (Mas, Beachy, 1999). Репродукция фитовирусов — сравнительно медленный процесс, где время «синтеза» одной частицы составляет 10—20 минут (Bourque et al., 1975). В зависимости от модели увеличение титра вируса происходит неодинаково. Очень быстро инфекционность накапливается в протопластах: после 4 — 6 часов лаг - фазы титр вируса быстро начинает увеличиваться и достигает максимума примерно через 48 часов после инокуляции. Показано, что для вируса табачной мозаики (ВТМ) лаг-фаза, связанная с проникновением вируса и депротеинизацией инфекционных вирусных рибонуклеиновых кислот, продолжается 4 часа в изолированных протопластах (Takebe, Otsuki, 1969), 6 — 8 часов в листьях и 10 часов в суспензионной культуре табака (Murakishi et al., 1971). Наиболее длительная лаг-фаза, предшествующая регистрируемому увеличению инфекционности, отмечена для инфекционного процесса в листьях. Вирусная рибонуклеиновая кислота (РНК) на очень ранних стадиях заражения ограничена пузырек - подобными структурами вокруг ядра (Mas, Beachy, 1998). Постепенное увеличение титра вируса, приводящее к тому, что кривая инфекционности выходит на плато только на восьмой или даже на десятый день после инокуляции, связано с вторичной инфекцией - переходом вируса от клетки к клетке. К моменту достижения плато кривой, заболеванием охвачено максимально возможное в этих условиях число клеток (Mas, Beachy, 1998). На ранних стадиях репликации вирусная РНК тесно ассоциирована с эндоплазматическим ретикулумом (Boyко et al., 2002).

Логарифмический характер роста инфекционности во второй фазе обусловливается увеличением числа инфекционных центров (Mas, Beachy, 1999). Для листьев этот процесс понимают как распространение вируса от клетки к клетке, что распространяется и на систему изолированных клеток. В опытах с листьями показано, что в фазе логарифмического роста начинается активный синтез вирусных одно - и двуспиральных РНК. Инфекционная вирусная РНК в этой фазе неинкапсидирована и чувствительна к РНКазе (Diener, 1962).

В третьей фазе, пропорционального роста титра вируса, продолжается накопление односпиральной вирусной РНК, но одновременно наблюдается активный синтез структурного белка и образование зрелых вирионов. Репликазный комплекс с вирусной РНК в этот момент тесно связан с микротрубочками и перемещается к периферии ядра (Boyko et al., 2000). В опытах с протопластами, в конце фазы свободная от оболочки вирусная РНК уже не обнаруживается (Aoki, Takebe, 1975).

Последняя фаза в репродукции вируса соответствует остановке репродукции, причем в клетках, которые зачастую имеют достаточное количество предшественников, необходимых для продолжения синтеза вирусных компонентов (Mas, Beachy, 1998).

При инфицировании протопластов вирусом табачной мозаики обычный выход вируса составляет 10⁶ — 10⁷ частиц-на инфицированный протопласт (Takebe,- Otsuki, 1975), Несмотря- на то, что накопление инфекционности в разных системах осуществляется с разной скоростью, конечный результат оказывается приблизительно одинаковым: цифры накопления вирусных частиц в инфицированных клетках - одного порядка для разных систем (Mas, Beachy, 1999). На последней стадии инфекционного процесса вирусная РНК также тесно связана с микротрубочками и эндоплазматическим ретикулумом, однако. пока неясно были ли эти ассоциации непосредственными или косвенными (Beachy, Heinlein, 2000).

1.3. Реакции растения иа внедрение патогена

В настоящее время одной из актуальных проблем современной экспериментальной биологии является изучение защитных и регуляторных функций у растений. Исследование этих вопросов дает возможность понимания природы патогенеза и устойчивости растений при действии вирусной инфекции.

1.3.1. Влияние патогена на энергетику фотосинтеза

Энергетический обмен является отражением биохимических процессов, происходящих в живых системах. Мобилизация защитных механизмов клетки при их инфицировании требует значительных энергетических затрат. Основные изменения физиологических и биохимических параметров в инфицированном устойчивом и восприимчивом растении протекают в диаметрально противоположных направлениях ряда показателей, характеризующих фотосинтез, дыхание и проницаемость мембран,

В устойчивых растениях происходит активирование фотосинтеза, фотофосфорилирования, электрон-транспортной цепи фотосинтеза, увеличение концентрации свободных радикалов и аденозинтрифосфорной кислоты в хлоропластах, активирование биосинтеза порфиринов (дегидратазы 5 -аминолевулиновой кислоты, сукцинил — КоА — синтетазы, оксидазы гликолевой кислоты), увеличение содержания хлорофилла и изменение его свойств, снижение активности хлорофиллазы, сохранение нативной структуры хлоропластов (за исключением некротизированных тканей), сохранение светоиндуцируемого сигнала эндоплазматического ретикулума в листовой ткани на уровне здорового растения, увеличение общего содержания липидов в хлоропластах, увеличение концентрации сульфгидрильных групп (Ладыгина и др., 1965, 1976; Ладыгина, Бабоша,1996; Цоглин и др., 1987).

Тогда как в восприимчивых растениях наблюдается обратная направленность всех процессов фотосинтеза. В работах Burketov было показано, что в инфицированных листьях, в дисках листьев и в протопластах увеличивалась активность фермента глюкоза- 6 -фосфат дегидрогеназы, и линейно коррелировала с накоплением ВТМ. Активность фермента рибулезобисфосфаткарбоксилазы снизилась в инфицированных листьях, по сравнению с контролем на 60 — 65% через десять дней после заражения (Burketov L., 1997).

Вирусная инфекция в восприимчивых растениях часто приводит к появлению желтой мозаичной крапчатости, что обусловлено влиянием на пигменты, то есть снижением содержания хлорофилла в листьях (Koiwa, 1989). В восприимчивых растениях происходит снижение количества хлорофилла и увеличение его извлекаемости петролейным эфиром, что свидетельствует о нарушениях структуры хлорофилл-белковых комплексов, снижается биосинтез зеленых пигментов и увеличивается активность гидролитической функции хлорофиллазы (Ладыгина, Тукеева, 1976).

В хлоропластах устойчивых видов содержание хлорофилла, напротив, увеличивается, а активность хлорофиллазы уменьшается. Для устойчивого растения характерно сохранение нативной структуры хлоропластов (за исключением некротизированных тканей), процессы патогенеза в восприимчивых растениях сопровождаются изменением структуры хлоропластов (разрыхление . мембран, увеличение крахмальных зерен) (Ладыгина, Балнокин, 1970). Также наблюдается подавление активности дегидратазы 5 - аминолевулиновой кислоты - фермента, катализирующего конденсацию двух молекул 5 - аминолевулиновой кислоты в молекулу порфобйлиногена - предшественника порфирина (Muhlback et al., 1977).

Известно, что развитие вирусного патогенеза тесно связано со структурой и функцией фотосинтетического аппарата растений. Показано, что под

17 влиянием вирусной инфекции происходит снижение фотосинтетической активности листьев, особенно в условиях повышенной освещенности, при пониженной освещенности падение фотосинтеза невелико и коррелирует с содержанием пигментов (Цоглин и др., 1987), Снижение содержания в листьях пораженного растения хлорофилла не во всех случаях приводит к соответствующему уменьшению интенсивности фотосинтеза, так как патоген еще вызывает подавление реакции Хилла и фотосинтетического фосфорилирования в хлоропластах неустойчивого вида и активирование этих процессов у устойчивых форм (Ладыгина и др., 1983). При заражении ВТМ устойчивых растений изменение содержания и свойств белков и липидов хлоропластов носит адаптивный характер, и мембраны не теряют своей целостности, в то время как у восприимчивых растений нарушается состав и строение мембран хлоропластов (Ладыгина, Гришкова, 1979). Это приводит к тому, что у устойчивого растения - хозяина ВТМ активирует фотоиндуцированное поглощение протонов и образование аденозинтрифосфорной кислоты, а у восприимчивого подавляет эти процессы (Ладыгина и др., 1979). Изменение в количестве и активности компонентов хлоропластов обычно наблюдается после периода репликации вируса. Вирусная инфекция также вносит существенные изменения в свойства клеточных органоидов. Эти изменения неидентичны у устойчивых и восприимчивых растений (Рубин и др., 1975). Вирусная инфекция вызывает вакуолизацию и уменьшение, разрушение пластид в инфицированных тканях. Наблюдалось уменьшение размеров, обесцвечивание и слипание хлоропластов, появление в них пузырьков и исчезновение ламелл стромы и гран. У неустойчивых растений наблюдалась дезинтеграция тилакоидной системы хлоропластов. А также подавление синтеза белка в хлоропластах и нарушение связей в хлорофилл-белковом комплексе пластид. Менее изучен вопрос о влиянии инфекции на содержание желтых пигментов листа. Показано, что

18 каротиноиды в меньшей степени подвержены разрушающему действию вирусной инфекции, чем хлорофилл (Цоглин и др., 1987).

Также происходит уменьшение содержания 68 S (хлоропластных) рибосом. Репродукция ВТМ в листьях тормозит синтез рибосомальной РНК хлоропластов и синтез цитоплазматической РНК. Исследование тканей устойчивого к ВТМ сорта томата, показали, что в ткани, окружающей некрозы, наблюдали увеличение содержания свободных, а также связанных с эндоплазматическим ретикулумом рибосом. Также изменяется нуклеотидный состав рибосомальной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Это приводит к тому, что у устойчивого растения — хозяина ВТМ активирует фотоиндуцированное поглощение протонов и образование АТФ, а у восприимчивого подавляет эти процессы (Ладыгина и др., 1979). О возможной энергетической связи репродукции ВТМ с хлоропластами свидетельствуют и данные электронно-микроскопических исследований, показывающие наличие вируса в матриксе пластид клеток табака (Бужоряну, 1986; Culver et al., 1991). Взаимодействие ВТМ с фотосинтетическим аппаратом растений имеет и обратную связь: не только патоген влияет на структуру и функции фотосинтетического аппарата, но и репродукция ВТМ энергетически зависит от интенсивности фотосинтеза. Считается, что немаловажное значение в этом процессе принадлежит нециклическому фотосинтетическому электронному транспорту, сопровождаемому синтезом аденозинтрифосфорной кислоты (Капо, 1985).

1.3.2. Влияние патогена на реакции, связанные с дыханием

Известно, что повышение интенсивности дыхания при инфицировании происходит как в устойчивых, так и в восприимчивых растениях. Однако заражение восприимчивого сорта сопровождается снижением интенсивности сопряженного с окислением фосфорилирования и, следовательно, снижением

19 показателя Р/О, то есть, происходит разобщение дыхания и фосфорилирования (Ладыгина и др., 1966). В устойчивом растении усиление дыхания сопровождается повышением его энергетической эффективности. Можно предполагать, что в восприимчивых тканях, в конечном счете, все сводится к тому, что клеточные ресурсы перестают расходоваться на нужды самой клетки и переключаются на синтез вирусных частиц, что приводит к деградации клеточных структур. . Результаты многолетних экспериментов Ладыгиной с соавт., показали, что процесс патогенеза во многом сходен с процессом старения (Ладыгина, Бабоша, 1996).

В восприимчивых растениях при их заражении происходит активирование дыхания, разобщенного с фосфорилированием (уменьшение окислительного и субстратного фосфорилирования), и снижение концентрации свободных радикалов и содержания аденозинтрифосфорной кислоты в митохондриях, также происходит снижение числа митохондрий, дезинтегративные изменения ультраструктуры, увеличение проницаемости мембран митохондрий, происходит угнетение пентозофосфатного и гликолатно - глиоксилатного пути, тогда как в устойчивых растениях эти процессы также имеют обратную направленность (Ладыгина и др., 1966, 1976, 1996). В устойчивых растениях происходит активирование пероксидазы и оксидаз (фенолоксидазы, аскорбинатоксидазы, цитохромоксидазы), уменьшение активности дегидрогеназ (Cohn et al., 2001). *

При инфекции увеличивается, как правило, интенсивность дыхания растений, иногда спустя всего несколько часов после инокуляции. Более сильная стимуляция дыхания происходит обычно незадолго до появления видимых симптомов заболевания. Усиление дыхания в листьях Nicotiana, на которых под влиянием ВТМ появляются местные некрозы, связано главным образом с разобщением дыхания и окислительного фосфорилирования (Мэтьюз, 1973). У восприимчивых растений инфекция вызывает активирование дегидрогеназ. В тканях устойчивых растений действие дегидрогеназ

20 ослабляется. Аналогия была показана и для цитохромоксидазы (Рубин и др., 1975). Когда на инокулированных ВТМ листьях появляются местные некрозы, верхние, неинокулиро ванные листья, становятся менее восприимчивы к инфекции. Развитие такой устойчивости коррелирует с активированием пероксидазы в верхних незараженных листьях. При проведении опытов с механической инокуляцией растений, также отмечалось возрастание активности рибонуклеаз, но вместе с тем механическое нарушение целостности клетки можно рассматривать как стрессовое, тогда как вирусное имеет более сложную природу воздействия на растительный организм. Не найдено коррелятивной связи между количеством некротических пятен, появляющихся на инокулированном листе и повышением активности пероксидазы в нем (Рубин и др., 1975; Мэтьюз, 1973). Однако, вопрос об участии пероксидазы в обменных процессах пораженных растений еще недостаточно изучен.

У неустойчивого вида табака вирусная инфекция вызывает нарушение специфических реакций митохондрий (конформационные изменения в ходе субстрат - и аденозинтрифосфорных — индуцированных циклов сокращения -набухания), увеличение проницаемости митохондриальных мембран, увеличение вымываемости аденозинтри фосфорной кислоты и других компонентов. В митохондриях устойчивого табака эти показатели остаются на уровне контроля, более того, количество митохондрий, а также число крист в них увеличивается. Ультраструктура митохондрий устойчивых растений не нарушалась, и их число возрастает, но матрикс митохондрий становится электронплотньш, а кристы разбухают и изменяют форму (Рубин и др., 1966).

Вероятно, повышение проницаемости мембран в восприимчивых растениях приводит к угнетению процессов запасания и использования энергии. Измерения количества аденозинтрифосфорной кислоты в основных энергетических центрах клетки' (митохондрии и хлоропласты) показали различную направленность изменений при инфицировании устойчивых и

21 восприимчивых растений: увеличение содержания аденозинтрифосфорной кислоты у первых и уменьшение у вторых (Ладыгина и др., 1965). Преобладание процессов распада биополимеров в неустойчивых сортах не позволяет успешно бороться с внедрившимся патогеном (Рубин, Ладыгина, 1976). Недостаток макроэргических соединений и некоторых пластических веществ снижает активность в клетках биосинтетических процессов, необходимых для обновления внутриклеточных структур и образования защитных барьеров на пути патогена (Ладыгина, Бабоша, 1996). Состояние белковых комплексов и липидов энергетических центров клетки также определяют устойчивость растений к фитопатогенам. При инфицировании происходят специфические для устойчивых и неустойчивых растений количественные и качественные ₄ изменения белковых фракций митохондрий. Выделенные белки обладали высокой антивирусной активностью (Ладыгина и др., 1977).

Существенные изменения претерпевает углеводный обмен растений в случае вирусных заболеваний. При системном поражении растения ВТМ снижение фотосинтетической активности приводит к уменьшению общего количества углеводов. При локальных повреждениях на листьях томата, непосредственно поврежденные места не содержат крахмала и не адсорбируют радиоактивную глюкозу. Но вокруг повреждений можно наблюдать скопление радиоактивности и отложения крахмала (Рубин, Ладыгина, 1976).

1.3.3. Реакции на внедрение патогена, связанные с белками растения

В инфицированных растениях в зависимости от устойчивости наблюдаются специфические количественные и качественные изменения различных белковых фракций как, например: изменение проницаемости плазмалеммы и вязкости протоплазмы, специфические количественные изменения разных типов гистонов, изменение содержания белка (структурного

22 и каталитически активного), увеличение активности лектинов, образование интерферонподобных белков, сохранение активности протеиназ на уровне здоровых растений.

Одной из характерных сторон изменений при вирусном патогенезе восприимчивых растений, является увеличение проницаемости пограничных слоев протоплазмы, выражающееся в увеличении экзоосмоса неорганических солей и органических соединений из клеток. Было показано, что вымываемость органических веществ из больных растений возрастает в сотни раз (Рассел, 1981). Особенно больших величин достигает патологическое выделение листьями томата ионов металлов. Сила воздействия ВТМ на проницаемость протоплазмы определяется устойчивостью растений. У восприимчивых сортов проницаемость протоплазмы клеток повышается, тогда как у устойчивых сортов этот показатель не изменялся. Возрастание проницаемости пограничных слоев протоплазмы приводит к тому, что ряд веществ, выделяемых клетками, попадает в транспирационный ток, чем нарушается осмотическое давление и тургор клеток. Инфекция вызывает также изменение гидрофильных свойств коллоидов протоплазмы. Степень гидрофильности коллоидов восприимчивых сортов резко снижается, одновременно падает вязкость и эластичность протоплазмы, уменьшается водоудерживающая" способность тканей растения (Рубин и др., 1975).

Специфические для устойчивых и восприимчивых растений изменения наблюдали при исследовании ряда белков растений, в частности, в случае гистонов было показано изменение соотношения различных фракций (Ладыгина и др., 1977). Способность этих белков ингибировать индуцированное вирусной инфекцией образование некрозов на листьях индикаторных растений позволяет предположить их участие в регуляции антиинфекционных реакций (Hutheson, 1998; Cohn et al., 2001).

Антивирусные белки растений являются одним из важнейших компонентов системы защиты растительного организма от патогенов.

23 Некоторые из них могут быть обнаружены в интактном растении, другие образуются в ответ на внедрение патогена (Ingram, 1973). В 1963 году Loebenstein было высказано предположение о роли интерферонподобных белков в' защитных реакциях высших растений (Loebenstein G., 1963), Антивирусное действие интерферона в растительном организме, вероятно, свидетельствует о существовании у растений компетентных структур, осуществляющих функции включения интерферонподобного защитного механизма (Огарков и др., 1984). .

В настоящее время обнаружено множество индуцируемых вирусной инфекцией антивирусных белков растений. Наиболее изученным из них является антивирусный фактор (АВФ), выделенный из листьев табака, индуцируемый ВТМ. Наиболее активная фракция АВФ представлена гомогенным белком с молекулярной массой 21-22 к Д. Испытание свойств этого соединения показало, что для защиты от системного инфицирования достаточно одной молекулы белка на клетку растения (Sela, 1986). Различные по вирулентности изоляты ВТМ обладали различной способностью индуцировать АВФ. В растениях томата Chadha и MacNeil обнаружили антивирусный белок, индукция которого осуществлялась ВТМ через 2 — 28 суток после заражения (Chadha К.С., MacNeil B.N., 1969).

Механизм действия АВФ из листьев табака обнаруживает сходство с процессами, индуцируемыми интерфероном в клетках животных. Обработка растений табака АВФ или интерфероном (а также инфицирование ВТМ) активирует фермент, аналогичный олигоаденилатсинтетазе (ОАС) животных, что приводит к синтезу веществ, сходных с 2,5 — олигоаденилатами и обладающих антивирусной активностью. Подобно 2,5 А - олигоаденилаты растительного происхождения, ингибируют синтез белка в бесклеточной системе, однако они отличаются по: структуре (Sher et al., 1990). Исследования роли ОАС в защитных реакциях растений картофеля и табака показали, что инокуляция вирусом скручивания иммунного сорта картофеля приводит к

24 индукции активности ОАС. При этом ответ в случае иммунитета не уступает реакции сверхчувствительных растений (Nicotiana glutinosa — ВТМ). Эффективным индуктором активности фермента является также синтетическая двуспиральная РНК (poly I - poly С). Индукция ОАС происходит на ранних этапах после инокуляции, и уже через 24 часа достигает максимальных значений (Бабоша и др., 1990). Это свидетельствует об уникальности функционирования интерферонподобного механизма в растениях, различающихся по устойчивости (восприимчивость, сверхчувствительность, иммунитет).

Как известно, индукция вирусами образования антивирусных белков происходит как в сверхчувствительных, так и в иммунных растениях, и в процессе системной инфекции (Sela, 1986, Chadha, MacNeil, 1969; Modderman et al., 1985). По мнению Sela, образование защитных белков происходит при ^ любом заражении, однако время его проявления и уровень активности влияют на то, будет ли это заражение системным или локализованным (Sela I., 1986). Ограниченная репродукция вируса происходит даже в первично инфицированных клетках крайне устойчивых (иммунных) растений (Gat — Edelbaum et al., 1983). При этом сигнал к мобилизации защитных реакций клетки передается по цепочке: двуспиральная вирусная РНК -интерфёронподобные белки - олигоаденилаты (2-5 А): Каждое из этих соединений индуцирует устойчивость, как при экзогенной обработке, так и при их синтезе в растительной клетке. Вероятно, в устойчивом растении включение интерферонподобного механизма происходит в более ранние сроки или его регулирующие защитные реакции действие более успешно противостоит агрессии патогена (Соколов, 1986). Нарушения защитного механизма могут иметь место на более поздних этапах процесса, начальными стадиями которого являются образование интерферона и синтез олигоаденилатов (Sela I., 1986; 4 Deng, 1994).

В регуляции метаболизма растений большую роль играют фитогормоны. Исследование молекулярных механизмов ответных реакций растений на действие биогенных и абиогенных стрессоров позволило установить, что частью этих реакций является значительное повышение стрессовых фитогормонов - жасмоновой, салициловой и абсцизовой кислот, происходящее вследствие активации или индукции синтеза ферментов, катализирующих их образование. Также синтез защитных белков может индуцироваться стрессовыми фитогормонами (Тарчевский и др., 2001). Известно, что при инфицировании вирусами происходят изменения в скорости роста растений и содержании фитогормонов (Малиновский, 1981). В темно-зеленых участках мозаичных листьев табака, инфицированного ВТМ, уменьшается концентрация зеатина и увеличивается концентрация его гликозидов (Whenham et al., 1936). Аналогичные изменения соотношения различных форм цитокининов вызывает обработка абсцизовой кислотой. Принимая во внимание более высокую вирусоустоичивость темно-зеленых участков листьев инфицированного табака, можно предположить активное участие фитогормонов в механизме противовирусной защиты. Действие цитокинина вызывает образование связанных с патогенезом белков (PR — белки), предполагаемые функции которых связаны с защитой растений от биотических и абиотических стрессов (Metelink et al., 1987).

Показано стимулирующее влияние цитокининов на формирование мембранных систем хлоропластов in vitro (Шатило и др., 1988). В то же время в ряде работ есть указание на то, что экзогенные цитокинины способны подавлять репродукцию ВТМ (Реунов и др., 1977). Вирусный патогенез может индуцировать изменение содержания эндогенных цитокининов и соотношения свободных и связанных форм. Устойчивые к ВТМ растения томата содержат на два порядка больше изопентениладенина, чем восприимчивые. Вирусный патогенез у восприимчивых форм сопровождается увеличением содержания общего пула цитокининов (Шатило и др., 1997). Содержание экзогенных

26 цитокининов также может влиять на течение вирусного патогенеза.

Так, экзогенный кинетин в концентрации 10 мг/л снижает репродукцию X-вируса картофеля в отделенных листьях дурмана (Лапшина, Реунов, 1993). Изменение активности цитокининов после вирусной инфекции в растениях табака было показано несколькими группами ученых. Kuriger и Tavantis с соавт., показали, что вирусная инфекция ведет к уменьшению цитокининовой активности (Kuriger W!E., Agrios G.N., 1977; Tavantzis S.M. et al., 1979). Кроме того, Sano и Ohashi показали, что развитие приобретенной системной устойчивости совпадает с увеличением содержания зеатина и зеатинрибозида в устойчивых листьях (Sano К, Ohashi Y.,1995). В настоящее время известно, что увеличение цитокининов является существенным для развития вирусной устойчивости (Sano Н. et al., 1996). В трансгенных растениях табака повышенный уровень эндогенных цитокининов приводил к увеличению содержания системного индуктора защитных генов салициловой кислоты и индуцируемых ею PR — . белков, что сопровождалось возрастанием устойчивости к ВТМІ В работе Clarke было показано, что в результате инфекции растений бобов вирусом мозаики белого клевера, синтез свободных форм цитокининов, рибозидов и О-гликозидов отклонился в сторону производства нуклеотидов и 9-гликозидов, причем появление 9-гликозидов было одним из главных последствий вирусной инфекции. Зеатин-9-гликозид и дигидро-зеатин-9-гликозид не были ранее обнаружены в бобах. В здоровых растениях наблюдались лишь остаточные явления 9-гликозидов (Clarke S.F. et al., 1999).

Многочисленные данные, полученные с использованием различных вирусов и растений - хозяев, не.позволяют однозначно предполагать, что эндогенные фитогормоны других групп связаны с вирусоустойчивостью растений. Например, под влиянием вирусной инфекции, определяемая в экстрактах из листьев активность ауксинов снижается. Именно такой эффект вызывает, например, ВТМ у растений томата и табака (Pavillard, 1952). В ' - 27 . присутствии гибберелловой кислоты эффект подавления роста, вызываемый вирусом гравировки у табака и вирусом раневых опухолей у клевера, частично снимается (Maramorosch, 1957). Много позже, в работе Clarke было показано, что абсцизовая, индолилуксусная и гибберелловая кислота не влияют на вирусную репликацию в растениях бобов, тогда как обработка салициловой, жасмоновой кислотами и дигидрозеатином приводили к ее ингибированию, а также к образованию PR — белков (Clarke et al., 1998).

Также, во многих работах была показана роль жасмоновой и салициловой кислот, как индукторов системной устойчивости, растений (Murphy et al., 2000;Cohn et al., 2001). Так, например, в инфицированных вирусом картофеля, всходах Solanum tuberosum L. эндогенная концентрация жасмоновой кислоты была намного выше в корнях, чем в корнях здоровых растений (Petrovi et al.,1997). Повышенное содержание салициловой кислоты коррелирует с системной приобретенной устойчивостью на растениях картофеля, пораженных Phytophthora infestans (Myoung, Currier, 1996). Обработка табака салициловой кислотой задержала начало проявления болезни, вызываемой Botrytis cinerea, а также индуцировала развитие некротических пятен, характерных для сверхчувствительного ответа растений. Межклеточная жидкость обработанных растений табака ингибировала рост этого патогена in vitro (Murphy et al., 2000).

Также, помимо других групп фитогормонов, этилен вовлекается в ответы растения на атаку патогенов. Этилен может вызывать возрастание уровня м -РНК для генов, связанных с устойчивостью, включая гены PR — белков хальконсинтазы, основной хитиназы и гидроксипролин богатого гликопротеина (Ескег, 1995). Таким образом, было показано, что не все группы фитогормонов вовлечены в индукцию защитных реакций растений.

1.4. Транспорт вирусной инфекции по растению

При заражении растений вирус первоначально проникает в незначительное число так называемых первично-инфицированных клеток. Дальнейшие этапы развития инфекции протекают по-разному в чувствительных (восприимчивых) и устойчивых (резистентных) растениях. В чувствительном растении вирусный генетический материал из первично-инфицированных клеток перемещается по плазмодесмам в соседние здоровые клетки в пределах инфицированного листа (ближний транспорт) и по сосудистой системе стебля на большие расстояния (дальний транспорт) (Atabekov, Dorokhov, 1984; Hull, 1989). Во многих видах устойчивых растений репродукция вируса ограничивается первично-инфицированными клетками, за пределы которых вирусная инфекция не распространяется, то есть наблюдается блок транспорта вирусной инфекции. В таких растениях инфекция протекает бессимптомно. Этот пример свидетельствует о тесной взаимосвязи между процессами транспорта вирусной инфекции и устойчивостью растений к вирусам.

В последние годы во многих работах было показано:

1. Что вирионы зрелого вируса не во всех случаях являются транспортной формой вируса (Bosch,- Jockusch, 1972; Nishiguchi et al., 1978). У BTM эту роль играют, по-видимому, вирусоспецифические информосомо-подобные рибонуклеопротеиды (в РНП) (Atabekov, Dorokhov, 1984; Gillespie et al., 2002).

2. Выделение температурочувствительных мутантов вируса позволило рассматривать транспорт как процесс, кодируемый вирусом, в котором участвует так называемый транспортный белок (30 К) (Ohno et al.,1983; Meshi et al., 1989; Beachy et al., 2000; Hirashima et al., 2001).

3. Системное распространение вирусной инфекции требует выражения не только вирусного генома, но и генома хозяина. Это предполагает, что

29 взаимодействие вирусного транспортного белка и клеточных факторов определяет, произойдет ли межклеточный транспорт инфекции или он будет блокирован.

1.4.1. Транспортная форма-вирусной инфекции

В качестве возможных кандидатов на роль транспортной формы (то есть структуры, содержащей вирусный генетический материал и осуществляющей перенос из клетки в клетку), долгое время рассматривали зрелые вирионы (De Zoeten, Gaard, 1969), свободные вирусные РНК или репликативный комплекс, связанный с клеточными мембранами (De Zoeten, 1981; Citovsky, 1990; Carrington, 1996). Получены данные, что зрелый вирион не является, по крайней мере, облигатной транспортной формой (Dorokhov et al., 1983). Присутствие вирионов в первично-инфицированных клетках не может обеспечить транспорт инфекции в соседние здоровые клетки. Этот вывод следует из результатов опытов с ВТМ температурным мутантом при непермиссивной температуре (Nishiguchi et al., 1978).

Транспорт инфекции - это ранняя функция и осуществляется не после, а до образования зрелых вирионов. Это доказывается экспериментами по определению скорости распространения инфекции ВТМ из эпидермиса листа в подлежащий мезофилл. Эпидермальные клетки приобретают способность инфицировать мезофилл за 3 часа до появления зрелых вирусных частиц в эпидермисе (Мэтьюз, 1973). Также дефектные мутанты ВТМ, неспособные к образованию зрелых вирионов, тем не менее, распространяются от клетки к клетке и вызывают на инокулированных листьях соответствующие типу реакции растения -хозяина симптомы (Zaitlin, Keswani, 1964), поскольку белок оболочки необязателен для транспорта инфекции из клетки в клетку, хотя весьма существенен при транспорте на большие расстояния.

Установлено (Dorokhov et al., 1983), что клетки растений, инфицированных температурочувствительным мутантом, дефектным по белку оболочки Nil 18, при непермиссивной температуре, содержат новый тип рибонуклеопротеид (РНП), отличающихся от вирионов по структуре и плавучей плотности. Эти РНП содержат геномную и субгеномные РНК ВТМ, а также ВТМ — специфические и клеточные белки. Эти структуры получили название вирусоспецифических информосомо — подобных рибонуклеопротеид (в РНП) (Dorokhov et al, 1999).' Прямое доказательство участия в РНП в транспорте вирусной инфекции было получено при использовании системы дифференциальной температурной обработки (Dorokhov et al., 1981).

Большое значение в идентификации и понимании функции транспортной формы вируса имеют исследования роли вирусного белка оболочки в транспорте вирусной инфекции. Известно, что в составе в РНП содержится несколько белков и основной среди них - белок оболочки, который, по-видимому, защищает вирусную РНК в составе в РНП от действия нуклеаз. У мутантов ВТМ, дефектных по белку оболочки, системное распространение вирусной инфекции на.большие расстояния подавлено. Это соответствует тому факту, что отсутствие белка оболочки в составе в РНП делает его нестабильным и чувствительным к РНКазам (Dorokhov et al., 1983).

Для того, чтобы исследовать взаимосвязь между способностью формировать вирусные частицы и транспортом инфекции на большие расстояния, Сайто с соавт. сконструировали мутант ВТМ, который может синтезировать нормальный белок оболочки, но не способен образовать вирусные частицы из-за искусственно введенных мутаций в участок инициации сборки вируса (Saito Т. et al., 1988). Оказалось, что потомство мутантной РНК и белок оболочки накапливаются- только в- инокулированных листьях. В системных (неинокулированных) листьях накопление этих продуктов снижено более чем в 10 раз по сравнению с ВТМ дикого типа (Saito Т. et al., 1988).

31 Самая распространенная на. настоящее время модель движения вируса табачной мозаики представляет собой развернутый и удлиненный комплекс рибонуклеопротеида, размер и строение которого совместимы с плазмодесмами, а клеточные компоненты, включающие в себя эндоплазматический ретикулум и микротрубочки служат для подведения в РНП к плазмодесмам соседних клеток (Citovsky, 1990; Carrington, 1996; Beachy, Heinlein, 2000; Hirashima, Watanabe, 2001; Gillespie et al., 2002).

1.4.2. Транспорт вируса в пределах листа

Механизм движения вирусов из клетки в клетку долгое время был предметом интенсивного изучения (Citovsky, 1990; Carrington, 1996; Beachy, Heinlein, 2000; Hirashima, Watanabe, 2001; Gillespie etal., 2002).

Распространение вирусной инфекции из клетки в клетку осуществляется щ с помощью плазмодесм, диаметр плазмодесм, как известно сильно варьирует (Boyko et al., 2000; Gillespie et al., 2002). Скорость транспорта вируса в мезофилле определяется числом плазмодесм. Во время инфицирования вирусом растения наблюдается модификация плазмодесм, которая может препятствовать распространению вирусной инфекции; плазмолиз листовой ткани, сопровождающийся разрывом плазмодесм и отслоением плазмалеммы от клеточной стенки, приводит к подавлению вирусной инфекции (Robards, * 1975; Citovsky, 1990; Beachy, Heinlein, 2000). Скорость распространения от клетки к клетке может значительно варьировать в зависимости от типа клеток и от направления, в котором вирус перемещается по листу.

Геномная РНК ВТМ кодирует три неструктурных белка (126 К, 183 К, 30 К), а также белок оболочки (17,4 К) (Goelet et al., 1982; Citovsky, 1990; Hirashima, Watanabe, 2001). Исследование кинетики синтеза 30 К белка в ^ инфицированных ВТМ протопластах и интактных листьях, показало, что 30 К белок и его субгеномная РНК синтезируется только на ранней стадии инфекции

32 в протопластах, и появляются через два часа после начала инфекции, а исчезают через семь часов (Watanabe et al., 1984). Причем синтез 30 К белка происходит до появления значительного числа вирионов. Другие вирусные неструктурные белки, а также белок оболочки синтезируются на протяжении всего инфекционного цикла, что свидетельствует о том, что выражение гена 30 К белка контролируется механизмом, отличным от контроля синтеза других вирусных частиц (Allan et al., 2001). Окончательное доказательство роли 30 К белка в транспорте вирусной инфекции, было получено в экспериментах с трансгенным табаком, содержащим в своем геноме экспрессируемый ген 30К-белка (Holt, Beachy, 1991; Gillespi et al., 2002). Как было показано в работе Gillespie с соавт., 30 К белок взаимодействует с микротрубочками клетки, однако транспорт вирусного генома между растительными клетками по плазмодесмам может происходить независимо от микротрубочек ioieTKH(Gillespie Т. et al., 2002).

Атабеков и Дорохов предложили два механизма действия транспортного белка ВТМ: а) подавление - модификация защитных реакций растения-хозяина и в) модификация плазмодесм, делающая их открытыми для транспорта вирусного генетического материала. Накопленные к настоящему времени данные свидетельствуют в пользу, как первого, так и второго механизма (Atabekov, Dorokhov, 1994). Первый механизм, предполагающий подавление и модификацию системы защиты и, следовательно, воздействие на ядерный геном растения - хозяина подтверждается локализацией 30 К белка в ядерной фракции изолированных протопластов (Watanabe et al., 1986; Citovsky, 1990). В пользу второго механизма, предполагающего модификацию плазмодесм, говорит обнаружение 30 К белка в плазмодесмах листьев, а также эксперименты Веша с соавт., которые свидетельствуют о прямой корреляции между присутствием ЗОК-белка в клеточной стенке и транспортной функцией этого белка (Berna et al., 1991). Однако второй механизм действия транспортного белка ВТМ не может объяснить следующее: 30 К белок

33 накапливается в клеточной стенке преимущественно старых листьев, где транспорт вирусной инфекции замедлен; N - ген, отвечающий за гиперчувствительную реакцию у табака, модифицирует способность 30 К белка влиять на плазмодесмы; повышение молекулярного размера плазмодесм в трансгенных по 30 К белку растениях до 2,4 — 3,1 нм не может объяснить транспорт даже свободной РНК с молекулярными размерами около 10 нм . * * * (Гиббс, Харрисон, 1978).

Три гена - Тм1, Тм2, и его аллель Тм2 сообщают томатам устойчивость к ВТМ (Watanabe et al, 1987). В отличие от устойчивости Тм1, устойчивость, сообщаемая геном Тм2 или Тм2², проявляется только в целых листьях, так как в таких растениях блокирован транспорт вирусной инфекции. Исследование механизма блока транспорта вирусной инфекции показало, что введение в 30 К белок ВТМ аминокислотных замен позволяет ВТМ преодолевать устойчивость Тм 2 (Meshi et al., 1989).

Для объяснения полученных результатов высказано несколько предположений. Фактор устойчивости растений - есть измененная форма клеточного компонента, который в норме требуется для транспорта вирусной инфекции. Введение мутаций в транспортный белок восстанавливает нормальное взаимодействие между клеточным фактором и транспортным белком и, следовательно, транспорт. Отсюда,-фактор устойчивости не связан с проявлением транспортной функции и синтезируется единственно для # подавления функции вирусного транспортного белка (Atabekov, Dorokhov, 1994). * Дороховым и соавт., было показано, что распространенные растительные ферменты, ассоциированные с клеточной стенкой - пектин метилэстераза Nicotiana специфически связывается с транспортным белком, кодируемым ВТМ (Dorokhov et al., 1999). Комплекс транспортные белки - РНК, достигая *S плазмолеммы, связываются с хозяйским фактором, которым в табаке служит белок 38 К, который в свою очередь фосфорилирует транспортные белки в их карбокситерминальной области.

Однако, непонятно, для разных вирусов существует только один общий рецептор связывания или несколько, и как много белков вовлечены в связывание транспортных белков ВТМ. Молекулярные механизмы, вовлеченные в локализацию транспортных белков в клеточной стенке, увеличивающие проницаемость плазмодесмы и межклеточная транслокация ВТМ генома еще плохо изучены.

1.4.3. Транспорт вирусной инфекции на большие расстояния

Показано, что транспорт вирусной инфекции на большие расстояния осуществляется по флоэме. Впервые возможность быстрого перемещения ВТМ продемонстрировал Samuel G.,1934 на томатах (Bennett, 1940). Он показал, что при заражении верхушечного листа, вирус сначала перемещался по направлению к корням, а затем к молодым листьям. Направление движения вируса по растению можно произвольно * контролировать, влияя на ток метаболитов, особенно, углеводов во флоэме. Если вирус проник во флоэму, то продвижение его по растению оказывается иногда очень быстрым. Скорость перемещения ВТМ достигает от 1,5 до 8 см/ч (Bennett, 1940). Возможно, что такие высокие скорости передвижения вируса по флоэме могут быть * обусловлены строгой направленностью тока протоплазмы в ситовидных трубках.

При некоторых обстоятельствах вирусы могут двигаться и по ксилеме. Shneider, Worley показали, что при прививке растений фасоли, системно инфицированных вирусом южной мозаики- фасоли, на фасоль, в которой возможно только локальное размножение вируса, вирус способен перемещаться *f как вверх, так и вниз по ксилеме. Точно также инъекция вируса в ксилему

35 фасоли, для которой нормальной была некротическая реакция на вирус, приводила ее к системному заражению (Shneider I.R., Worley J.F., 1959).

Изложенное выше свидетельствует о том, что транспорт вирусной инфекции нуждается в выражении двух геномов - вируса и растения-хозяина (Atabekov, Dorokhov, 1984).

2. ДЕЙСТВИЕ СВЕТА РАЗЛИЧНОГО СПЕКТРАЛЬНОГО СОСТАВА НА

РАСТЕНИЯ

2.1. Реакции растений на свет и фоторецепторы

Рост и развитие растения зависит, прежде всего, от света, от его качественного и количественного состава. Свет выступает в качестве индуктора основных механизмов эндогенного регулирования растений (Воскресенская, 1975; Карначук, 1989; Кефели, 1991; Kendrick, Kronenberg, 1994).

Растения реагируют на свет через фоторецепторы, которые состоят из поглощающего свет пигмента (хромофора),, связанного с молекулой белка-эффектора (апопротеина). Поглощение света хромофором вызывает пространственное изменение в апопротеине рецептора, которое передается следующим сигнальным молекулам, что приводит к изменению мембранной проницаемости, экспрессии генов и т.п. и в конечном итоге - к физиологическому ответу растения (Кефели, 1975; Ahmad, 1999).

В настоящее время считают, что в растениях все разнообразные ответы на свет опосредованы следующими типами фоторецепторов (Casal , 2000). Это пять фитохромов (phy А — phy Е), которые поглощают в красной / дальней -красной области видимого спектра (длины волн 600-800 нм) (Furuya, 1993; Quail, 1998), фоторецепторы, поглощающие УФ-А / синий свет (350-500 нм), известные как криптохромы (cry 1, cry 2) (Ahmad, Cashmore, 1996), фототропин (nph 1- nonphototropic hypocotyl 1), а также специфические фоторецепторы, поглощающие в области УФ-В (280-320 нм), но природа этих молекул не известна (Jenkins et al., 1995).

Данные о структуре, функциях,' взаимодействии различных фоторецепторов растений позволяют сделать следующие выводы:

1) Все ответы растения на свет опосредованы несколькими типами фоторецепторов, в основном фитохромами и криптохромами (Casal et al., 2000).

Фоторецепторы в растениях представлены различными семействами гомологов, которые могут реагировать на свет аналогичным образом (Ahmad, 1999; Maloofetal., 2000).

Неоднозначность ответов растения может быть результатом различной локализации рецепторов, их доступности и взаимодействии между собой (Maloof et al., 2000; Casal et al., 2000).

Фитохромы - семейство бифункциональных фоторецепторов, с двумя структурными доменами, N - область фотосенсорная (70 кД) и С -регуляторный домен (55 кД) (Park et al., 2000). Хромопротеид, представленный линейным тетрапиррольным хромофором и полипептидом 120-130 кД, существует в двух фотовзаимозаменяемых формах, ответственных за восприятие (Pr - Red-absorbing) красного (КС, X = 660 нм) и (Pfr — Far-red-absorbing) дальнего красного света (ДКС, X = 730 нм) (Maloof et al, 2000). Фитохром синтезируется в Рг форме (Batschauer, 1998). Все пять фитохромов (phy А — phy Е - phytochrom) кодируются различными генами, что было показано на модельном объекте Arabidopsis thaliana (Clack et al., 1994; Park et al., 2000). Для перехода из одной формы в другую достаточно освещения светом низкой интенсивности КС_У что приводит к переходу из неактивной формы Рг в активную Pfr, которая вызывает фотоморфогенез. Хотя, некоторые исследования показали, что Рг также может иметь физиологическую функцию (Lin, 2000). Обратный переход из Pfr в Рг происходит в темноте или при облучении ДКС (Casal et al., 2000). Хотя обе формы фитохрома имеют различные спектральные диапазоны поглощения света, они все-таки перекрываются. Из-за этого перекрытия, фоторавновесие Pr/Pfr зависит от длины волны и составляет приблизительно 80 % КС, 3 %, 40 % синего света (X = 450 нм). Таким образом, синий свет (и UV-A) весьма эффективен в фотопреобразованиии Рг, что иногда приводит к затруднениям в различении

38 ' ответов; вызываемых фитохромам'и и специфическими сине-легкими рецепторами, или их совместным действием (Jones, Edgerton, 1994). Была проанализирована локализация фитохромов. Несмотря на несколько сообщений о мембраносвязанных фитохромах (Sineshchekov, 1994), большинством исследований показано, что фитохромы - растворимые в цитоплазме белки (Quial, 1998). Однако, в работе Sakamoto и Nagatani, была показана, регулируемая светом, ядерная локализация фитохрома (phy В) (Sakamoto К., Nagatani А., 1996). Помимо других отличий, локализация фитохромов в разных компартментах клетки и обуславливает их различные ответы. Результатами работы Nagy с соавт., было показано, что - в этиолированных растениях и адаптированных к темноте фитохромы phy А, В локализованы в цитоплазме. Ядерный транспорт светозависим и ДКС более эффективен в отношении phy А, чем phy В (Nagy F. et al., 2000). Однако первичные механизмы действия фитохрома в настоящее время до конца не выявлены и до сих пор являются спорными (Fankhauser, 2000).

Фитохром в низших растениях обладает киназной активностью. В некоторых исследованиях было показано, что С - концевой домен фитохрома мха Ceratodon purpureus действует как серин-треониновая и тирозин о вая протеинкиназа, которая регулируется светом.(Trummler et al., 1995). Поэтому предположили, что в высших растениях фитохромы тоже обладают киназной активностью (Fankhauser, 2000).

Одной из первых реакций, индуцируемой КС, является возрастание концентрации Са"*"¹" в цитоплазме растительных клеток, при участии фитохрома. Никтинастические движения листьев контролируются фитохромом через регуляцию мембранного транспорта Са** и его уровня в цитоплазме. На уровне клеток фитохром регулирует некоторые быстрые процессы: движения устьиц, хлоропластов, настии, уровень мембранного электрического потенциала и проницаемость мембран, и более медленные: .синтез пигментов — хлорофиллов и каротиноидов, синтез de novo ферментов и гормонов (гиббереллинов и

39 цитокининов, возможно и ауксинов (Casal, 2000). Фитохром также стимулирует прорастание семян, рост листьев, растяжение междоузлий, переход к цветению и другие эффекты. Также имеются некоторые данные об участии фитохромов в регуляции дыхания и окислительного фосфорилирования (Batschauer, 1998).

Как было сказано выше, классическим примером фитохромного ответа является его реверсивность (активация КС и подавление ДКС). Существуют и другие виды фитохромных ответов. Например, при облучении КС низкой интенсивности, сохраняется соотношение Pr/Pfr, но реверсии при облучении ДКС не происходит, такой вид ответа был назван ответом с низкой интенсивностью облучения (very - low - fluence response - VLFR), при облучении же непрерывным КС высокой интенсивности, также не происходит » * - * фотореверсии при последующем облучении ДКС, такой вид фитохромного ответа был назван ответом с высокой интенсивностью падающего излучения ** (high - irradiance response - HIR) (Casal, 2000).

Дальнейшие исследования по фитохромам позволили определить индивидуальные фитохромные ответы. Так, например, Shinomura с соавт., было показано, что phy А проявляет физиологическую реакцию под воздействием

ДКС высокой интенсивности (HIR), а в опытах Hamazato с соавт., было показано, что phy В отвечает на КС — HIR (Hamazato F. et al., 1997). Тогда как мутанты no phy А и phy В отвечают на воздействие КС и ДКС из-за

Ц' присутствия phy С-Е. В некоторых исследованиях показана роль phy С в КС — зависимом росте листьев растений, а также КС-ингибировании удлинения гипокотиля. Мутанты же по phy D дефектны в ответе на КС, особенно если дополнительно присутствует мутация по phy В. Роль phy Е в физиологических ответах пока не выявлена (Casal, 2000).

В настоящее время между фитохромами phy А и phy В выявлено два типа ^ взаимодействий по отношению к КС и ДКС: синергизм и антагонизм. В экспериментах Hennig с соавт., было показано, что при непрерывном облучении

40 ДКС с последующим облучением импульсом КС ингибировало деэтиолирование гипокотиля Arabidopsis дикого типа и стимулировало деэтиоляцию мутантов как по phy А, так и по phy В, что говорит об их синергетическом взаимодействии (Hennig L. et al., 1999).

Учитывая различия в ответах индивидуальных фитохромов, можно предположить, что они используют различные пути трансдукции сигнала (Wagner etal., 1996; Batschauer, 1998).

Криптохромы и фоторецептор фототропизма — семейство фоторецепторов, поглощающих УФ - А / синий свет (350-500 нм). В модельном объекте Arabidopsis thaliana было открыто два типа фоторецепторов криптохром 1 и 2 (cry 1 and cry 2 - cryptochrom 1 and 2) (Lin et al., 1998).

Криптохром - белок, состоящий из 681 аминокислоты (молекулярная масса 75,8 кД). В исследованиях Lin с соавт., было показано, что hy 4 белок функционирует как фоторецептор УФ - А/синего света (Lin et al., 1995а; Lin et al., 1995b). Полагают, что cry 1 белок, скорее всего, -функционирует как растворимый белок (Ahmad, Cashmore, 1996).

Показано, что во взрослых листьях некоторых видов растений, включая арабидопсис, экспрессия генов CHS (хальконсинтазы), DFR (дигидрофлавонол-редуктазы) и СНГ (халькон-изомеразы) управляется, прежде всего, УФ-В, УФ -А и синим светом (Feinbaum et al., 1991; Jackson, Jenkins, 1995). Cry 1 функционирует как в проростках, так и в зрелых растениях, его действие обнаруживается в различных органах. Экспериментами Wade с соавт., было обнаружено, что в зависимости от вида, стадии развития и экспериментальных условий выращивания, растений,-облучение .красным или дальним красным может изменять степень индукции гена, кодирующего фермент халькон-синтазу (CHS) в ответ на последующее облучение синим светом и наоборот (Wade Н.К. et al., 2001). Также ими показано, что мутанты phy А и phy В индуцируют повышенное производство CHS при облучении УФ-А светом через cry 1, хотя cry 1 и cry 2 не вовлечены в индукцию CHS при облучении УФ — В госс:іі:с;м * - госул/."~гл::і!ііля светом. Однако ответы на УФ — В свет не требуют присутствия фитохромов phy А и phy В. УФ - А световая индукция CHS в основном устанавливается cry 1, a cry 2 не принимает в этом участия.

Вероятно, что фитохромы, являясь положительными регуляторами cry 1, играют важную роль в интеграции ответов, устанавливаемых cry 1 и УФ — В (Wade et al., 2001). Остается до сих пор неизвестным механизм восприятия УФ — В света. Результаты приведенных исследований показывают, что белок cry 1 участвует в регуляции целого ряда ответов растений на синий свет высокой интенсивности: биосинтез пигментов (антоцианов), на ионные потоки и величину мембранного потенциала (Casal, 2000). Синий свет вызывает фототаксисы, перегруппировку хлоропластов (Batschauer, 1998; Lin, 2000). На уровне целого растения криптохромы (cry 1 and 2) могут влиять на транспирацию, в том числе и раскрытие устьиц, сдвиги циркадных ритмов, различные фотоморфогенетические изменения: положительные и отрицательные ростовые изгибы, торможение и стимуляцию роста корней, фотоконтроль цветения (Ahmad, Cashmore, 1996).

Немного позже, в исследованиях Ahmad и Cashmore, в геноме арабидопсиса была найдена последовательность, гомологичная hy 4 (cry 1) которая была названа cry 2 - криптохром-2 (Ahmad, Cashmore, 1996). Белки cry 1 и cry 2 оказались высоко гомологичными в N-концевых областях, которые участвуют в связывании хромофоров, в последовательностях С - концевых областей cry 1 и cry 2 не наблюдается никакой взаимосвязи. Исследования белков показали, что функция cry 2 во многом дублирует cry 1 (Ahmad, Cashmore, 1996; Lin, 2000). В отличие от cry 1, белок cry 2 быстро разрушается в проростках при освещении светом с длинами волн, активизирующими этот рецептор (УФ, синий, зеленый свет) (Ahmad et al., 1996, 1998; Lin et al., 1998, 2000). При высокой интенсивности белого света, белок cry 2 не накапливается. Вероятно, cry 2 играет меньшую роль во многих ответах растения на свет

42 высокой интенсивности, также подобно cry 1, способствует зависимой от синего света инициации цветения (Lin, 2000).-

Фототропизм - одно из наиболее хорошо изученных явлений в растениях под воздействием синего участка спектра (Кефели, 1975). В результате экспериментов, проведенных на арабидопсисе, было доказано, что в фототропической реакции, вызываемой синим светом, участвуют, по крайней мере, два различных фоторецептора (Christie et al., 1998). Причем участие фоторецепторов cry I и cry 2 в инициации фототропического искривления носит дополняющий характер (Lin, 2000). Было обнаружено, что воздействие синего света вызывает быстрое фосфорилирование белка 120 кД в плазматической мембране (Short й-Briggs, 1994). Liscum и Briggs (1995) изолировали несколько мутантов фототропизма арабидопсиса nph 1 (nonphototropic hypocotyls 1). Оказалось, что ген NPH1 кодирует белок в 996 аминокислот (112 кД) (Christie et al., 1998). Рекомбинантный nph 1 белок мог связывать флавин (ФМН), и осуществлял фосфорилирование, зависимое от синего света. В nph 1 белке, С — терминальная область имеет сильное сродство с серии — треониновыми белковыми киназами, а N — терминальный домен имеет две области по 100 аминокислот (отвечающими за восприятие света . и кислорода), в сходной последовательности с белками архей и бактерий, которые регулируются сигналами внешней среды и отвечают за изменение окислительно — восстановительного потенциала в клетке (Batschauer, 1998, Lin, 2000).

Эти результаты говорят о возможности прямого участия белка nph 1 в восприятии синего света. На основе этих данных белок nph 1 был предложен как фоторецептор для фототропизма (Christie et al., 1998).

О роли криптохромов в установлении фототропической реакции были сделаны следующие предположения. Возможно, что криптохромы функционируют как светособирающие молекулы, которые передают световую энергию непосредственно к nph L (Ahmad et al., 1998) Также, при облучении

43 двойных мутантов phy А и phy В красным светом, а затем синим, вызывало у них реакцию фототропического изгиба опосредованно, через фототропин nph 1 (Janoudi et al., 1997). Двойные же мутанты cry 1 и cry 2 давали нормальную реакцию фототропического изгиба, в ответ на облучение синим светом.

В результате описанных выше исследований, всю систему фотосенсорных сигнальных путей на данный момент можно представить в виде обобщающей схемы (рис. 1). FHY 1 SPA3 PEFI PSI2 PEF1 PSI2

Рисунок 1. Обобщающая схема фотосенсорных сигнальных путей (по Deng X. W., Quail Р.Н., 1999)

2.2.. Предполагаемые механизмы преобразования светового сигнала в морфо генетические реакции

Фоторецепторы и регулируемые светом ответы, в последние годы изучались довольно интенсивно (Ahmad et al., 1996, 1998, 1999; Casal, 2000; Lin et al., 1995, 1998, 2000). Намного менее изучены пути сигнальной трансдукции, которые могут состоять из множества сигнальных молекул, отвечающих не только на воздействие света, но и другие раздражители как внешней, так и

44 внутренней среды растений, подобно фитогормонам (Chory et al., 1996). Регуляторное воздействие света на растение начинается с активации фоторецепторов, а затем переходит на геном (область потенциально активных генов), после чего следует ряд метаболических изменений в растительных клетках. Показано, что восприятие светового сигнала фоторецептором сопряжено с изменениями ионных потоков через клеточные мембраны, фосфорилированием мембранных белков и. активацией, специфических G-белков. Продемонстрировано . участие G-белков в управлении генной экспрессией синим светом (Jenkins et al., 1995) Полагают, что сигналы, воспринятые фоторецепторами, могут передаваться через клеточные компоненты.

В настоящее время еще недостаточно изучены события, которые происходят, начиная с момента восприятия светового сигнала фоторецептором до изменения метаболических процессов в растении.

2.3. Действие света различного спектрального состава на биохимические и морфологические характеристики растений

2.3.1. Влияние света различного спектрального состава на биохимические характеристики

Щ Спектральный состав света, особенно при длительном его воздействии на растения, может оказывать влияние на синтез и накопление самых различных биохимических продуктов (Воскресенская, Поляков, 1976; Протасова, 1981; Карначук, 1989; Тихомиров и др., 1991, 1999).

Синтез основного пигмента- фотосинтеза - хлорофилла имеет ярко выраженную спектральную зависимость и наиболее интенсивно

У осуществляется в синей и красной областях спектра (Мерзляк, 1998). Можно отметить, что помимо пластидных пигментов спектральный состав света влияет . . ⁴⁵ и на образование пигментов клеточного сока — антоцианинов (Протасова, 1981), Наряду с пигментами, ответственными за фотосинтез, отмечено влияние спектрального состава света на содержание фермента РБФ -карбоксилазы, играющего ведущую роль в самом процессе фотосинтеза. Так, в листьях ячменя содержание РБФ - карбоксилазы на синем свету в течение всего периода их активности было больше, чем на красном, и хотя оно с возрастом листа снижалось, отношение синий / красный даже возрастало (Тихомиров и др., 1991). В растениях, предварительно выращенных на белом свету, через несколько секунд после экспозиции под синим светом усилился синтез неуглеводных продуктов: аминокислот (аланин, аспартат) и органических кислот (малат, цитрат), а под красным светом - растворимых углеводов. Через несколько минут экспозиции под синим светом, интенсифицировался синтез белков, а под красным — крахмала (Протасова, 1981). В настоящее время широко. распространено представление о том, что синий свет стимулирует белковую, а красный - углеводную направленность метаболизма растений. Это отражается в первую очередь на биохимическом составе листьев, подвергающихся прямому воздействию лучей какой - либо области спектра, но в той или иной степени и на биохимии запасающих органов (корнеплоды, плоды, зерно) (Тихомиров и др., 1999).

Однако, с действием света обычно связывали лишь биосинтез хлорофилла, отдельные стадии которого имеют фотохимическую природу. Совместные успехи биологической химии и фотобиологии позволили установить зависимость биосинтеза таких высокомолекулярных компонентов клетки, как белки, липиды, нуклеиновые кислоты и другие органические соединения.

2.3.2. Влияние света спектрального состава на морфометрические характеристики

Длительное выращивание растений на свету различного спектрального состава показало зависимость роста от качества света (Карначук, 1989). Красный участок спектра способствовал росту листьев и осевых органов. Растения достигали наибольших размеров, как по площади, так и по биомассе целого растения. На фоне других длин волн красный участок вызывал ускорение формирования генеративных органов (Карначук, 1989). Синий же свет, тормозит рост стебля, черешков и площади листьев, что приводит к формированию низкорослых растений с низкой продуктивностью. Морфологический анализ взрослых растений томатов, сформировавшихся при излучении отдельных областей ФАР, показал, что к концу вегетации наибольшую листовую массу имели томаты при облучении синей областью спектра, а наименьшую - красной областью. Однако появление и развитие репродуктивных органов шло более интенсивно в красном участке спектрального света, а наименее интенсивно - в синем (Дурандин, 1973). В отличие от этих характеристик, слабо зависящих от интенсивности излучения, такой показатель, как линейный рорт томатов, существенно зависел от спектра ФАР и уровня облученности в ее отдельных областях. Наиболее интенсивный

4$ рост стебля был зарегистрирован на красном участке спектра, а наименее интенсивный - на синем (Дурандин, 1973). При анализе процессов генеративного развития томатов весьма важной характеристикой является начало цветения. Самое раннее цветение (на 42-е сутки вегетации) наступает при облучении красным участком спектра, наиболее позднее (на 52-е сутки вегетации)- в синем. Также значительно различался процесс плодообразования *f у растений томата, замедленно он шел в синем участке спектра, а наиболее интенсивно — в красном (Тихомиров и др., 1991). Известно, что фотосинтез и

47 накопление хозяйственно полезной биомассы при длительном воздействии излучения смешанного спектрального состава коррелирует далеко не всегда. Что же касается «потенциального» фотосинтеза, то обсуждение его корреляции с накоплением биомассы, которое происходит лишь при достаточно длительном воздействии света на растения, дает отрицательные выводы, поскольку в данном случае приходится сопоставлять кратковременный минутный эффект (фотосинтез) и длительный многосуточный эффект, оцениваемый по конечному результату (накоплению биомассы). Даже в рамках одного процесса - фотосинтеза кратковременное и длительное воздействие спектрального состава света на растительный организм может оказаться несовпадающим (Тихомиров и др., 1991).

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЯ 3.1. Объект исследования

В качестве объекта исследования было, выбрано растение из семейства пасленовых (Solanaceae) - Lycopersicon esculentum L.,томат.

Томат - травянистое однолетнее растение, стебли полегающие или прямостоячие, голые или слабо опушенные, листья непарно перисто-рассеченные, соцветие завиток (простой, малосложный или многосложный). Цветки мелкие, средние или крупные, желтые, различных оттенков желтого цвета, завязь шаровидная, удлиненная, гладкая, ребристая, двух- и много гнезд ная, столбик цилиндрический, иногда фасциированный. Томат относят к факультативным самоопылителям. Плод - сочная дву - или многогнездная ягода округлой, - плоскоокруглой, плоской, эллипсовидной, удлиненно-овальной, сливовидной, * грушевидной формы, от темно-красной и оранжевой до бледно-розовой, светло-желтой и белой окраски, диаметром от 3 до 10 см, весит от 20 до 900 г и больше, созревание плодов наступает через 80 -140 суток после появления всходов растений. Семена мелкие, яйцевидные или треугольно-почковидные, плоские, заостренные у основания, светло- и темно-желтые с сероватым оттенком (Брежнев Д.Д, 1964). "т Родиной томата является Южная Америка. Дикорастущие виды томата найдены в Перу, Эквадоре, Чили. В культуре распространен во всех частях света. - Насчитывается более 200,0' сортов и форм томата обыкновенного. Благоприятная температура для развития растений 20 - 25С. Растения относительно засухоустойчивы, лучшая влажность почвы 60 — 70 % полной влагоемкости, а влажность воздуха 45 - 60%. Томаты можно выращивать на ^ любых почвах, кислотность которых не ниже 4,5.

49 Растение имеет большое сельскохозяйственное значение, культивируется как овощ, плоды употребляются сырые, в виде приправ, кроме этого, томат широко применяется как модельный объект в научных исследованиях, поскольку у этой культуры наиболее полно изучен геном, построены детальные карты хромосом, и ее можно культивировать как в полевых, так и тепличных условиях (Жученко А.А., 1973).

В работе использовали растения томата сорта Дубок, восприимчивый к ВТМ. И мутантные растения томата, полученные из .коллекции ВНИИ садоводства и овощеводства (г. Лесной городок, Московской обл., любезно предоставленные Балашовой Н.Н.).

Мутантная форма томата (Mo) 382, отличающийся от стандарта (сорт Marglobe) тем, что несет ген rava (локализован в 4 хромосоме, 34 локусе), маркерным признаком которого являются загнутые книзу листья тускло-серо-зеленого цвета, более опушенные, удлиненные, толерантный к ВТМ₀, отличающийся высокой продуктивностью (Бочарникова Н.И., Козлова В.М., 1992), (рис. 2). Также линия, содержащая ген, контролирующий устойчивость к ВТМ: -Мо 464, несущий ген Тт (tobacco-mosaic virus resistance), экспрессия которого подавляет накопление штамма ВТМ₀ и формирование мозаичных симптомов (Watanable et aL, 1987), маркерный признак - умеренная устойчивость к ВТМ (Motoyoshi et al., 1975). — П¹*¹ tt "Є « -2 -и » їївй u«sSg Ґ1 "* о-- -S *а ид и я-я g в- s*2

О О О —і ІО^Ии _4н+ "Е [=4. я я EJj _{- -a!-}

Г⁴- MD^^OMO cn rN m с* ел fi ^"

3.2. Условия выращивания растений на белом свету

Томаты выращивали в почвенной культуре, в предварительно дренированных емкостях, с почвенной смесью следующего состава: листовая земля: перегной: песок в соотношении 1:2:1, в объеме 1 л. Растения выращивали с фотопериодом 16 '- 18 часов и при температуре 20 - 22С. Семена выдерживали в КМ11О4, затем промывали водой и высаживали в почву. Пикировка производилась на восьмой день. Растения выращивали на белом свету. Источником белого света служили люминесцентные лампы дневного света мощностью 65Вт (ЛБ-65, ЛД - 65), интенсивность освещения 40 Вт/м (рис. 3, рис. 4).

Рисунок 3. Спектральные характеристики люминесцентных ламп ЛД — 65 (по Юшину A.M.)

Растения заражали вирусом табачной мозаики (обыкновенный штамм) в фазе четырех листьев (любезно пред. ВНИИКХ, п. Коренево Московской области). Инокуляцию ВТМ проводили на неотделенных листьях. Перед заражением листья обрабатывали целлитом («Serva», Германия), чтобы нарушить целостность трихом и кутикулы. Затем наносили 100 мкл ВТМ

52 (штамм Vo), равномерно распределяя по поверхности листа.

Инфекционная нагрузка составлялаЗО нг ВТМ на растение.

Рисунок 4. Спектральные характеристики люминесцентных ламп ЛБ — 65 (по Юшину A.M.)

В ходе каждого эксперимента фиксировали растительный материал. Измеряли морфометрические показатели - высоту растений, площадь листьев, содержание фотосинтетических пигментов: до заражения, после фототерапии и в конце'патогенеза на 30 сутки. Накопление антигена ВТМ регистрировали с помощью ELISA - метода в течение всего патогенеза. Гормональный баланс здоровых и инфицированных растений исследовали, определяя активность (биотест) и количество (иммуноферментный метод) эндогенных фитогормонов. Для определения гормонального баланса томатов были зафиксированы опытные и контрольные пробы с трех растений каждого генотипа. В эксперименте определяли содержание следующих фитогормонов: индолилуксусной кислоты (ИУК), абсцизовой кислоты (АБК), гиббереллинов (ГАі_і3, ГА_4і7), цитокининов (ЦК): зеатина (3), рибозид зеатина (РЗ), изопентениладенина (ИПА). - '

3.3. Эксперименты с использованием света различного спектрального состава

В эксперименте по досвечиванию синим и красным светом, источником спектрального света были две галогеновые лампы КГМ 24-150, мощностью 150 Вт/м² (рис, 5).

Рисунок 5. Спектральные характеристики галогеновых ламп КГМ — 24 -150 (по Юшину A.M.)

Свет был выровнен по падающим квантам и составлял 10 ммоль/см с -Свет галогеновых ламп пропускали через цветные силикатные стекла (рисунок 5), любезно предоставленные проф. А.А, Тихомировым, (Красноярск). Фильтры синего участка спектра имели max = 420 нм, ширину полосы 80 нм, пропускание в воздухе - 30%, красного - max = 680 нм, ширину полосы 60 нм, пропускание в воздухе - 85%. длина волны, им

Рисунок 6. Спектральные характеристики цветных силикатных стекол (пред. проф. Тихомировым А.А.)

В фазе четырех листьев томаты досвечивали синим и красным светом до заражения, затем в фазе четырех листьев после заражения с определенным периодом досвечивания.

3.3.1. Эксперименты по измерению экспозиции спектрального света

В опыты по измерению экспозиции спектрального света использовали растения томата сорта Дубок, восприимчивые к ВТМ.

Варианты экспериментальных условий выращивания: а) Здоровые растения, на белом свету; б) Три группы здоровых растений, досвечиваемые синим участком спектра, с экспозицией 5, 15 и 45 минут; в) Три группы здоровых растений, досвечиваемые красным участком спектра, с экспозицией 5, 15 и 45 минут; г) Три группы растений, инфицированные ВТМ, досвечиваемые синим светом с экспозицией 5, 15 и 45 минут; д) Три группы растений, инфицированных ВТМ, досвечиваемые красным светом с экспозицией 5, 15 минут и 45 минут; е) Инфицированные ВТМ растения, на белом свету.

В эксперименте использовали два основных фактора, разделяющие растения на варианты: момент инокуляции и. экспозиция спектрального света (рисунок 7).

Рисунок 7. Схема эксперимента по влиянию синего и красного света различной экспозиции

3.3.2. Эксперименты с использованием контрастных по устойчивости растений томата и спектрального света

В опытах использовали: сорт томата Дубок, восприимчивый к ВТМ. Мо 464 несущий ген Тт (tobacco-mosaic virus' resistance) экспрессия которого подавляет накопление штамма ВТМо и формирование мозаичных симптомов (Watanable et al., 1987) - устойчивый к ВТМ. Мо 382 rava - толерантный к ВТМ, который является мутантом, с детерминированным количеством хлорофилла. Растения инфицировали обыкновенным штаммом ВТМ (Vo). Экспозиция спектрального света: синего и красного составляла 15 минут (рис. 6). ^ Варианты экспериментальных условий выращивания для всех генотипов:

Здоровые растения на белом свету;

Разовая досветка растений синим светом до'инокуляции ВТМ;

Разовая досветка растений синим светом после инокуляции ВТМ;

Досветка синим светом 8 суток до инокуляции ВТМ;

Досветка синим светом 8 суток после инокуляции ВТМ;

Досветка синим светом весь патогенез после инокуляции ВТМ;

Разовая досветка растений красным светом до инокуляции ВТМ; ^ 8) Разовая досветка растений красным светом после инокуляции ВТМ;

9) Досветка красным светом 8 суток до инокуляции ВТМ;

Досветка красным светом 8 суток после инокуляции ВТМ;

Досветка красным светом весь -патогенез после инокуляции ВТМ;

Инфицированные растения на белом свету.

На П день патогенеза были отмечены симптомы поражения на

Ч восприимчивых растениях сорта Дубок. На 23 сутки патогенеза отмечались мозаичные симптомы на толерантных растениях томата. На устойчивых

57 томатах симптомы заражения были малочисленны к 30 дню патогенеза, в виде серебристых морщинистых пятен на одной половине листа.

Также на восприимчивых растениях сорта Дубок, на 30 день патогенеза были обнаружены морфологические изменения листьев: истонченность долей, морщинистость листовой пластинки и их скручивание вдоль центральной жилки.

3.4. Определение количества фотосинтетических пигментов

В незараженных и зараженных листьях проводили определение фотосинтетических пигментов спектрофотометрическим методом (Шлык, 1971). Навеску свежих листьев (700 мг) известной площади S, гомогенизировали и экстрагировали 100%- ым ацетоном. Полученный гомогенат центрифугировали 5 мин при скорости 8 тыс. оборотов / мин. Супернатант доводили ацетоном до определенного объема V (5 мл). Полученный экстракт исследовали на спектрофотометре СФ-26 "Ломо" в 1 см кювете. Измеряли оптическую плотность Е экстракта при следующих длинах волн: ' " ...

440,5 нм (фиолетовый светофильтр) - определение суммы каротиноидов 644 нм (красный светофильтр) - определение хлорофилла b 662 нм (красный светофильтр) - определение хлорофилла а 720 нм (красный светофильтр) - определение мутности экстракта. Из значений экстинкций при этих длинах волн вычисляли концентрации [С] пигментов по формулам Хольма для 100 %-го ацетона:

Содержание хлорофилла а: [С] ^(9,784-Е^ - 0,99^644)V/ S;

Содержание хлорофилла Ь:' [С] =(21,426-Еб44 -4,65-E₆₆₂)V/S;

58 Содержание суммы ' - ' каротиноидов:. [С] =(4,695-Е44о,₅ - 0,268-(5,134-Е_6б2 + 20,436-E₆₄₄)V/S; где: «ї> Е = Еб44 — Е720

С - концентрация пигмента в пробе, мкг/см² V - конечный объем экстракта, мл S - площадь высечки, см².

3.5. Количественное определение белка оболочки вируса табачной мозаики

Определение антигена проводили «сэндвич» - вариантом иммуноферментного анализа (ИФА). Для определения количества антигена ВТМ использовали наборы ВНИИКХ, п. Коренево Московской области. Анализ титра ВТМ проводили на полистероловых планшетах («Медполимер», С.-Петербург), которые использовали в качестве сорбента. Разведение растворов, коньюгатов и сывороток делали в соответствии с инструкцией (пред. ВНИИКХ, п. Коренево Московской области).

Анализировали листовой материал. Ткань измельчали, разбавляли буфером для проб в соотношении 1:10. При взятии проб инструменты щ. тщательно промывали 70 % раствором этилового спирта.

Наливали по 0,1 мл рабочего раствора антител в лунки платы, накрывали плату крышкой и инкубировали в течение ночи при + 4С или в течение 1,5 часа при +37 С в термостате. Затем удаляли раствор антител из платы. Для этого резко переворачивали плату и вытряхивали содержимое. Заполняли лунки дистиллированной водой с детергентом и через 15 — 30 сек. удаляли ее.

Ц Повторяли промывку дистиллированной водой с детергентом дважды. В третий

59раз заполняли лунки промывочным буфером и через 15 — 30 сек. его удаляли. Излишек влаги удаляли легкими ударами по листу фильтровальной бумаги.. , .

Далее, наносили в лунки платы анализируемые образцы, а также положительный контроль в объеме 0,1 мл. В качестве отрицательного контроля использовали заведомо здоровый материал в том виде, который используется для анализа. При оценке результатов считали эти лунки отрицательным контролем.

Таблица 1 Растворы для проведения иммуноферментного анализа

В нескольких лунках готовили 50-кратные разведения стандарта чистого препарата ВТМ (от 1000 нг/мл до 5 нг/мл) для калибровочной кривой.

60 Накрывали плату крышкой и инкубировали 1 час при 37 С или в течение ночи при + 4С. Объем вносимого в лунки образца не должен превышать 0,1 мл во избежание появления неспецифической реакции.

Затем удаляли анализируемые образцы из платы. Для этого резко переворачивали плату и вытряхивали содержимое. Заполняли лунки дистиллированной водой с детергентом и через 15 — 30 сек. удаляли ее. Повторяли промывку дистиллированной водой с детергентом дважды. В третий раз заполняли лунки промывочным буфером и через 15—30 сек. его удаляли. Излишек влаги удаляли легкими ударами по листу фильтровальной бумаги. Наливали рабочий раствор коньюгата по ОД мл в лунки платы, накрывали плату крышкой и инкубировали один час при 37С. Промывку платы после коньюгата повторяли четыре раза. Проводили ферментативную реакцию. Наливали по 0,1 мл свежеприготовленного раствора субстрата в лунки и инкубировали для развития окраски при комнатной температуре в течение 20 -30 минут при использовании ортофенилендиамина (4 мг в 10 мл субстратного буфера), и 40 - 60 минут при использовании ортофенилендиамина (2 мг в 10 мл субстратного буфера), после чего реакцию остановливали добавлением в каждую лунку 0,05 мл ЗМ H2SO4 (табл.1).

Оценку результатов ИФА проводили с помощью фотометра (DYNATECH, MR700) при длине волны 490 нм.

Расчет инфекционности проб производили по калибровке и по формуле Р = X + ЗЕ, где Р - порог достоверности положительных результатов, X — среднее значение оптического поглощения для отрицательных проб, ЗЕ -тройное значение максимального положительного отклонения от среднего в отрицательном контроле.

3.6. Определение эндогенных фитогормонов 3.6.1. Выделение фитогормонов

Определение различных групп фитогормонов - гиббереллинов, цитокининов (зеатина, рибозида зеатина, изопентениладенина), ИУК и АБК в зеленых" листьях томата проводили одновременно в 3 г. навески сырого растительного материала.

Растительный материал фиксировали жидким азотом. Листья заливали 96 % этанолом и гомогенизировали. Супернатант сливали и оставляли при температуре 4-6С. Оставшийся гомогенат для дальнейшей экстракции заливали 80% раствором этанола и оставляли на 2 часа при температуре 4-6С, помешивая. Эту операцию проделывали трижды. После этого гомогенат центрифугировали 10 мин при 10 тыс. оборотов/мин. Объединенный экстракт упаривали до водного остатка на роторном испарителе.

Полученный супернатант доводили дистиллированной водой до 15 мл и разделяли на три равные части, из которых затем выделяли ГА, ЦК, ИУК и АБК.

Выделение гиббереллинов проводили, подкисляя супернатант 10%-м раствором H2SO4 до рН 2-3 (Ложникова и др., 1973). Затем дважды экстрагировали этилацетатом (5 и 3 мл), отбирая каждый раз эфирную фазу, где содержались кислые гиббереллины. Объединенный экстракт упаривали досуха.

Для выделения связанных форм гиббереллинов использовали водную фракцию, оставшуюся после экстракции. Ее подвергали щелочному гидролизу, для чего доводили 10 %-м раствором NaOH до рН 9.-10 и помещали в кипящую водяную баню на 1 час. Охлажденный гидролизат подкисляли 10%-м H2SO4 раствором до рН 2-3 и вновь подвергали экстрагированию этилацетатом (5 и 3 мл). Эфирные экстракты объединяли, упаривали досуха.

Для разделения гормонов использовали восходящую тонкослойную хроматографию (ТСХ). Сухие экстракты гормонов растворяли в 150 мкл 96 % этилового спирта и наносили на уровне старта хроматограммы одновременно со стандартными метчиками гормонов ГАз и ГАд ("Serva", Германия) на пластинки "Silufol-LTV-254" ("Kavalier", Чехия). Хроматографическое разделение проводили в системе растворителей хлороформ; этиловый эфир уксусной кислоты: уксусная кислота - 70:30:5 (Atzom, Weiler, 1983). Затем пластинки просматривали в УФ - лучах для идентификации зон гиббереллинов по положению метчиков и их флуоресценции. Учитывая, что ГАї, ГАз и изо-ГАз, а также ГА4, ГА₇ и изо-ГА₇ не разделяются и элюируются в виде общих зон (Обут и др.,1983), мы анализировали их смеси, которые соответственно обозначали как ГА |_t3 и ГА^. Из второй части полученного супернатанта проводили выделение цитокининов, подщелачивая экстракт 10 %-м раствором NaOH до рН 8 и дважды экстрагируя н-бутанолом первоначально 4 мл, затем еще 3 мл (Негрецкий, 1988). Объединенный бутанольный экстракт упаривали досуха на роторном испарителе.

Репродукция фитовирусов в модельных системах

Репродукция многих фагов и ряда вирусов животных заканчивается гибелью первично инфицированной клетки, в результате чего дочерние частицы освобождаются и участвуют в новых инфицированиях (Агол, 1975). В отличие от этой схемы в листьях пораженных растений выход инфекционного материала из первично зараженной клетки начинается задолго до окончания репродукции вируса в ней. Поэтому в листьях растений уже в первые сутки после заражения существует разнообразие клеток, находящихся на разных стадиях болезни и зараженных как вирусом инокулюма, то есть первично инфицированных, так и зараженных вторично - инфекционным материалом из ранее зараженных клеток. Такое разнообразие клеток в листе поддерживается довольно долго, так как репродукция вируса в одной клетке может продолжаться несколько суток. В этих условиях практически не удается четко проследить ни циклов размножения, ни смены поколений (Mas, Beachy, 1999). Репродукция фитовирусов — сравнительно медленный процесс, где время «синтеза» одной частицы составляет 10—20 минут (Bourque et al., 1975). В зависимости от модели увеличение титра вируса происходит неодинаково. Очень быстро инфекционность накапливается в протопластах: после 4 — 6 часов лаг - фазы титр вируса быстро начинает увеличиваться и достигает максимума примерно через 48 часов после инокуляции. Показано, что для вируса табачной мозаики (ВТМ) лаг-фаза, связанная с проникновением вируса и депротеинизацией инфекционных вирусных рибонуклеиновых кислот, продолжается 4 часа в изолированных протопластах (Takebe, Otsuki, 1969), 6 — 8 часов в листьях и 10 часов в суспензионной культуре табака (Murakishi et al., 1971). Наиболее длительная лаг-фаза, предшествующая регистрируемому увеличению инфекционности, отмечена для инфекционного процесса в листьях. Вирусная рибонуклеиновая кислота (РНК) на очень ранних стадиях заражения ограничена пузырек - подобными структурами вокруг ядра (Mas, Beachy, 1998). Постепенное увеличение титра вируса, приводящее к тому, что кривая инфекционности выходит на плато только на восьмой или даже на десятый день после инокуляции, связано с вторичной инфекцией - переходом вируса от клетки к клетке. К моменту достижения плато кривой, заболеванием охвачено максимально возможное в этих условиях число клеток (Mas, Beachy, 1998). На ранних стадиях репликации вирусная РНК тесно ассоциирована с эндоплазматическим ретикулумом (Boyко et al., 2002). Логарифмический характер роста инфекционности во второй фазе обусловливается увеличением числа инфекционных центров (Mas, Beachy, 1999). Для листьев этот процесс понимают как распространение вируса от клетки к клетке, что распространяется и на систему изолированных клеток. В опытах с листьями показано, что в фазе логарифмического роста начинается активный синтез вирусных одно - и двуспиральных РНК. Инфекционная вирусная РНК в этой фазе неинкапсидирована и чувствительна к РНКазе (Diener, 1962).

В третьей фазе, пропорционального роста титра вируса, продолжается накопление односпиральной вирусной РНК, но одновременно наблюдается активный синтез структурного белка и образование зрелых вирионов. Репликазный комплекс с вирусной РНК в этот момент тесно связан с микротрубочками и перемещается к периферии ядра (Boyko et al., 2000). В опытах с протопластами, в конце фазы свободная от оболочки вирусная РНК уже не обнаруживается (Aoki, Takebe, 1975).

Последняя фаза в репродукции вируса соответствует остановке репродукции, причем в клетках, которые зачастую имеют достаточное количество предшественников, необходимых для продолжения синтеза вирусных компонентов (Mas, Beachy, 1998).

При инфицировании протопластов вирусом табачной мозаики обычный выход вируса составляет 106 — 107 частиц-на инфицированный протопласт (Takebe,- Otsuki, 1975), Несмотря- на то, что накопление инфекционности в разных системах осуществляется с разной скоростью, конечный результат оказывается приблизительно одинаковым: цифры накопления вирусных частиц в инфицированных клетках - одного порядка для разных систем (Mas, Beachy, 1999). На последней стадии инфекционного процесса вирусная РНК также тесно связана с микротрубочками и эндоплазматическим ретикулумом, однако. пока неясно были ли эти ассоциации непосредственными или косвенными (Beachy, Heinlein, 2000).

Реакции растений на свет и фоторецепторы

Рост и развитие растения зависит, прежде всего, от света, от его качественного и количественного состава. Свет выступает в качестве индуктора основных механизмов эндогенного регулирования растений (Воскресенская, 1975; Карначук, 1989; Кефели, 1991; Kendrick, Kronenberg, 1994).

Растения реагируют на свет через фоторецепторы, которые состоят из поглощающего свет пигмента (хромофора),, связанного с молекулой белка-эффектора (апопротеина). Поглощение света хромофором вызывает пространственное изменение в апопротеине рецептора, которое передается следующим сигнальным молекулам, что приводит к изменению мембранной проницаемости, экспрессии генов и т.п. и в конечном итоге - к физиологическому ответу растения (Кефели, 1975; Ahmad, 1999).

В настоящее время считают, что в растениях все разнообразные ответы на свет опосредованы следующими типами фоторецепторов (Casal , 2000). Это пять фитохромов (phy А — phy Е), которые поглощают в красной / дальней -красной области видимого спектра (длины волн 600-800 нм) (Furuya, 1993; Quail, 1998), фоторецепторы, поглощающие УФ-А / синий свет (350-500 нм), известные как криптохромы (cry 1, cry 2) (Ahmad, Cashmore, 1996), фототропин (nph 1- nonphototropic hypocotyl 1), а также специфические фоторецепторы, поглощающие в области УФ-В (280-320 нм), но природа этих молекул не известна (Jenkins et al., 1995).

Данные о структуре, функциях, взаимодействии различных фоторецепторов растений позволяют сделать следующие выводы: 1) Все ответы растения на свет опосредованы несколькими типами фоторецепторов, в основном фитохромами и криптохромами (Casal et al., 2000). 2) Фоторецепторы в растениях представлены различными семействами гомологов, которые могут реагировать на свет аналогичным образом (Ahmad, 1999; Maloofetal., 2000). 3) Неоднозначность ответов растения может быть результатом различной локализации рецепторов, их доступности и взаимодействии между собой (Maloof et al., 2000; Casal et al., 2000). Фитохромы - семейство бифункциональных фоторецепторов, с двумя структурными доменами, N - область фотосенсорная (70 кД) и С -регуляторный домен (55 кД) (Park et al., 2000). Хромопротеид, представленный линейным тетрапиррольным хромофором и полипептидом 120-130 кД, существует в двух фотовзаимозаменяемых формах, ответственных за восприятие (Pr - Red-absorbing) красного (КС, X = 660 нм) и (Pfr — Far-red-absorbing) дальнего красного света (ДКС, X = 730 нм) (Maloof et al, 2000). Фитохром синтезируется в Рг форме (Batschauer, 1998). Все пять фитохромов (phy А — phy Е - phytochrom) кодируются различными генами, что было показано на модельном объекте Arabidopsis thaliana (Clack et al., 1994; Park et al., 2000). Для перехода из одной формы в другую достаточно освещения светом низкой интенсивности КСУ что приводит к переходу из неактивной формы Рг в активную Pfr, которая вызывает фотоморфогенез. Хотя, некоторые исследования показали, что Рг также может иметь физиологическую функцию (Lin, 2000). Обратный переход из Pfr в Рг происходит в темноте или при облучении ДКС (Casal et al., 2000). Хотя обе формы фитохрома имеют различные спектральные диапазоны поглощения света, они все-таки перекрываются. Из-за этого перекрытия, фоторавновесие Pr/Pfr зависит от длины волны и составляет приблизительно 80 % КС, 3 %, 40 % синего света (X = 450 нм). Таким образом, синий свет (и UV-A) весьма эффективен в фотопреобразованиии Рг, что иногда приводит к затруднениям в различении ответов; вызываемых фитохромам и и специфическими сине-легкими рецепторами, или их совместным действием (Jones, Edgerton, 1994). Была проанализирована локализация фитохромов. Несмотря на несколько сообщений о мембраносвязанных фитохромах (Sineshchekov, 1994), большинством исследований показано, что фитохромы - растворимые в цитоплазме белки (Quial, 1998). Однако, в работе Sakamoto и Nagatani, была показана, регулируемая светом, ядерная локализация фитохрома (phy В) (Sakamoto К., Nagatani А., 1996). Помимо других отличий, локализация фитохромов в разных компартментах клетки и обуславливает их различные ответы. Результатами работы Nagy с соавт., было показано, что - в этиолированных растениях и адаптированных к темноте фитохромы phy А, В локализованы в цитоплазме. Ядерный транспорт светозависим и ДКС более эффективен в отношении phy А, чем phy В (Nagy F. et al., 2000). Однако первичные механизмы действия фитохрома в настоящее время до конца не выявлены и до сих пор являются спорными (Fankhauser, 2000). Фитохром в низших растениях обладает киназной активностью. В некоторых исследованиях было показано, что С - концевой домен фитохрома мха Ceratodon purpureus действует как серин-треониновая и тирозин о вая протеинкиназа, которая регулируется светом.(Trummler et al., 1995). Поэтому предположили, что в высших растениях фитохромы тоже обладают киназной активностью (Fankhauser, 2000). Одной из первых реакций, индуцируемой КС, является возрастание концентрации Са" "1" в цитоплазме растительных клеток, при участии фитохрома. Никтинастические движения листьев контролируются фитохромом через регуляцию мембранного транспорта Са и его уровня в цитоплазме. На уровне клеток фитохром регулирует некоторые быстрые процессы: движения устьиц, хлоропластов, настии, уровень мембранного электрического потенциала и проницаемость мембран, и более медленные: .синтез пигментов — хлорофиллов и каротиноидов, синтез de novo ферментов и гормонов (гиббереллинов и цитокининов, возможно и ауксинов (Casal, 2000). Фитохром также стимулирует прорастание семян, рост листьев, растяжение междоузлий, переход к цветению и другие эффекты. Также имеются некоторые данные об участии фитохромов в регуляции дыхания и окислительного фосфорилирования (Batschauer, 1998). Как было сказано выше, классическим примером фитохромного ответа является его реверсивность (активация КС и подавление ДКС). Существуют и другие виды фитохромных ответов. Например, при облучении КС низкой интенсивности, сохраняется соотношение Pr/Pfr, но реверсии при облучении ДКС не происходит, такой вид ответа был назван ответом с низкой интенсивностью облучения (very - low - fluence response - VLFR), при облучении же непрерывным КС высокой интенсивности, также не происходит » - фотореверсии при последующем облучении ДКС, такой вид фитохромного ответа был назван ответом с высокой интенсивностью падающего излучения (high - irradiance response - HIR) (Casal, 2000). Дальнейшие исследования по фитохромам позволили определить индивидуальные фитохромные ответы. Так, например, Shinomura с соавт., было показано, что phy А проявляет физиологическую реакцию под воздействием ДКС высокой интенсивности (HIR), а в опытах Hamazato с соавт., было показано, что phy В отвечает на КС — HIR (Hamazato F. et al., 1997). Тогда как мутанты no phy А и phy В отвечают на воздействие КС и ДКС из-за Ц присутствия phy С-Е. В некоторых исследованиях показана роль phy С в КС — зависимом росте листьев растений, а также КС-ингибировании удлинения гипокотиля. Мутанты же по phy D дефектны в ответе на КС, особенно если дополнительно присутствует мутация по phy В. Роль phy Е в физиологических ответах пока не выявлена (Casal, 2000).

Условия выращивания растений на белом свету

Определение различных групп фитогормонов - гиббереллинов, цитокининов (зеатина, рибозида зеатина, изопентениладенина), ИУК и АБК в зеленых" листьях томата проводили одновременно в 3 г. навески сырого растительного материала.

Растительный материал фиксировали жидким азотом. Листья заливали 96 % этанолом и гомогенизировали. Супернатант сливали и оставляли при температуре 4-6С. Оставшийся гомогенат для дальнейшей экстракции заливали 80% раствором этанола и оставляли на 2 часа при температуре 4-6С, помешивая. Эту операцию проделывали трижды. После этого гомогенат центрифугировали 10 мин при 10 тыс. оборотов/мин. Объединенный экстракт упаривали до водного остатка на роторном испарителе.

Полученный супернатант доводили дистиллированной водой до 15 мл и разделяли на три равные части, из которых затем выделяли ГА, ЦК, ИУК и АБК.

Выделение гиббереллинов проводили, подкисляя супернатант 10%-м раствором H2SO4 до рН 2-3 (Ложникова и др., 1973). Затем дважды экстрагировали этилацетатом (5 и 3 мл), отбирая каждый раз эфирную фазу, где содержались кислые гиббереллины. Объединенный экстракт упаривали досуха.

Для выделения связанных форм гиббереллинов использовали водную фракцию, оставшуюся после экстракции. Ее подвергали щелочному гидролизу, для чего доводили 10 %-м раствором NaOH до рН 9.-10 и помещали в кипящую водяную баню на 1 час. Охлажденный гидролизат подкисляли 10%-м H2SO4 раствором до рН 2-3 и вновь подвергали экстрагированию этилацетатом (5 и 3 мл). Эфирные экстракты объединяли, упаривали досуха. .

Для разделения гормонов использовали восходящую тонкослойную хроматографию (ТСХ). Сухие экстракты гормонов растворяли в 150 мкл 96 % этилового спирта и наносили на уровне старта хроматограммы одновременно со стандартными метчиками гормонов ГАз и ГАд ("Serva", Германия) на пластинки "Silufol-LTV-254" ("Kavalier", Чехия). Хроматографическое разделение проводили в системе растворителей хлороформ; этиловый эфир уксусной кислоты: уксусная кислота - 70:30:5 (Atzom, Weiler, 1983). Затем пластинки просматривали в УФ - лучах для идентификации зон гиббереллинов по положению метчиков и их флуоресценции. Учитывая, что ГАї, ГАз и изо-ГАз, а также ГА4, ГА7 и изо-ГА7 не разделяются и элюируются в виде общих зон (Обут и др.,1983), мы анализировали их смеси, которые соответственно обозначали как ГА t3 и ГА . Из второй части полученного супернатанта проводили выделение цитокининов, подщелачивая экстракт 10 %-м раствором NaOH до рН 8 и дважды экстрагируя н-бутанолом первоначально 4 мл, затем еще 3 мл (Негрецкий, 1988). Объединенный бутанольный экстракт упаривали досуха на роторном испарителе.

Разделение цитокининой осуществляли с помощью ТСХ. Сухой остаток растворяли в 150 мкл 96% этилового спирта. Хроматографию проводили в дистиллированной воде. В качестве метчиков использовали зеатин, рибозид зеатина и ИПА ("Sigma", США). Зоны на основной хроматограмме, соответствующие Rf зеатина, рибозида зеатина и ИПА использовали для количественного определения цитокининов. Из третьей части полученного супернатанта выделяли ИУК и АБК, подкисляя 10%-м раствором H2SO4 до рН 2-3 и дважды экстрагируя диэтиловым эфиром сначала Змл и затем еще 2 мл (Кефели, Турецкая, 1966). Объединенные эфирные фракции упаривали досуха. Для выделения связанных форм ИУК и АБК использовали водную фракцию, оставшуюся после экстракции свободных форм, подщелачивали 10%-м раствором NaOH до рН 11 и нагревали на водяной бане в течение 40 мин при температуре 60С.

Гормоны разделяли методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). Сухие экстракты растворяли в 150 мкл этилового спирта. Хроматографическое разделение проводили в системе растворителей этиловый эфир уксусной кислоты: хлороформ: уксусная кислота (100:100:1). Идентификацию веществ на хроматограмме проводили согласно положению метчиков ИУК ("Serva", Германия) и АБК ("Sigma", США), Хроматографические зоны, полученных после разделения гормонов ТСХ, элюировали 96% этанолом и использовали для количественного определения фитогормонов,

Количественное определение фитогормонов проводили твердофазным иммуноферментным анализом (ИФА). Анализ содержания цитокининов (3, РЗ, ИПА), ИУК и АБК проводили на полистероловых 96-луночных планшетах "Titertek", которые использовали в качестве сорбента (Кудоярова и др., 1989). Для определения цитокининов (3, РЗ, ИПА), ИУК и АБК использовали наборы для ИФА производства "Фармхиминвест", г. Уфа, для определения гиббереллинов использовали наборы производства ИЦиГ СО РАН, г. Новосибирск. Разведения конъюгатов и сывороток делали в соответствии с инструкциями (Холодарь и др., 1995).

В каждую лунку планшета вносили по 200 мкл ковалентно связанного с овальбумином конъюгата гормона (3, или РЗ, или ИУК, или АБК), разведенного на карбонатном буфере (табл. 2). Сенсибилизацию проводили 2 часа при температуре 37 С. После этого лунки освобождали от раствора, трижды промывали раствором фосфатного буфера (табл. 2). Затем во все лунки вносили по 40 мкл фосфатного буфера, содержащего бычий сывороточный альбумин (БСА), обозначаемый в дальнейшем как ФТБ (табл. 2). В нескольких лунках готовили 10 - кратные разведения стандарта гормона на 80 % этаноле (от 0,5 мкг до 5 нг/лунку) для калибровочной кривой. В остальные лунки приливали по 10 мкл метиллированного элюата, полученного после ТСХ, растворенного в 50 мкл 80 % этанола (опытные образцы,). Одну - две лунки оставляли без стандарта или образца (бесконкурентный вариант), в которые добавляли для равенства условий адсорбции по 10 мкл 80 % этанола. В последнюю очередь во все лунки вносили по 100 мкл иммунной кроличьей сыворотки, разведенной на ФТБ. Инкубировали планшеты в термостате при температуре 37С в течение 1 часа.

Особенности роста зараженных растений томата на белом свету

Интеграция ростовых и фотосинтетических процессов в растениях тесно связана с гормональной системой регуляции. Сложная система восприятия и передачи светового сигнала в растениях основана на тесном взаимодействии с различными группами фитогормонов (Ahmad, 1999; D Agostino, Kieber, 1999; Casal, 2000). Свет активирует ряд фоторецепторов, взаимодействующих с геномом посредством системы трансляции, который, в свою очередь, вовлекает определенные исполнительные механизмы, вызывает соответствующие морфологические реакции. На одном из этапов в эту цепь реакций включаются фитогормоны, и под влиянием преобразованной информации об изменении внешних условий происходит изменение гормонального обмена. Баланс между свободными стимуляторами и ингибиторами, с одной стороны, и соотношение свободных и связанных регуляторов, с другой, является основой гормональной регуляции всевозможных процессов жизнедеятельности в зависимости от внешних условий. (Mohr, 1962, 1987; Кефели, 1978, 1991; Johnston, 1982; Kohler, 1985).

В настоящее время относительно мало известно о роли АБК в регуляции роста листа и ее роли в развитии защитных реакций растений на проникновение патогена. В данной работе исследовали содержание АБК в листьях растений во всех вариантах освещения красным и синим участками спектра. В листьях всех исследуемых растений были обнаружены свободные и связанные формы АБК.

Облучение синим светом инфицированных восприимчивых и толерантных растений, индуцирует образование АБК свободных форм на протяжении всего патогенеза в 5 - 15 раз больше по сравнению с растениями, выращенными на красном свету (табл. 20, рис. 25). Тогда как на красном свету содержание этой группы АБК в восприимчивых и толерантных инфицированных растениях было высоким в течение всего периода болезни растений, по сравнению со здоровыми растениями, а также с растениями, выращиваемыми на синем участке спектра (табл. 20, рис.25).

Абсцизовой и жасмоновой кислотам приписывают разнообразные регуляторные функции, осуществляемые в ходе развития растений и при их защите от стрессов. Они могут быть эндогенными метаболитами, возникающими при воздействии различных внешних факторов, или веществами, способствующими приобретению устойчивости к патогенам (Пунева и др., 2000).

Содержание АБК связанных форм под воздействием различных участков спектра возрастало в течение всего патогенеза в зараженном восприимчивом генотипе, однако освещение синим светом, менее значительно увеличивало содержание этой формы гормона, и к 30 суткам патогенеза оно было ниже, чем на белом и красном свету в 2 - 3 раза (рис. 26). В здоровых растениях содержание этой группы фитогормонов было значительно ниже, чем в инфицированных растениях (рис.26). Устойчивые растения на досветку спектральным светом реагируют более быстро. Так, например, уже с 10 суток патогенеза заметно, что синий участок спектра вызывает значительное увеличение содержания АБК свободных форм, особенно в варианте инфицированных растений, в 2 раза по сравнению с контролем и в 12 раз по сравнению с растениями, выращенными при освещении красным светом (рис, 27). В здоровых устойчивых растениях на красном участке спектра уменьшается содержание АБК свободных форм в 2,2 раза по сравнению с зараженными растениями, АБК свободных форм остается в контрольных растениях на красном свету в следовых количествах к 30 суткам патогенеза (рис. 27). Содержание связанных форм АБК в листьях-зараженных растений Мо 464 на красном свету не отличается от содержания этой группы в листьях растений, выращенных на белом свету (табл. 21). Тогда как на синем свету происходит значительное накопление АБК связанных форм, особенно к 30 дню патогенеза оно увеличивается в 6 раз по сравнению с контролем (табл. 21).Эти данные по восприимчивым, толерантным и устойчивым растениям согласуются с данными, в которых было показано, что низкие концентрации АБК и жасмоновой кислоты приводят к стимуляции развития паразита в тканях растений, а высокие концентрации приводят к токсичному эффекту, подавляющему развитие патогена в клетках (Пунева и др., 2000). Также столь высокая концентрация АБК в листьях восприимчивых растений способствует высокой литической активности клеток, что в свою очередь обуславливает деградацию вирусных частиц и является важной составной частью активной противовирусной защиты растения (Реунов, 1989). На синем свету в здоровых растениях обнаруживается значительно большее количество ингибиторов роста (АБК и оксикоричных кислот), по сравнению с растениями, выращенными на красном и зеленом свету (Карначук и др., 1988). Возможно, синий участок спектра индуцирует накопление высокой концентрации АБК в листьях, что способствует развитию активной защитной реакции в неустойчивых растениях. В зараженных растениях может происходить изменение содержания эндогенных цитокининов и соотношения их свободных и связанных форм под действием различных участков спектра (Ладыгина, Бабоша, 1996; Шатило и др., 1997; Шакирова, 1999). Как в восприимчивых и толерантных, так и в устойчивых линиях томата были обнаружены цитокинины - зеатин (3), рибозид зеатина (РЗ) и изопентениладенин (ИЛА).

Похожие диссертации на Роль света в устойчивости растений томата к вирусу табачной мозаики

Роль света в устойчивости растений томата к вирусу табачной мозаикиКузнецова Евгения Николаевна

Влияние экспрессии гетерологичных генов хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов в трансгенных растениях томата (Solanum lycopersicum L.) на повышение их устойчивости к фитопатогенамХалилуев, Марат Рушанович

Генетическая трансформация растений томата геном preS2-S, кодирующим основной антиген оболочки вируса гепатита B, с целью получения кандидатной съедобной вакциныСтолбиков Алексей Сергеевич

Вирус мозаики коровьего гороха как вектор для получения рекомбинантных антигенов вирусов гепатита B и гриппа A в растенияхМещерякова Юлия Александровна

Изучение генетического разнообразия вируса мозаики турнепса и создание удвоенных гаплоидных линий Brassica - источников устойчивости к немуЗубарева, Ирина Александровна

Характеристика генетической изменчивости вируса мозаики цветной капусты (дальневосточные изоляты) и разработка методов его диагностики Богунов Юрий Васильевич

Изучение процесса аморфной агрегации белка оболочки вируса табачной мозаикиПанюков Юлий Валерьевич

Исследование взаимосвязи между биологическими свойствами и структурой белка оболочки вируса табачной мозаики Кошкина Татьяна Евгеньевна

Изучение механизмов термоиндуцированной аморфной агрегации на примере белка оболочки вируса табачной мозаики Рафикова Эльвира Рустамовна

Сборка трастузумаб (герцептин)-связывающих наночастиц вируса табачной мозаики в листьях : Nicotiana benthamianaПетруня, Игорь Валерьевич