Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13
1.1. Полициклические ароматические углеводороды как загрязнители окружающей среды 13
1.2. Деградация пау в окружающей среде 16
1.2.1. Биохимические пути деградации нафталина микроорганизмами 17
1.2.2. Биохимические пути деградации фенантрена микроорганизмами 18
1.3. Бактериальные генетические системы биодеградации ПАУ 20
1.3.1. Гены катаболизма ПАУ грамотрицательных бактерий 20
1.3.2. Гены катаболизма ПАУ грамположительных бактерий 23
1.4. Плазмиды биодеградации. характеристика систем репликации, наследования и переноса известных плазмид INCP-9 группы 23
1.5. Конъюгационныи перенос катаболических плазмид в модельных системах 29
1.5.1. Системы для изучения переноса катаболических плазмид и генов 29
1.5.1.1. Исследование горизонтального переноса катаболических плазмид в
почве 29
1.5.1.2. Перенос катаболических плазмид в жидких и полужидких средах 38
1.5.1.3. Исследование горизонтального переноса катаболических плазмид в присутствии растений 40
1.5.2. Подходы к мониторингу бактериальных штаммов (доноров, реципиентов и трансконъюгантов) и переноса катаболических плазмид 41
1.5.2.1. Морфология колоний бактерий, ауксотрофность, репортерные гены флюоресценции и люминесценции 41
1.5.2.2. Использование индикаторных агаризованных сред 42
1.5.2.3. Антибиотикорезистентность 42
1.5.2.4. Визуализация плазмид, ПЦР и гибридизация 44
1.5.2.5. Мониторинг переноса плазмид с использованием селективных катаболических признаков 45
1.5.2.6. Косвенный мониторинг переноса катаболических плазмид 46
1.5.3. Влияние различных факторов на перенос катаболических плазмид и деградацию поллютантов 47
1.5.3.1. Наличие селективного давления 47
1.5.3.2. Влияние типа почвы на перенос плазмид 49
1.5.3.3. Наличие питательных веществ 51
1.5.3.4. «Горячие пятна» переноса плазмид (участки с благоприятствующими 52 плазмидному переносу условиями)
1.5.3.5. Эффект влажности при горизонтальном переносе катаболических плазмид 53
1.5.3.6. Температура как один из факторов, влияющих на плазмидный перенос 54
1.5.3.7. Выбор донорного штамма 54
1.5.3.8. Наличие филлосферы и ризосферы (листвы и корневой системы растений) 54
1.5.3.9. Присутствие почвенной биоты и перенос плазмид 55
1.6. Катаболические неплазмидные мобильные генетические элементы 56
1.6.1. Транспозоны 56
1.6.2. Геномные острова 59
1.6.3. Горизонтальный перенос катаболических неплазмидных МГЭ 61
1.7. Исследование биодеградации ПАУ 63
1.7.1. Биодеградация ПАУ в лабораторных условиях 68
1.7.2. Полевые и пилотные исследования биодеградации ПАУ 70
1.7.3. Увеличение скорости и степени деградации ПАУ 71
1.7.3.1. Способы повышения биодоступности ПАУ 71
1.7.3.2. Стимуляция метаболической активности микроорганизмов-деструкторов 73 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 75
2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды 75
2.2. Среды, источники углерода и антибиотики 77
2.3. Выделение бактериальных штаммов из почвенных образцов 78
2.4. Трансформация клеток Е. соїі плазмидной ДНК 78
2.5. Коньюгационный перенос бактериальных плазмид 78
2.6. Выделение плазмидной ДНК 79
2.7. Визуализация плазмидной ДНК 79
2.8. Определение влагоемкости почвы 80
2.9. Приготовление модельных почвенных систем 80
2.10. Внесение инокулята в почву 80
2.11. Отбор проб 80
2.12. Экстракция нафталина из почвенных образцов 81
2.13. Определение концентрации нафталина в почвенных экстрактах 81 2Л4. Определение содержания салицилата в культуралыюй жидкости 81
2.15. Мониторинг маркированных плазмидосодержащих штаммов-деструкторов в процессе деградации нафталина в почве 82
2.16. Определение активностей ключевых ферментов биодеградации нафталина 82
2.17. Определение концентрации белка 83
2.18. Определение стабильности признаков утилизации нафталина и салицилата 83
2.19. Выделение тотальной ДНК бактериальных штаммов 84
2.20. Полимеразная цепная реакция 84
2.21. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции 85
2.22. Рестрикционный анализ амплифицированной рибосомальной ДНК 85
2.23. Устройство экспериментального открытого биореактора 85
2.24. Подготовка инокулята для биореактора 87
2.25. Мониторинг штаммов-деструкторов в культуралыюй среде 87
2.26. Определение остаточного содержания нефти и нефтепродуктов в культуральной среде
3. РЕЗУЛЬТАТЫ 89
3.1. Конструирование маркированных штаммов-деструкторов P. putida KT2442(pNF142::TnMx/-OTc) и P. putida BS394(pNF142::TnMod-OTc) 89
3.2. Определение удельной скорости роста штаммов-деструкторов на нафталине 90
3.3. Стабильность признаков биодеградации и резистентности, контролируемых плазмидой pNF142::TnMod-OTc 90
3.4. Горизонтальный перенос плазмид биодеградации нафталина в лабораторных условиях 91
3.4.1. Характеристика аборигенных деструкторов нафталина 92
3.4.2. Динамика общей численности микроорганизмов и бактерий-деструкторов нафталина в модельной почве 94
3.4.3. Динамика убыли нафталина в почве и горизонтальный перенос плазмид биодеградации в бактериальных популяциях 95
3.4.4. Оценка активности ключевых ферментов катаболизма нафталина бактерий-деструкторов 98
3.5. Горизонтальный перенос плазмид биодеградации нафталина в почве в открытой окружающей среде 102
3.5.1. Мониторинг интродуцированных маркированных бесплазмидных и плазмидосодержащих штаммов, их выживаемости и конкурентоспособности в открытой окружающей среде 102
3.5.2. Горизонтальный перенос плазмид биодеградации в почвенных микробных популяциях 105
3.6. Горизонтальный перенос плазмиды биодеградации нафталина в открытом биореакторе с протоком нефти и дизельного топлива 106
3.6.1 Характеристика аборигенных деструкторов нафталина 106
3.6.2. Динамика общей численности микроорганизмов и бактерий-деструкторов в биореакторе 108
3.6.3. Деструкция дизельного топлива и нефти в биореакторе 109
3.6.4. Горизонтальный перенос катаболической плазмиды в проточном биореакторе
3.7. Разработка метода для оценки эффективности биодеградации нафталина 111
штаммами-деструкторами в модельных почвенных системах
4. ОБСУЖДЕНИЕ 121
ВЫВОДЫ 139
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 140
- Полициклические ароматические углеводороды как загрязнители окружающей среды
- Бактериальные штаммы и плазмиды
- Конструирование маркированных штаммов-деструкторов P. putida
Введение к работе
В процессе деятельности человека производится множество искусственных и синтетических соединений, которые попадают в окружающую среду вследствие аварийных выбросов, разливов и непосредственно в виде отходов. Селективный пресс в участках хронического загрязнения (очистные сооружения городов, территории индустриальных производств, включая шламонакопители и отстойники, места добычи полезных ископаемых) способствует обмену генов биодеградации и резистентности к антибиотикам и тяжелым металлам между микроорганизмами.
С массовым применением антибиотиков и, как следствие, эволюцией бактериальной антибиотикорезистентности ученые начали изучать механизмы, ответственные за приспособление микроорганизмов к действию лекарственных препаратов. Сейчас исследователи склоняются к мнению, что скорость распространения антибиотикорезистентности с помощью внехромосомных элементов наследственности (мобильных генетических элементов [МГЭ], включая R-плазмиды) превышает скорость эволюции резистентности в ходе мутаций и обеспечивает реципиента готовым набором эволюционировавших ранее генов устойчивости (Top et al., 2002; van der Meer et al., 1992). Кроме того, детерминанты резистентности в составе МГЭ, таких как транспозоны, геномные острова, обеспечивают возникновение резистентности в хозяевах, в которых плазмида может не реплицироваться. Мобильные генетические элементы и R-плазмиды, ответственные за распространение антибиотикорезистентности, представляют собой негативный фактор, который необходимо учитывать при разработке стратегии химиотерапии.
К концу XX века возник интерес к переносу между штаммами микроорганизмов катаболических генов, ответственных за деградацию ксенобиотиков. Было показано, что микроорганизмы-деструкторы способны эффективно утилизировать поллютанты, особенно в случае невозможности использования иных методов сбора и утилизации загрязнителя. Катаболические плазмиды, кодирующие целые биохимические пути биодеградации, а также МГЭ, способные повышать эффективность штаммов-деструкторов за счет приобретения ими новых катаболических способностей, являются в данном случае позитивным
9,./ фактором, который при продуманном использовании может способствовать решению ряда экологических проблем.
В обычной биоремедиации в процессе микробной утилизации поллютантов принципиальное значение имеют выживаемость и конкурентоспособность микроорганизмов-деструкторов, интродуцируемых в участок загрязнения in situ. Использование катаболических генов является перспективным направлением биоремедиации, поскольку даже в том случае, если интродуценты неконкурентоспособны и постепенно элиминируются, тем не менее, они могут быть донорами генов биодеградации вследствие конъюгационного переноса плазмид. Возможен другой путь распространения генов биодеградации: клетка-хозяин погибает и лизируется, после чего катаболические плазмиды и МГЭ попадают в окружающую среду и при контакте с подходящим новым хозяином путем трансформации могут встраиваться в геном микробной клетки. Интродуцированные конъюгативные плазмиды биодеградации в местах загрязнения могут также пополнять плазмидный пул. Например, плазмида может реплицироваться и в клетках микроорганизмов, в которых не наблюдается функциональной экспрессии генов биодеградации. Такие микроорганизмы могут быть донорами катаболических плазмид, что обеспечит дальнейшее распространение генов биодеградации в смешанных микробных популяциях. Рядом авторов (Hogan et al., 1997; Saboo and Gealt, 1998; Jesenska et al., 2002) было показано наличие неэкспрессирующихся генов биодеградации в грамположительных бактериях. Известны плазмиды-космополиты с широким кругом хозяев, относящиеся к 1псР-1 и 1псР-4 группам, причем в первую группу входят и катаболические плазмиды, например, широко известные плазмиды биодеградации 2,4-дихлорфеноксиацетата pJP4 (Don and Pemberton, 1981), pBRC60 (Di Gioia et al., 1998) и др.
Известно, что полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) представляют класс опасных и устойчивых загрязнителей окружающей среды. Хотя снижение содержания ПАУ в окружающей среде возможно за счет абиотических процессов, ключевая роль в процессе деструкции ПАУ принадлежит микроорганизмам. У грамотрицательных микроорганизмов гены биодеградации ПАУ часто локализованы на конъюгативных плазмидах. Таким образом, исследование горизонтального переноса плазмид, в частности, плазмид биодеградации ПАУ, представляется весьма актуальным, а необходимость
10 изучения роли катаболических плазмид в процессах биодеградации загрязнителей окружающей среды не вызывает сомнений.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы являлось изучение горизонтального переноса катаболических плазмид между микроорганизмами в проточном биореакторе и почве в лабораторных и полевых условиях и исследование его роли в процессе биодеградации ПАУ (на примере нафталина как модельного субстрата). В соответствии с целью работы были определены следующие конкретные задачи:
Конструирование маркированных штаммов - деструкторов, содержащих меченые плазмиды биодеградации нафталина с использованием мини-транспозонов, изучение фенотипической стабильности и ростовых параметров сконструированных маркированных штаммов.
Исследование выживаемости и конкурентоспособности интродуцированных маркированных плазмидосодержащих штаммов и деградативного потенциала аборигенных микроорганизмов-деструкторов в лабораторных и полевых условиях.
Мониторинг горизонтального переноса меченых плазмид биодеградации
нафталина между микроорганизмами в почве в лабораторных условиях, открытой окружающей среде, а также в проточном биореакторе с подачей дизельного топлива и нефти в качестве ростовых субстратов.
Разработка метода для определения эффективности биодеградации ПАУ штаммами-деструкторами в почве.
Оценка эффективности процесса биодеградации нафталина, осуществляемого различными штаммами родов Pseudomonas и Burkholderia с использованием модельных почвенных систем.
Научная новизна
Сконструированы маркированные плазмидосодержащие штаммы -деструкторы ПАУ для изучения горизонтального переноса плазмид биодеградации в смешанных микробных популяциях, исследована их выживаемость и конкурентоспособность при интродукции в почву в лабораторных и полевых условиях.
Выделены и охарактеризованы новые плазмиды биодеградации нафталина рАР4, рАР5, рАР35, рАРЗб, pBS3950. Горизонтальный перенос меченых
катаболических плазмид из интродуцированных штаммов в аборигенные происходил в лабораторных и полевых условиях, однако перенос аборигенных плазмид биодеградации ПАУ в интродуцированный штамм-реципиент был обнаружен только в лабораторном эксперименте. Показано, что интродукция бесплазмидного лабораторного штамма в модельную почву и естественный горизонтальный перенос в него аборигенных катаболических плазмид могут создавать условия для ускорения деструкции нафталина в почве. Аборигенные трансконъюгантные штаммы, получившие меченую плазмиду pNF142::TnMoc/-OTc в условиях открытой окружающей среды, принадлежали к роду Pseudomonas, ряд из них был близок к видам P. putida, P. lini, P. frederiksbergensis, P. jessenii, Р. graminis и P. alcaligenes. Таким образом, выявлен широкий спектр аборигенных микроорганизмов рода Pseudomonas, в которые возможен перенос и экспрессия катаболических плазмид. Предложен новый метод, позволяющий сравнить и выбрать наиболее активные штаммы-деструкторы, перспективные для биоремедиации загрязненных ПАУ территорий, который основан на определении значений основных кинетических параметров микробного роста и утилизации ПАУ. Разработана математическая модель, описывающая рост бактерий и потребление ими субстратов (нафталин, его производные и органические вещества почвы) в модельных почвенных системах. С помощью предложенного метода проведено сравнение эффективности процесса биодеградации нафталина различными штаммами родов Pseudomonas и Burkholderia и выявлен наиболее эффективный штамм-деструктор P. putida ВКМ В-2380Д.
Научно-практическая значимость работы
Полученные в работе результаты по изучению горизонтального переноса плазмид деградации нафталина в модельных почвенных системах и открытой окружающей среде создают предпосылки для дальнейших более детальных исследований горизонтального переноса катаболических генов и плазмид и роли переноса генов в микробной деструкции ПАУ с более высоким молекулярным весом.
В лабораторных условиях показано, что перенос аборигенных катаболических плазмид из почвенных бактерий в подходящий реципиентный штамм создает условия, способствующие ускорению процессов очистки почвы от ПАУ.
Выдвинуто предположение, что плазмидный перенос в обратном направлении, из интродуцированного штамма-донора в аборигенный бактериальный реципиент, также может быть эффективным при осуществлении биоремедиации участков, загрязненных ПАУ.
Предложенный метод для оценки эффективности процесса биодеградации ПАУ с использованием разработанной математической модели может быть применен для выбора наиболее активных штаммов-деструкторов, перспективных для использования в биотехнологии защиты окружающей среды.
Обнаружение природных плазмид биодеградации в исследуемых штаммах-деструкторах нафталина предполагает их дальнейшее исследование, направленное на выяснение закономерностей структурно-функциональной организации генетических систем биодеградации ПАУ.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на 7-9-й школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2003-2004), международных съездах и конференциях: The First FEMS Congress of European Microbiologists (Ljubljana, 2003), Plasmid Biology 2004: International Symposium on molecular biology of bacterial plasmids and other mobile genetic elements (Kanoni, 2004), Conference "Pseudomonas 2005" (Marseille, 2005), 13-th International Biodeterioration and Biodegradation Symposium (Madrid, 2005).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 2 статьи, заявка на получение патента РФ на изобретение и 9 тезисов.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на 163 страницах машинописного текста, включает 8 таблиц и 25 рисунков. Библиография насчитывает 231 наименование, из них 21 отечественная и 210 зарубежных работ.
Полициклические ароматические углеводороды как загрязнители окружающей среды
Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) являются группой широко распространенных гидрофобных соединений (Рис. 1), состоящих из нескольких бензольных колец в линейном, угловом или кластерном расположении, которые в местах примыкания имеют общую пару атомов углерода (Клар, 1971; Ровинский и др., 1988) осуществляемых человеком (транспортировки и переработки нефти, торфа и угля, в качестве продуктов сгорания автомобильного топлива и сжигаемого бытового и промышленного мусора, при утилизации отходов коксо-, нефтехимического и газоперерабатывающего производств).
Механизм образования ПАУ в процессе сгорания - комплексный процесс, происходящий в результате деполимеризации углеводородных фрагментов, которые формируются в результате крекинга больших молекул. Такой процесс реполимеризации обычно происходит в условиях неполного сгорания топлива, когда с уменьшением концентрации кислорода увеличивается содержание ПАУ (Sutherland et al„ 1995).
Несмотря на то, что концентрация ПАУ в воздухе составляет 0,1% от содержащихся в воздухе загрязнителей, этой проблеме уделяется особое влияние, так как многие из них относятся к классу канцерогенов и мутагенов, что было подтверждено в опытах на животных (IARC, 1983).
В воздухе часть ПАУ подвергается абиотической деградации вследствие взаимодействия со свободными радикалами, другая часть адсорбируется на пылевых частицах и осаждается на поверхности почвы. Адсорбированные на частичках пыли ПАУ образуют аэрозоли, которые при вдыхании оказывают негативное влияние на здоровье человека. Проблема загрязнения воздуха такими соединениями стоит остро для многих крупных городов и промышленных центров (Jones et al., 1989; Sutherland et al., 1995).
В последнее время очень серьезную проблему представляет загрязнение ПАУ водных систем. Использование креозота (основными компонентами которого являются нафталин, фенаитрен, антрацен, хризен) в судоремонтных работах приводит к накоплению его компонентов в организме морских моллюсков и ракообразных. Отлов ракообразных в некоторых районах Атлантического побережья Канады был прекращен из-за накопления высоких концентраций ПАУ в их организме (Sutherland et al., 1995). Накопление ПАУ в морских акваториях вызывает образование опухолей у рыб и неблагоприятно сказывается на популяциях их многих ценных видов (Sutherland et al., 1995).
Источниками поступления ПАУ в осадочные породы и почвы помимо упомянутых природных и техногенных процессов могут служить ароматические соединения лигнина, детрита, биогенные пигменты и другие органические остатки, а также гумусовые вещества (Blumer, 1976; Ровинский и др., 1988; Геннадиев и др., 1996; Pothuluri and Cerniglia, 1994).
Из-за низкой растворимости техногенные ПАУ практически не способны мигрировать в почве (Чернянский и др., 2001), накапливаясь в нескольких сантиметрах верхнего слоя почвы. Установлено, что молекулы ПАУ находятся в основном в состоянии поглощения поверхностями минеральных и органо-минеральных коллоидов (Ровинский и др., 1988; Геннадиев и др., 1996).
При изучении горно-луговых почв разной степени развитости и возраста профиля установлено, что в почве с высоким содержанием органического вещества суммарное содержание ПАУ в 4-20 раз выше по сравнению с почвой, бедной органикой. С увеличением возраста почв повышается содержание в них ПАУ и изменяется их качественный состав (Геннадиев и др., 1996). В молодой почве (возраст около 100 лет) были обнаружены только относительно простые трехядерные молекулы флуорена. В среднеразвитой почве возраста около 300 лет отмечено большое количество различных ПАУ (флуорен, фенантрен, аценафтен, тетрафен, хризен, антрацен, нафталин, пирен и 3,4-бензпирен). В развитой почве (возраст около 1000 лет) наблюдалось высокое суммарное содержание ПАУ, но менее разнообразный индивидуальный состав по сравнению со среднеразвитой почвой (пяти- и шестиядерные соединения и 1,12-бензперилен).
При изучении чернозема на основании аккумуляции 4-7-ядерных полиаренов в верхнем 10-см слое почвы (Геннадиев и др., 1996) сделан вывод о преимущественно техногенном происхождении тяжелых многоядерных молекул ПАУ.
Бактериальные штаммы и плазмиды
В работе использованы штаммы бактерий, выделенные из почвенных образцов, загрязненных нефтепродуктами и отходами коксохимического производства, с территории Московской области (табл. 4). В работе также использовали штаммы Pseudomonas putida из коллекции лаборатории биологии плазмид Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино. Штамм Pseudomonas putida КТ2442 любезно предоставлен доктором Корнелией Смаллой, штамм P. putida G7(NAH7) получен от И. Гунзалуса, США.
Настоящая работа
Способность к росту: Nah+ - на нафталине, Gnt+ - гентизиновой кислоте, Phn+ -фенантрене, Нпа+ - 1-гидрокси-2-нафтойной кислоте, Ant+ - антрацене, Nph+ - нефти Gfp+ - наличие зеленого флюоресцирующего белка, Cys - ауксотрофность по цистеину; резистентность к антибиотикам: Ктг - канамицину, Naf - налидиксовой кислоте, Rif -рифампицину, Smr- стрептомицину, Тсг- тетрациклину, Nbr - новобиоцину
Среды, источники углерода и антибиотики
Бактерии выращивали на бульоне Лурия-Бертани (LB, Carhart, Hegeman, 1975), содержащем (в %): бакто-триптон («Difco» , США) - 1,0; дрожжевой экстракт («Difco», США) - 0,5; NaCl - 1,0.
Штаммы P. putida и неидентифицированные штаммы выращивали при 30С и 24С в течение суток на полноценных средах и трех-пяти суток на минимальных или селективных средах.
В качестве минимальной среды использовали среду Эванса (Evans, 1970) следующего состава (г, мл/л): К2НРО4 -8,71 г, 5М р-р NH4C1 - 1мл, 0,1 М р-р Na2S04 - 1 мл, 62 мМ р-р MgCl2 - 1мл, 1мМ р-р СаС12 - 1мл, 0,005 мМ р-р (NH4)6Mo7024x4H20 - 1 мл, микроэлементы - 1 мл, рН 7,0. Состав раствора микроэлементов в 1% НС1, (г/л): ZnO - 0,41, FeCl2x6H20 - 5,4, MnCl2x4H20 - 2,00, CuCl2x2H20 - 0,17, СоС12х6Н20 - 0,48, Н3В03 - 0,06. Для получения агаризованной среды добавляли 2% (вес/объем) агара («Difco», США).
В качестве источников углерода использовали нафталин, салицилат натрия, 2-метилнафталин, дизельное топливо, нефть в концентрации 0,1-0,2%. При выращивании бактерий на агаризованной среде нафталин и дизельное топливо вносили на крышку чашки Петри. При культивировании микроорганизмов в жидкой среде нафталин добавляли в виде пудры в концентрации 0,2-0,5 г/л.
Конечная концентрация антибиотиков в селективных средах составляла (мкг/мл): Тс (тетрациклин) - 10, 20, 50, Sm (стрептомицин) - 100, Km (канамицин)- 20, 50, 100, Gm (гентамицин) -20, Rif (рифампицин) - 100, Nb (новобиоцин) - 50, 100.
Выделение бактериальных штаммов из почвенных образцов
Накопительные культуры инкубировали в жидкой среде Эванса с добавлением нафталина в качестве единственного источника углерода и энергии. Культивирование проводили в периодических условиях при температуре 24С в течение 3-5 дней. Чистые культуры выделяли на агаризованной среде Эванса в парах нафталина.
Принадлежность бактерий к грамположительным или грамотрицательным определяли при помощи экспресс-метода с использованием 3% (вес/объем) раствора КОН (Gregersen, 1978).
Для выделения бактерий, принадлежащих к роду Pseudomonas, была использована среда Pseudomonas isolation agar Р («Difco», США) (Stolp and Gadkari, 1981).
Конструирование маркированных штаммов-деструкторов P. putida
С целью получения маркированного штамма P. putida КТ2442 (pNF 142 "TnMod-OTc) штамм Е. coli SI7-1 был трансформирован плазмидной ДНК pTnMod-OTc, содержащей мини-транспозон TnMod-OTc. Путем конъюгации плазмиду рТпМэйЮТс из штамма E.coli S17-1 перенесли в штамм Pseudomonas sp. 142NF, содержащий плазмиду биодеградации нафталина pNF142, в которую произошла инсерция гена резистентности к тетрациклину (Рис. 6). Был получен единственный клон Pseudomonas sp. 142NF Nah+ Тсг, который был использован в качестве донора в скрещиваниях с P. putida КТ2442 gfp (селекция - Nah, Тс, контрселекция - Km). В результате было отобрано 8 трансконъюгантных клонов P. putida КТ2442 с фенотипом Nah+ Tcr Kmr Gfp+, что свидетельствовало о встройке мини-транспозона TnMod-OTc в плазмиду -меченая мини-трапепозоном плазми; pNF142::TnMo /-OTc =з -репортерныегены — флюоресценции //;] резистентности кканамицину обнаруживался путем высева на агаризованпую среду LB: колонии давали характерное зеленое свечение в ультрафиолетовом свете (длина волны 254 им), обусловленное флюоресцирующим белком. Кроме того, он обладал хромосомными генами резистентности к рифампицину и канамицину.
Плазмиду pNF142::TnM?J-OTc из штамма P. putida KT2442(pNF142::TnMw/-ОТс) перенесли путем конъюгационного переноса в ауксотрофный штамм P. putida В S3 94, после чего он приобрел способность к росту на нафталине и резистентность к тетрациклину.
Определение удельной скорости роста штаммов-деструкторов на нафталине
В работе исследовали максимальную удельную скорость роста на нафталине в жидкой минеральной среде природных штаммов Pseudomonas sp. 142NF(pNF142) и P. putida G7(NAH7) и сконструированных трансконъюгантных штаммов P. putida BS394(pNF142::TnMoJ-OTc), KT2442(pNF142::TnMorf-OTc) (клоны 5 и 8) и КТ2442, содержащего плазмиду биодеградации нафталина pBS216. Как видно из данных рисунка 7, сконструированные штаммы BS394(pNF142::TnM)cf-OTc) и P. putida KT2442(pNF142::TnMod-OTc)ioioH 8 имели значения imax, близкие к максимальной удельной скорости роста природного изолята - штамма Pseudomonas sp. 142NF(pNF 142).
Максимальная удельная скорость роста трансконьюгантного штамма Р. putida KT2442(pNF142::TnM?d-OTc) клон 5 (цтах =0,75 ч 1) почти в два раза превышала таковую природного штамма Pseudomonas sp. 142NF(pNF142) (цтах = 0,46 ч"1). В дальнейшей работе был использован штамм P. putida KT2442(pNF142::TnMoJ-OTc) клон 5.
Стабильность признаков биодеградации и резистентности, контролируемых плазмидой pNF142::TnMoflf-OTc
Сконструированные штаммы P. putida BS394(pNF142::TnM» -OTc) и KT2442pNF142::TnM?J-OTc) стабильно сохраняли способность к росту на нафталине, 2-метилнафталине и салицилате и не теряли устойчивость к тетрациклину после 10 ежедневных последовательных пересевов в неселективных условиях в жидкой среде LB.
Горизонтальный перенос плазмид биодеградации нафталина в лабораторных условиях
Изучение процесса горизонтального переноса катаболических плазмид, популяционной динамики штаммов-деструкторов и биодеградации нафталина в почве проводили в лабораторных микрокосмах по следующей схеме (Рис. 8). Для оценки испарения и абиотической деградации нафталина использовали микрокосм 1, содержащий стерильную почву. Вклад аборигенных микроорганизмов в деградацию оценивали по убыли нафталина в микрокосме 2, содержащем нестерильную почву. Исследования популяционной динамики микроорганизмов и горизонтального переноса катаболических плазмид проводили в микрокосмах 3-5. Численность интродуцированных и аборигенных бактерий-деструкторов нафталина в начале эксперимента составляла 2,0-4,0x104 и 1,3x104 КОЕ/г сухой почвы, соответственно (около 3,2-6,2% и 2,1% от общей численности почвенных микроорганизмов).
