Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. 13
1.1. Кольский залив в экологической и социально-экономической проблематике Баренц-региона.
1.2. Климатические характеристики Кольского залива. 18
1.3. История научных исследований Кольского залива. 24
1.4. ОЧБ в водных экосистемах. 27
1.5. Евтрофные и олиготрофные бактерии, как основные группы 29 гетеротрофного бактериопланктона.
1.6. Состав и свойства нефти. Характеристика физико-химических процессов ее разрушения в морских экосистемах.
1.7. Биогенные источники УВ в море, 41
1.8. Распространение УВ-окисляющих микроорганизмов в море. 42
1.9. Факторы, влияющие на скорость биодеградации нефти в море. 46
1.10. УВ-окисляющая активность микроорганизмов в морских водах (по данным натурных измерений).
1.11. Влияние нефти и ее продуктов на морские водоросли. 56
1.12. Влияние макрофитов на процессы разрушения нефти. 58
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ. 64
2.1. Район проведения исследований. 64
2.2. Отбор проб. 67
2.3. Определение ОЧБ. 68
2.3.1. Определение числа бактерий методом прямой микроскопии. 68
2.4. Определение наиболее вероятного числа микроорганизмов МПР. 68
2.5. Определение числа евтрофных микроорганизмов методом 69
глубинного посева и посева на поверхность плотной питательной среды.
2.6. Определение численности УВ-окисляющих 70
(углеводородустойчивых) и олиготрофных микроорганизмов методом
посева на поверхность плотной питательной среды
2.7. Определение таксономической принадлежности УВ-окисляющих микроорганизмов.
2.7.1. Выделение чистых культур УВ-окисляющих микроорганизмов. 71
2.7.2. Идентификация чистых культур УВ-окисляющих бактерий. 71
2.7.3. Изучение культуральных свойств микроорганизмов. 72
2.7.4. Изучение морфологических свойств микроорганизмов. 72
2.7.4.1. Микобактериальные формы 73
2.7.4.2. Палочки 74
2.7.4.3. Кокки 75
2.7.5. Изучение биохимических свойств микроорганизмов. 76
2.7.5.1. Определение утилизации углеводов и многоатомных спиртов. 77
2.7.5.2. Определение уреазной активности. 77
2.7.5.3. Определение фермента каталазы. 77
2.7.5.4. Определение желатиназной активности. 78
2.7.5.5. Реакция с метиленовым красным (определение феномена Кларка).
2.8. Определение скорости минерализации микроорганизмами 14С- октздекана с поглощением 4С02 бумагой-абсорбентом, пропитанной раствором щелочи.
2.9. Химический анализ морских вод. 82
2.10. Определение метеорологических показателей в районах микробиологических наблюдений.
2.11. Статистический анализ данных. 83
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. 84
3.1. Гидрохимические показатели. 84
3.2. Сравнительный анализ наиболее распространенных методов 88
количественного учета гетеротрофного бактериопланктона и гетеротрофных эпифитных бактерий литорали Кольского залива.
3.2.1. Евтрофные бактерии. 89
3.2.2. Олиготрофные бактерии. 95
3.2.3. УВ-окисляющие бактерии. 100
3.3. Влияние температуры инкубации на конечные результаты учета численности гетеротрофных бактерий по посеву.
3.3.1. Евтрофные бактерии. 105
3.3.2. Олиготрофные бактерии. 110
3.3.3. УВ-окислягощие бактерии. 113
3.4 Сезонная динамика численности планктонных бактерий различных 118 групп.
3.4.1. Евтрофные бактерии. 118
3.4.2. Олиготрофные бактерии. 119
3.4.3. УВ-окисляющие бактерии. 123
3.5. Сезонная динамика численности эпифитных бактерий различных 127
групп.
3.5.1. Евтрофные бактерии. 127
3.5.2. Олиготрофные бактерии. 128
3.5.3. УВ-окисляющие бактерии. 132
3.6. Сезонная динамика общей численности планктонных и эпифитных бактерий.
3.7. УВ-окисляющая активность гетеротрофного бактериопланктона в воде и в зарослях макрофитов.
3.8. Таксономический состав планктонных УВ-окисляющи микроорганизмов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ. 153
ВЫВОДЫ. 155
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ. 158
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ. 160
Приложение 1. 192
Приложение 2. 193
Приложение 3. 194
- Кольский залив в экологической и социально-экономической проблематике Баренц-региона.
- Район проведения исследований.
- Гидрохимические показатели.
Введение к работе
Ведущую роль в круговороте органического вещества в водных экосистемах играют гетеротрофные бактерии. Изучение экологии и функционирования гетеротрофных бактериоценозов в водных экосистемах в т.ч. и мониторинг последних, обычно связывают с исследованием в них как общей численности микроорганизмов по прямому счету, так и численности по посеву евтрофных и, значительно реже, олиготрофных бактерий. Однако последние широко распространены в морских водах и их игнорирование ведет к недоучету численности гетеротрофных микроорганизмов, способных к росту на питательных средах. Кроме того, большинство имеющихся сведений о гетеротрофных бактериоценозах северных морей получены в летний сезон, данные о сезонной изменчивости их численности и состава весьма немногочислены.
В северных морях в целом и в Кольском заливе в частности, одними из наиболее распространенных загрязнителей являются нефтяные углеводороды (НУ). Поэтому дополнительно к группам евтрофных и олиготрофных бактерий необходим учет и углеводородокисляющих (УВ-окисляющих) микроорганизмов. Известно, что на литорали северных морей широко распространены заросли макрофитов. Они способны стимулировать процессы естественного очищения морской среды от НУ и в этом участвуют обитающие на их талломах эпифитные гетеротрофные микроорганизмы. Однако, численность и состав последних в морских акваториях мало исследованы. Отсутствуют и единые обоснованные методики учета численности по посеву планктонных и эпифитных гетеротрофных бактерий, пригодные для использования в условиях северных морей.
Любое мониторинговое исследование, в т.ч. и загрязненных НУ акваторий, обычно содержит не только оценку их текущего состояния, но и прогноз его на будущее. Для этого в случае загрязнения акватории НУ необходимо знать не только численность УВ-окисляющих микроорганизмов, но и их вклад в процессы естественного очищения, то есть скорость микробиологического разрушения НУ. Однако для северных морей этот вопрос недостаточно изучен. Имеющиеся оценки скоростей биодеградации основанные, главным образом, на данных лабораторных экспериментов с чистыми культурами, получены в условиях, далеких от натурных, и поэтому мало пригодны для прогностических расчетов.
Цели и задачи работы.
Целью работы было изучение структуры и состава планктонных и эпифитных гетеротрофных бактериоценозов литорали Кольского залива и их роли в процессах естественного очищения вод данной акватории от НУ.
В соответствии с этим в работе были поставлены следующие задачи:
Провести сравнение существующих методов учета численности морских гетеротрофных бактерий (ЧГБ) на жидких и плотных питательных средах и разработать единый методический подход для учета численности планктонных и эпифитных бактерий в водах Кольского залива.
Исследовать сезонную изменчивость общей численности бактерий (ОЧБ) по прямому счету, а также численности евтрофных, олиготрофных и УВ-окисляющих бактерий по посеву в пробах воды и макрофитов, отобранных на двух станциях, расположенных в кутовой и центральной частях залива.
Оценить при помощи радиоуглеродного метода потенциальную углеводород окисляющую (УВ-окисляющую) активность бактериопланктона экосистемы литорали (в зарослях макрофитов и вдали от них) при температурах in situ и дать оценку ее состоянию;
Определить таксономическую принадлежность УВ-окисляющих микроорганизмов, выделенных из вод литорали Кольского залива;
Разработать рекомендации по выделению и идентификации наиболее характерных для Кольского залива УВ-окисляющих микроорганизмов.
Научная новизна и значимость работы.
Впервые разработан единый методологический подход для учета численности жизнеспособных гетеротрофных бактерий отдельных физиологических групп (евтрофных, олиготрофных и У В-окисляющих) в различные сезоны года, как в водах литорали Кольского залива, так и на поверхности талломов обитающих здесь водорослей-макрофитов.
На основе разработанных методик получены данные о распределении гетеротрофного бактериопланктона в целом и его отдельных групп в воде и на поверхности талломов макрофитов литорали Кольского залива на двух станциях, в разной степени подверженных антропогенному влиянию. Установлена сезонная изменчивость обилия гетеротрофных бактериоценозов данных местообитаний и дана оценка их состояния. Получены количественные данные о сезонной динамике УВ-окисляющей активности гетеротрофного бактериопланктона в зарослях макрофитов и вдали от них. Впервые изучены сезонные изменения таксономического состава УВ-окисляющих бактерий, выделенных из вод литорали Кольского залива, проведен сравнительный анализ их распределения и установлены доминирующие группы.
Практическая ценность работы.
Разработанный нами единый методический подход позволяет наиболее полно, по сравнению с существующими методами, учитывать ЧГБ, как в водах северных морей, так и на поверхности макрофитов. Он может быть рекомендован для проведения гидробиологического мониторинга северных морей. Это же касается и предложенных нами практических рекомендаций по выявлению, определению и идентификации У В-окисляющих микроорганизмов. Полученные в ходе настоящей работы результаты могут служить основой для дальнейших микробиологических мониторинговых наблюдений в данном регионе. Результаты анализа сезонной динамики УВ-окисляющей активности гетеротрофных бактерий литорали Кольского залива могут быть применены для расчета максимально допустимых нагрузок на данную водную экосистему и для учета вклада микроорганизмов в процессы естественного очищения литорали северных морей от нефтяного загрязнения. Разработаны практические рекомендации по выявлению, определению и идентификации УВ-окисляющих микроорганизмов в воде открытых водоемов.
Апробация работы. Результаты исследований, проводимых с 1998 по настоящее время в рамках госбюджетных научно-исследовательских работ кафедры микробиологии Мурманского государственного технического университета, представлены в отчетах о научно-исследовательской работе во Всероссийском научно-техническом информационном центре (г. Москва, 1998-2006 гг.).
Основные положения диссертации докладывались и обсуждались в период с 1999 по 2006 гг, на:
Международном семинаре, посвященном памяти академика Е.М. Крепса "Адаптации животных и растений к условиям арктических морей (на уровне организма, популяции, экосистем)" (ММБИ КНЦРАН, Мурманск, Апатиты, 1999);
10-й и 11-й научно-технических конференциях МГТУ (Мурманск, 1999,2000);
Конференции молодых ученых ММБИ, посвященной 275-летию Российской Академии наук (Мурманск, 1999);
7-й международной выставке ИНРЫБПРОМ 2000 "Современные средства воспроизводства и использования водных биоресурсов" (Санкт-Петербург, 2000);
Международной научно-технической конференции, посвященной 70-летию основания Калининградского государственного технического университета (Калининград, 2000);
Международных конференциях "Вековые изменения морских экосистем Арктики. Климат, морской перигляциал, биопродуктивность" (ММБИ КНЦ РАН, Мурманск, 2000, 2001);
Научно-технической конференции молодых ученых и аспирантов МГТУ (Мурманск, 2001);
Всероссийской научно-технической конференции "Наука и образова-ние-2002" (Мурманск, 2002);
Международной научной конференции "Новые технологии в решении проблем сохранения биоразнообразия в водных экосистемах" (Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2002);
Всероссийской научно-технической конференции "Наука и образование" (МГТУ, Мурманск, 2002).
П. Всероссийской научно-технической конференции "Наука и образование" (МГТУ, Мурманск, 2003).
Молодёжная международная конференция «Экология-2003» (Институт экологических проблем Севера УрО РАН, Архангельск, 2003).
Труды Международного биотехнологического центра МГУ: «Биотехнология-охране окружающей среды» (Москва, Издательство «Спорт и культура», 2004).
Международная научно-техническая конференция (МГТУ, Мурманск, 2004).
Международная научно-практическая конференция "Динамика научных достижений - 2005" (Днепропетровск, Наука и просвещение, 2005).
Международная научно-техническая конференция (МГТУ, Мурманск, 2005).
Всероссийской научно-технической конференции "Наука и образование" (МГТУ, Мурманск, 2006).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 работ. Струїсгура и объем диссертации. Работа состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Общий объем - 232 страницы, 46 рисунков, 28 таблиц, 24 приложения. Список литературы содержит 285 источников, в том числе -117 иностранных.
Кольский залив в экологической и социально-экономической проблематике Баренц-региона
Начало микробиологических исследований в северных морях связано с именем врача Левина. Свои работы он выполнял в районе острова Медвежий, Шпицберген и Земля Короля Карла (Палибин, 1904) На их основании он утверждал, что микроскопическое население в обследованных районах весьма немногочисленно. Его выводы были опровергнуты исследованиями микробиолога Б.Л.Исаченко в 1909 - 1914 гг. (Теплинская, 1990). Из вод Кольского залива и открытых районов Баренцева моря он выделил значительное число микробных форм, с жизнедеятельностью которых связаны процессы круговорота азота и углерода (Исаченко, 1914). В 30-е годы в экспедициях на ледоколе «Седов» и на ледоколе «Сибиряков» в Карском море Б.Л. Исаченко проводил исследования общего числа микроорганизмов (Исаченко, 1937 а, б). При этом им было обнаружено, что плотность бактерий в воде была наибольшей вблизи о. Шмидта, а в северовосточной части Карского моря наблюдаются лишь единичные клетки в том же объеме воды. Малое число бактерий в воде, обнаруженное Б.Л.Исаченко, объяснялось несовершенством применяемого им метода разливок (Родина, 1965).
B.C. Буткевич (1928, 1932, 1938, 1958) расширил район микробиологических исследований, начатых Б.Л.Исаченко в Баренцевом море. В,С. Буткевич применял для этих целей метод прямого счета клеток микроорганизмов, разработанный А.С. Разумовым (1932, 1962), поэтому им были получены более точные сведения о численности бактерий в воде северных морей. Метод, разработанный А.С. Разумовым, и сейчас используется при определении общей численности, биомассы и продукции бактериопланктона (Романенко, Кузнецов, 1974). B.C. Буткевич обнаружил, что определяющее значение в распределении сапрофитных бактерий имеет органическое вещество, концентрирующееся в районах соприкосновения и смешения разнородных вод (Бутксвич, 1932).
Район проведения исследований
Станция 1 находилась в районе Нового моста, который начинается со стороны Мурманска и протягивается на другую сторону залива. Со стороны города Мурманска неподалеку от этой станции находится устье реки Колы, несущей загрязнения различного характера с береговых предприятий области. Кроме того, неподалеку от Нового моста находится коллектор, выносящий канализационные бытовые стоки. Отбора проб воды для исследований проводился в 40 метрах от берега.
Ст. 2 в районе бухты Белокаменки располагалась примерно на середине залива. Она удалена от густонаселенных пунктов и находится на противоположенном берегу от промышленного центра - города Мурманска. Ст. 2, в отличие от ст. 1, находится под определяющим влиянием течения морских вод, поступающих из Баренцева моря. Для нее характерна более высокая соленость (до 35 %о) и невысокая температура воды (среднегодовое значение составляет 5,8С). Литораль бухты Белокаменки отличается обилием произрастающих здесь разнообразных видов макрофитов. Место отбора проб воды для исследований находилось в 100 метрах от берега.
Существенно отличались эти акватории и по некоторым микробиологическим исследованиям. Ранее было установлено (Богданова, 2003), что на ст. 1 преобладают палочковидные, преимущественно грам отри дательные микроорганизмы. Для более чистой ст. 2 характерно доминирование в бактериальных сообществах кокковидных, чаще грам положительных бактерий.
Гидрохимические показатели
Программа работ включала:
-определение концентраций УВ и биогенных элементов (общего азота и общего фосфора) в местах отбора проб для микробиологического анализа;
- определение ОЧБ, численности бактерий отдельных физиологических групп - евтрофов, олиготрофов и УВ-окисляющих бактерий в водной толще и на поверхности макроводорослей;
-определение УВ-окисляющей активности гетеротрофных бактерий радиоуглеродным методом в водной толще и в гуще макроводорослей.
3.1. Гидрохимические показатели Важную роль для окисления микроорганизмами НУ играет наличие биогенных элементов в водной среде. Известно, что для полного окисления 1 мг нефти требуется 4 мг нитратов (ZoBell, 1964), фосфора надо примерно на порядок меньше. Наши исследования показали, что по содержанию фосфатов и азота, который присутствовал в виде нитратов и нитритов, не наблюдается существенных отличий между обеими станциями (табл. 3.1; прил. 3).
По сравнению с показателями концентрации фосфатов по Кольскому заливу по состоянию за 1997 год (в пределах 0,02-0,08 мг/л) наши показатели находятся ближе к минимальным значениям (0,018 - 0,019 мг/л). Содержание нитратов и нитритов по результатам наших исследований оказалось выше (нитраты 0,077 - 0,078 мг/л, нитриты 0,005 мг/л) по сравнению с данными за 1997 год (нитраты 0,04-0,06 мг/л, нитриты 0,001 мг/л). Исходя из этих данных, можно предполагать, что концентрации нитратов на исследованых станциях могут быть фактором, лимитирующим скорость биодеградации НУ.
